Un modèle immunologique pour la transplantation héterotopique de cellules cardiaques et cardiaques chez les rats

Les modèles de transplantation sont des outils précieux pour la recherche immunologique qui nécessitent souvent une expertise chirurgicale. Ici, nous présentons une approche faisable pour la transplantation hétérotopique de cellules cardiaques et cardiaques de cellules de muscle chez les rats. En mettant en évidence et en simplifiant toutes les étapes cruciales de notre modèle, les chercheurs qui n’ont pas d’expérience chirurgicale devraient être en mesure de maîtriser ce modèle dans un délai raisonnable.

Les deux modèles de transplantation fournissent des informations précieuses sur les mécanismes de tolérance et de rejet et peuvent être appliqués chez diverses espèces. Nous avons beaucoup d’expérience dans l’enseignement de ce modèle à des personnes sans formation chirurgicale préalable. Après avoir appris les étapes cruciales, nous conseils la patience et la pratique suffisante avec les animaux décédés.

Pour l’explantation cardiaque du donneur, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez l’animal donneur de rat anesthésié de sept à 22 semaines, appliquez le lubrifiant pour les yeux et utilisez des tondeuses mécaniques pour enlever la fourrure abdominale et thoracique. Placez le rat en position supine sur une base chauffante et fixez les membres à la base de la table d’opération avec des bandes élastiques. Désinfectez la peau exposée avec 70% d’éthanol et effectuez une laparotomie médiane.

Insérez des rétracteurs dans l’incision et utilisez des cotons-tiges stérilisés pour mobiliser l’intestin vers le côté gauche du donneur pour exposer le cava vena inférieur. Ensuite, perforer le cava vena inférieur pour permettre l’injection intraveineuse de 500 unités internationales d’héparine dissoutes dans un millilitre de solution saline isotonique glacée. Arrêter le saignement sur le site perforé après la rétractation de l’aiguille par compression légère à l’aide d’un coton-tige.

Incisez le diaphragme, effectuez une thoracotomie latérale des deux côtés du donneur et épinglez la paroi thorax. Retirer le péricarde et le nerf vagal par préparation émoussée à l’aide de deux supports à micro-aiguilles. Pour l’exsanguination, transect les vaisseaux abdominaux et insérer la branche émoussée d’une sonde pointé ciseaux dans le sinus péricardique transversal.

Utilisez une compresse pour disséquer l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire aussi distally que possible sous la traction caudale légère du coeur. Placez une seule ligature 5-0 autour de la veine supérieure et inférieure cava et les veines pulmonaires et serrer la ligature étape-sage aussi dorsalement que possible. Couper le tissu dorsal à la ligature et extraire le cœur.

Pour parcourir le cœur explanté, utilisez une canule de calibre 18 à partir d’un cathéter intraveineux pour rincer 30 millilitres de solution saline isotonique glacée complétée par 1000 unités internationales d’héparine par l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire avant de placer le cœur dans un tube de 15 millilitres de solution saline sur la glace. Après avoir préparé le rat receveur de 10 à 14 semaines comme il vient de le démontrer, mobilisez les intestins vers le côté supérieur gauche du receveur sur une compresse chaude et mouillée. Et ajuster le microscope chirurgical ou une alternative suffisante.

Après avoir mobilisé respectivement le du duodénoum et le jejunum proximal, en utilisant un grossissement complet de cinq à sept, utilisez des cotons-tiges et une dissection émoussée pour exposer l’aorte abdominale et le cava de vena inférieur. À l’aide de deux porte-aiguilles micro pour élever les vaisseaux abdominaux sans blesser les veines lombaires, placez une pince vasculaire Cooley sur les vaisseaux. Utilisez une canule arquée de calibre 27 de 30 à 45 degrés pour percer les vaisseaux abdominaux.

Et utilisez des ciseaux Potts pour agrandir le site de perforation en une incision longitudinale qui correspond à la taille du lumen des vaisseaux donneurs. Pour enlever les caillots et prévenir la thrombose postopératoire, perfuser les vaisseaux avec de la solution saline et placer la greffe dans le situs. Utilisation de deux simples interrompus 8-0 sutures non résorbables monofilament, fixer l’aorte ascendante du donneur à l’aorte abdominale receveur aux coins crâniens et caudals de l’incision longitudinale.

