Name: Identification des contacts Enhancer-Promoteur dans les corps embryonnaires par capture quantitative de conformation des chromosomes (4C) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Découvrez la capture quantitative de conformation des chromosomes (4C) pour identifier les contacts enhancer-promoteur dans les corps embryonnaires dérivés de cellules souches embryonnaires. Cette méthode permet d'analyser les interactions chromatiniennes pendant la différenciation cellulaire.

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Nous tenons à remercier F. Le Dily, R. Stadhouders et les membres du laboratoire Graf pour leurs conseils et leurs discussions. G.S. a été soutenu par une bourse Marie Sklodowska-Curie (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T par une bourse postdoctorale Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Ces travaux ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche dans le cadre du7e programme-cadre FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, accord de subvention 609989 à T.G.), le Ministère espagnol de l’économie, de l’industrie et de la compétitivité (MEIC) au partenariat EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 et le Programme général de Catalunya.

1. Génération de corps embryonnaire à partir de cellules souches embryonnaires de souris
<ol><li>Préparer le milieu de culture sans sérum mESC : DMEM/F12 et milieu neurobasal mélangés à un rapport de 1:1. Le milieu de culture est complété par une solution d’acides aminés non essentiels MEM (1x), du pyruvate de sodium (1 mM), de la L-glutamine (2 mM), de la pénicilline-streptomycine (100 U/mL), du bêta-mercaptoethanol (50 M), suppléments N2 et B27 (1x), PD0325901 (1 M), CHIR99021 (3 M) et facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) (1 000 U/mL).</li>
	<li>Préparer le milieu de différenciation EB : DMEM complété par un sérum bovin fœtal de 10 % (FBS), des acides aminés NON essentiels MEM (1x), du pyruvate de sodium (1 mM), de la L-glutamine (2 mM), de la pénicilline-streptomycine (100 U/mL), du bêta-mercaptoethanol (50 MM).</li>
	<li>Culture mESC sur des plats en plastique de 10 cm précoatés avec 0,1% (w/v) gélatine dans le milieu sans sérum de culture mESC.</li>
	<li>Lorsque les MESC atteignent 60 % de confluence, retirez le milieu de la culture et lavez doucement 1x avec 2 ml de PBS stérilisé.</li>
	<li>Retirer le PBS complètement et ajouter 2 ml de milieu de décollement cellulaire. Incuber le plat de culture à 37 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Inactiver la réaction en ajoutant 8 ml de milieu de différenciation EB dans le plat.</li>
	<li>Dissocier les colonies du CSE en faisant monter et descendre de 15 à 20 fois pour obtenir une suspension à cellule unique.</li>
	<li>Centrifuge les cellules à 300 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min et enlevez soigneusement le supernatant.</li>
	<li>Comptez les cellules (p. ex., à l’aide d’un hémocytomètre).</li>
	<li>Résuspendez la pastille cellulaire avec milieu de différenciation EB et ajustez la concentration à 2 x 104 cellules/mL.</li>
	<li>Inverser le couvercle d’un plat de culture de 15 cm et utiliser une pipette multicanal de 200 l pour déposer 20 gouttes de cellules résinocypendées (400 cellules/gouttes) sur le couvercle.</li>
	<li>Inverser le couvercle soigneusement sur la chambre inférieure et incuber le plat avec des gouttes suspendues à 37 oC avec 5% de CO2 et 95% d’humidité pendant 3 jours.</li>
	<li>Recueillir les EB en lavant doucement le couvercle avec 10 ml de PBS et transférer la suspension contenant eb à un tube en plastique de 50 ml.</li>
	<li>Placez le tube à RT pendant 30 min, de sorte que les EB couleront au fond par gravité. Retirez soigneusement le supernatant.</li>
	<li>Résuspendez doucement les EB avec 10 ml de milieu de différenciation d’EB frais et transférez-les à un plat Bactériologique Petri de 10 cm.</li>
	<li>Vérifiez la formation EB 3-6 jours plus tard à l’aide d’un microscope inversé. Les EB générés doivent être de taille ronde et homogène.</li>
	<li>Incuber les cultures à 37 oC avec 5% de CO2 et 95% d’humidité. Les EB continueront de se différencier en trois couches germinales et peuvent être collectées à divers moments pour analyse.</li>
</ol>2. Dissociation des EB
<ol><li>Recueillir les EB de deux à trois plats de 10 cm dans un tube en plastique de 50 ml. Centrifuge les EBs à 300 x g à RT pendant 5 min, puis retirez soigneusement le supernatant.</li>
	<li>Resuspendez les EB avec 10 ml de PBS. Centrifuge EBs à 300 x g à RT pendant 3 min et enlever le supernatant.</li>
	<li>Ajouter 2 ml de trypsin-EDTA (0,25 %) à la granule et incuber le tube à 37 oC pendant 15 min. Pipette de haut en bas toutes les 3 minutes pour obtenir une suspension à cellule unique.</li>
	<li>Ajouter 8 ml de milieu de différenciation EB pour arrêter la réaction de trypsine. Vérifiez la dissociation EB sous le microscope et comptez les cellules.</li>
</ol>3. Fixation
<ol><li>Résuspendez les cellules dans le milieu frais de culture EB à 1 x 106 cellules/mL. Pour un tube de 50 ml, utilisez un maximum de 4,5 x 107 cellules dans 45 ml de moyenne.</li>
	<li>Ajouter le paraformaldéhyde d’un stock de 37 % (pas plus de 6 mois) à une concentration finale de 1 %. CAUTION : Suivez les règlements appropriés en matière de santé et de sécurité tout en manipulant le paraformaldéhyde parce qu’il s’agit d’un produit chimique dangereux.</li>
	<li>Incuber pendant 10 min à RT en rotation.</li>
	<li>Étequez le formaldéhyde en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 0,125 M.</li>
	<li>Incuber pendant 5 minutes à RT en rotation.</li>
	<li>Transférer les cellules fixes sur la glace et garder le froid à 4 oC à partir de maintenant.</li>
	<li>Pellet les cellules à 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse réfrigérée.</li>
	<li>Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans PBS froid (1 ml pour 5 x 106 cellules), puis transférez-les à 1,5 mL tubes de verrouillage de sécurité.</li>
	<li>Pelletez les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 oC, jetez le supernatant et congelez les granulés dans de l’azote liquide. Conserver à -80 oC ou procéder au protocole ci-dessous.</li>
</ol>4. Analyse cellulaire et enzyme de restriction digest
<ol><li>Réutilisez délicatement la granule cellulaire dans 0,25 ml de tampon de lyse froide fraîchement préparée (10 mM Tris-HCl pH - 8,0, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA630 et 1x inhibiteurs de protéase) par 2-5 x 106 cellules. Pour préparer 5 ml de tampon de lyse, voir le tableau 1.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 15 minutes sur la glace.</li>
	<li>Centrifugeuse à 1 000 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et gardez la boulette, qui contient les noyaux.</li>
	<li>Laver les noyaux granulés avec 500 lil de tampon de lyse froide.</li>
	<li>Réutilisez délicatement la granule dans un tube de 1,5 mL avec 50 L de SDS de 0,5 % en tampon 1x 2, puis incuber le tube dans un bloc chauffant à 62 oC pendant 10 min.</li>
	<li>Retirer les tubes du bloc chauffant et ajouter 170 l de tampon de digestion contenant 25 L de triton X-100 à 10% pour étancher le SDS. Bien mélanger en tuyautant, en évitant la mousse excessive.</li>
	<li>Incuber à 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 25 L de tampon de digestion, mélanger en inversant, et prendre 8 L comme un contrôle non digéré. Maintenez l’échantillon de contrôle non digéré à -20 oC. Ajouter 100 enzymes de restriction U MboI (4 ll d’un stock de 25 U/L) aux noyaux restants et digérer la chromatine pendant 2 h à 37 oC en rotation. Ajouter un autre aliquot de 100 U de MboI et incuber pour un supplément de 2 h.</li>
	<li>Ajouter 100 autres U de MboI et incuber sous rotation pendant la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Le lendemain, ajouter 100 U de MboI et incuber pendant 3 h à 37 oC sous rotation.</li>
	<li>Prenez 8 l comme échantillon de contrôle digéré. Échantillons de contrôle digérés en de décalage et les échantillons de contrôle non digérés de l’étape 4.8 en ajoutant 80 l de tampon TE (10 mM Tris pH - 8, 1 mM EDTA) et 10 'L de proteinase K (10 mg/mL). Incuber à 65 oC pour 1 h.</li>