Pour anastomoser l’aorte ascendante du donneur avec l’aorte abdominale du receveur placer la greffe à droite des vaisseaux receveurs tout en effectuant la première moitié de l’anastomose avec une course 8-0 suture monofilament. Placez ensuite la greffe à gauche des vaisseaux receveurs et effectuez la deuxième moitié de l’anastomose. Fixer l’artère pulmonaire du donneur au cava vena inférieur de la même manière avec deux nœuds d’angle aux coins crâniens et caudales.

Après avoir fixé le vaisseau donneur avec des nœuds à chaque coin, placez un point de l’extérieur à l’intérieur du navire pour exécuter une anastomose intraluminale pendant la première moitié de l’anastomose. Avant de l’adage de la suture, placez un autre point de l’intérieur vers l’extérieur. Pour éviter l’embolie périphérique après avoir terminé la deuxième moitié de l’anastomose, rincer l’anastomose avec de la solution saline avant de resserrer le nœud de la deuxième moitié de l’anastomose.

Placez une gaze hémostatique autour des deux anastomoses et relâchez soigneusement la pince vasculaire Cooley pour permettre la reperfusion de greffe. Gestion de tout saignement avec compression légère et coton-tige stérilisé. Après environ 60 secondes, le cœur devrait commencer à battre.

Remplacez soigneusement les intestins et fermez le fascia abdominal et la peau par des sutures continues séparées de fonctionnement de polyfilament 3-0. Au moment expérimental approprié, récoltez un cœur de rat donneur tel que démontré et utilisez un scalpel stérile ou des ciseaux stériles pour déchiqueter le cœur en fragments de trois par trois millimètres. Digérer les morceaux en 20 millilitres de culture moyenne complétée par 0,5 milligramme par millilitre de collagène pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de la digestion, ajouter le tissu à un tamis à gros pores, tout en enlevant le milieu de culture. Ajouter de cinq à 10 millilitres de solution saline isotonique et filtrer le lisier tissulaire à travers le tamis. Et après avoir centrifugé la suspension cellulaire deux fois, filtrez-la à travers une passoire à cellules de 40 micromètres.

Rincer la passoire avec cinq à 10 millilitres de solution saline isotonique pour recueillir les cellules restantes. Et après centrifugation, résuspendez les cellules cardiaques isolées de rat dans la solution saline à une concentration de cinq fois 10 aux cinquièmes cellules par millilitre. Chargez une seringue d’un millilitre avec la solution cellulaire et placez l’animal receveur anesthésié dans une position latérale avec l’oreille cible face vers le haut.

Fixez l’oreille avec un doigt et du ruban adhésif à double face, et utilisez une canule de calibre 27 pour injecter sous-cutanément 20 microlitres de solution de cellules musculaires cardiaques près des vaisseaux capillaires visuels dans l’oreille du receveur. Après la période d’observation expérimentale appropriée, extraire les ganglions lymphatiques cervicaux drainants et effectuer les analyses d’intérêt appropriées en aval. Les greffes syngéniques ont survécu jusqu’à 100 jours sans signes d’échec de greffe.

La combinaison donneur-receveur spécifique peut entraîner différentes vitesses de rejet hétérotopique de transplantation cardiaque. Les sections cryostatiques des cœurs rejetés révèlent une infiltration accrue des cellules effectrices immunitaires, tandis que les greffes syngéniques sont en grande partie exemptes de cellules immunitaires. La lymphadenectomy cervicale et les essais de restimulation des cellules drainantes de ganglion lymphatique après injection orale de cellules de muscle cardiaques révèlent des réponses immunisées spécifiques de tension distinctes vers le tissu cardiaque hétérotopique dans les destinataires allogéniques de greffe, justifiant d’autres analyses immunologiques telles que le profilage de cytokine.

Manipulez soigneusement les vaisseaux lors de l’insertion et de l’extraction de l’aiguille. Ne mettez pas trop d’attention sur les sutures pour prévenir la sténose. Ne placez pas trop de points de suture pour chaque anastomose.