	<li>Exécuter des aliquots de 20 L sur un gel de 0,6% pour vérifier l’efficacité de la digestion. Les digestions réussies montrent principalement des fragments dans la gamme 3.0-0.5 kb.</li>
</ol>5. Ligation de proximité et renversement de lien croisé
<ol><li>Incuber les échantillons MboI-digérés à 65 oC dans un bloc de chauffage pendant 20 min pour inactiver MboI, puis refroidir à RT.</li>
	<li>Centrifugez les tubes pendant 5 min à 1 000 x g à RT, retirez le supernatant et dissolvez la boulette en 200 L de tampon de ligase fraîche.</li>
	<li>Ajoutez 1 000 L du mélange principal de ligature à chaque échantillon. Pour préparer 1 000 L du mélange principal de ligation, voir le tableau 2.</li>
	<li>Mélanger en inversant et incuber à RT toute la nuit avec rotation lente (9 tr/min).</li>
	<li>Éliminez les résidus d’ARN et de protéines en ajoutant 100 l de proteinase K (10 mg/mL) et 10 l de RNase A (10 mg/mL). Incuber des échantillons à 55 oC pendant 45-60 min.</li>
	<li>Continuer à incuber des échantillons à 65 oC pour un supplément de 4 h.</li>
</ol>6. Tonte d’ADN et sélection de taille
<ol><li>Tubes frais à RT.</li>
	<li>Centrifugeuse pour 5 min à 1 000 x g à 4 oC.</li>
	<li>Divisez l’échantillon en trois aliquots de 400 L en tubes de 2 ml et ajoutez 2 l de glycogène (20 mg/m), 40 l d’acétate de sodium (3 M, pH et 5,2) et 2,5x volumes (1 ml) d’éthanol de 100 % dans chaque tube. Mélanger en inversant et incuber à -80 oC pendant 45-60 min.</li>
	<li>Centrifugeuse à 16 000 x g à 4 oC pendant 25 min. Garder les tubes sur la glace après avoir filé et retirer soigneusement le supernatant par tuyauterie.</li>
	<li>Laver les granulés d’ADN en résumant dans 800 l 'L de 70% d’éthanol. Centrifugeuse à 16 000 x g à 4 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et effectuer le lavage une fois de plus avec 800 L d’éthanol de 70%.</li>
	<li>Dissoudre la granule dans 130 L de tampon Tris 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8) et incuber à 37 oC pendant 15 minutes pour dissoudre complètement l’ADN. Si nécessaire, utilisez le tuyauterie pour réanimer tout précipité.</li>
	<li>Mesurer le rendement de l’ADN; On peut s’attendre à 2,5 à 5 g de chromatine pour 1 x 106 cellules. Vérifiez la ligature en exécutant 200 ng du produit 3C sur un gel d’agarose de 0,6 %. Les ligatures réussies montrent surtout des fragments d’ADN .gt; 3 kb. Conservez les échantillons à -20 oC.</li>
	<li>Diluer un échantillon dans un tube de 0,65 mL adapté à la sonication à 10 ng/L dans 100 L de volume tampon Tris de 1x (1 g par tube). La quantité standard utilisée pour la préparation de la bibliothèque est de 3 g, alors effectuez la sonication dans trois tubes distincts si nécessaire.</li>
	<li>L’ADN de cisaillement à une taille de 150-700 bp (moyenne de 400-500 bp) en utilisant les paramètres suivants sur le sonicator: Cycles: 6-8 de 20 s sur -60 s off. Cela devrait rendre l’ADN adapté à la préparation de la bibliothèque de séquençage à haut débit à l’aide de séquenceurs Illumina.</li>
	<li>Transférer l’ADN cisaillement dans un nouveau tube de verrouillage sûr normal. Mise en commun de plusieurs sonications à partir du même échantillon.</li>
	<li>Réchauffez une bouteille de perles de purification de l’ADN à RT. Désormais, utilisez de faibles conseils de fixation.</li>
	<li>Ajouter 1,8x volumes de perles au tube d’ADN et réutilisez-le doucement.</li>
	<li>Incubate à RT pour 5 min.</li>
	<li>Recueillir les perles avec une grille magnétique. Laver les perles 2x avec 1 mL d’éthanol fraîchement préparé à 80% tout en gardant les tubes dans la grille magnétique. REMARQUE : Retirez tout l’éthanol, y compris les gouttelettes résiduelles.</li>
	<li>A sec de l’air les perles brièvement (2-3 min) à RT. REMARQUE : Ne pas sécher les perles de plus de 5 min. Cela diminuera le rendement de l’ADN.</li>
	<li>Réutilisez les perles avec 90 L de tampon Tris 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8) pour éléger l’ADN.</li>
	<li>Mesurer le rendement de l’ADN et analyser un aliquot de 5 L sur un gel de 1,5 %. Il devrait y avoir très peu de perte par rapport au rendement de présonication.</li>
</ol>7. Préparation de la bibliothèque pour le séquençage
<ol><li>Ajoutez 15 L de mélange principal à partir du kit de préparation de la bibliothèque. Pour réparer les extrémités de l’ADN cisillé, combinez 10 L de tampon de réaction de réparation fin 10x et 5 L de mélange d’enzymes de réparation de fin.</li>
	<li>Incubate à RT pour 30 min.</li>
	<li>Ajouter 1,1 volume de perles de purification de l’ADN et résuspendez doucement.</li>
	<li>Incubate à RT pour 5 min.</li>
	<li>Recueillir les perles avec une grille magnétique. Laver les perles deux fois avec 1 ml d’éthanol fraîchement préparé à 80 % tout en gardant les tubes dans la grille magnétique. Retirer l’éthanol.</li>
	<li>Séchez les perles pendant 2-3 min à RT. Résuspendez les perles avec 42 L de tampon tris de 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8) pour exalter l’ADN.</li>
	<li>Ajouter 8 L de mélange principal dA-tailing à chaque échantillon. Pour préparer le mélange de maître dA-tailing, combinez 5 L de tampon de réaction dA-2 et 3 L de Klenow fragment exo moins.</li>
	<li>Incuber à 37 oC pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter le phosphatase alcalin intestinal de veau (CIP) à l’ADN de déphosphorylate.</li>
	<li>Incuber pendant 30 min à 37 oC, puis 60 min à 50 oC.</li>
	<li>Ajouter 1,1x volumes de perles de purification de l’ADN et résuspendez doucement.</li>
	<li>Incubate à RT pour 5 min.</li>
	<li>Recueillir les perles avec une grille magnétique. Laver les perles 2x avec 1 mL d’éthanol fraîchement préparé à 80% tout en gardant les tubes dans la grille magnétique.</li>
	<li>Séchez brièvement les perles (2-3 min) à RT. Résuspendent des perles avec 35 L de tampon Tris 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8) pour exalter l’ADN.</li>
	<li>Effectuez la réaction de ligature adaptateur. Utilisez des concentrations réduites d’adaptateur/de ligase comme mentionné dans le tableau 3.</li>
	<li>Incuber à 20 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 3 l 'L du mélange de glycosylase d’ADN uracil et de glycosylase d’ADN lyase endonuclease VII (par exemple, USER), mélanger par tuyauterie, et incuber à 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Augmenter le volume à 100 l avec de l’eau, faire bouillir 5 min à 96 oC, puis conserver les échantillons sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 1,1x volumes de perles de purification de l’ADN et résuspendez doucement.</li>
	<li>Incubate à RT pour 5 min.</li>
	<li>Recueillir les perles avec une grille magnétique. Laver les perles 2x avec 1 mL d’éthanol fraîchement préparé à 80% tout en gardant les tubes dans la grille magnétique.</li>
	<li>Séchez les perles pendant 2-3 min à RT. Résuspendez les perles avec 50 L de tampon tris de 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8) pour exalter l’ADN.</li>
</ol>8. Amplification et purification de bibliothèque d’interaction chromatine de 4C
<ol><li>Amplifier la bibliothèque 4C à l’aide de 10 L de bibliothèque pour effectuer le premier PCR. La configuration et le programme PCR peuvent être trouvés dans le tableau 4.</li>
	<li>Effectuez pcR imbriqué. La configuration et le programme PCR imbriqués se trouvent dans le tableau 5.</li>
	<li>Pool de produits PCR pour chaque bibliothèque et purifier avec une perle de purification de l’ADN 1.1x.</li>
	<li>Mesurer le rendement de l’ADN et analyser un aliquot de 5 L sur un gel de 1,5 %.</li>
	<li>Ajuster la concentration de la bibliothèque et séquencer la bibliothèque. Si elles sont indexées, les bibliothèques peuvent être mises en commun avant le séquençage.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode de culture de la chute suspendue n’a pas besoin de facteurs de croissance ou de cytokines supplémentaires et génère de façon reproductible des populations homogènes d’EB à partir d’un nombre prédéterminé de MESCs5. Ici, nous décrivons un protocole de 4C quantitatif adapté de l’approche UMI-4C pour quantifier le contact enhancer-promoteur des facteurs de transcription spécifiques de lignée dans le modèle de différenciation EB. Nous avons identifié des régions de chromatine qui contactent les promoteurs des gènes Pou5f1 et T d’une manière dynamique pendant la différenciation EB. Pou5f1 a été réduit pendant la différenciation EB et la fréquence de contact entre le promoteur Pou5f1 et son exhausteur distal a diminué. Inversement, T a été régulé pendant la différenciation EB et nous avons identifié trois exhausteurs pour lesquels les fréquences de contact avec leur promoteur sont diminuées(figure 3). Pour confirmer l’identification, un essai d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) de marque d’histone active H3K27ac peut être effectué24, comme cette marque d’histone a été montré pour être associé à l’activation de l’exhausteur et les exhausteurs perdent cette marque au cours de leur inactivation11.
Une technique standard 4C a été largement utilisée pour étudier le profil de contact chromatine de sites génomiques spécifiques25. Cependant, cette approche est difficile à interpréter quantitativement même après une normalisation étendue26,27,28 en raison des biais introduits par l’hétérogénéité de la taille du fragment de PCR et l’impossibilité de distinguer les doublons de PCR. Notre méthode quantitative 4C est en grande partie identique à la technique UMI-4C qui permet la quantification de molécules uniques à l’aide de la sonication et d’une étape PCR imbriquée-ligation-négociée pour contourner la limitation de l’approche 4C classique23. Cependant, contrairement à l’UMI-4C qui utilise des identificateurs moléculaires uniques, notre protocole quantitatif 4C permet la quantification de molécules uniques en fonction de la rupture spécifique de l’ADN produite par l’étape de sonication. Il rend notre protocole compatible avec les kits commerciaux de préparation de bibliothèque d’ADN, en respectant le besoin d’amorce avec des identificateurs moléculaires uniques.
Notre protocole comporte plusieurs étapes clés qui devraient être prises en considération. Comme dans la méthode 4C classique28, les facteurs critiques de notre protocole sont l’efficacité de la digestion et la ligature lors de la préparation des molécules 3C. Une faible efficacité de digestion/ligation peut réduire considérablement la complexité de l’interaction avec un fragment d’intérêt, ce qui entraîne une résolution réduite. Comme décrit précédemment23, une autre étape critique du protocole est la conception des amorces pour l’amplification de la bibliothèque. Les deuxièmes amorces de réaction PCR doivent être situées de 5 à 15 nt à partir du site de restriction interrogé. Dans une lecture de séquençage de 75 nt, cela permet au moins 40 nt gauche de la longueur de capture pour la cartographie. L’apprêt utilisé dans la première réaction PCR doit être conçu en amont de la deuxième amorce sans chevauchement et les deux devraient être suffisamment spécifiques pour assurer une amplification efficace de l’ADN. Pour le multiplexe, les amorces doivent être conçues indépendamment, en visant une température de fonte (Tm)de 60-65 oC. En outre, comme pour les autres techniques 3C, la résolution de la méthode quantitative 4C est déterminée par l’enzyme de restriction utilisée dans le protocole25. Ce protocole utilise une enzyme de restriction avec un site de reconnaissance de 4 bp, MboI. La résolution maximale avec cette enzyme est d’environ 500 bp, mais c’est très locus dépendant et rarement atteint. Une autre limitation est que les interactions qui se produisent entre les éléments situés dans le même fragment de restriction ne sont pas détectables. En outre, les interactions se produisant à une distance d’un site de restriction ne peuvent pas être distinguées de l’arrière-plan non digéré. L’utilisation d’une étape de remplissage avant la ligature pourrait permettre la détection de ces interactions.
Quantitative 4C est idéalement adapté pour interroger les contacts en chromatine des loci ciblés. Cependant, l’étape spécifique d’amplification de PCR limite le nombre de loci qui peuvent être étudiés simultanément. Une façon d’augmenter le nombre de loci ciblés est de multiplex les étapes PCR pour amplifier simultanément plusieurs cibles, mais cela nécessite la compatibilité des amorces utilisées et de tester chaque paire d’amorce avant la mise en œuvre. Si l’on souhaite des changements globaux de l’architecture de chromatine chez les promoteurs, des approches à l’échelle du génome telles que Hi-C, PC Hi-C ou HiChIP seraient plus appropriées29,30,31.

Chez la souris, la masse des cellules internes (ICM) d’embryons de 3,5 jours contient des cellules souches pluripotentes embryonnaires. L’ICM se développe également dans l’épiblaste au jour 4.5, générant des cellules d’ectoderm, de mésoderm, et d’endoderm, les trois principales couches de germes dans l’embryon. Bien que les cellules pluripotentes dans l’ICM n’existent que de façon transitoire in vivo, elles peuvent être capturées en culture par l’établissement de cellules souches embryonnaires de souris (MESC)1,2,3. Les MESC restent dans un état indiffélant et prolifèrent indéfiniment, mais sur des stimuli intrinsèques et extrinsèques, ils sont également capables de sortir de l’état de pluripotence et de générer des cellules des trois couches germinales développementales2,4. Fait intéressant, lorsqu’ils sont cultivés en suspension dans de petites gouttelettes, les MESC forment des agrégats tridimensionnels (c.-à-d., EB) qui se différencient en trois couches germinales5. L’essai de formation EB est un outil important pour étudier le processus de spécification de lignée précoce.
Pendant la spécification de lignée, les cellules de chaque couche germinale acquièrent un programme spécifique d’expression génique4. L’expression spatiotemporal précise des gènes est réglementée par divers éléments de réglementation cis-, y compris les promoteurs de base, exhausteurs, silencieux, et isolants6,7,8,9. Enhancers, segments d’ADN réglementaires couvrant généralement quelques centaines de paires de base, coordonnent l’expression génétique tissulaire8. Les exhausteurs sont activés ou réduits au silence par la liaison des facteurs de transcription et des cofacteurs qui régulent la structure locale de chromatine8,10. Les techniques couramment utilisées pour identifier les exhausteurs putatifs sont l’immunoprécipitation de chromatine à l’échelle du génome suivie du séquençage (ChIP-seq) et de l’essai pour la chromatine accessible à la transposase à l’aide de techniques de séquençage (ATAC-seq). Ainsi, les exhausteurs actifs sont caractérisés par des marques d’histone actives spécifiques et par l’accessibilité accrue de l’ADN local11,12,13,14. En outre, les exhausteurs de développement sont censés exiger une interaction physique avec leur promoteur cognate8,9. En effet, il a été démontré que les variantes et les suppressions d’exhausteurs qui perturbent les contacts enhancer-promoteur peuvent conduire à des malformations développementales15. Par conséquent, il est nécessaire de nouvelles techniques qui fournissent des informations supplémentaires pour l’identification des exhausteurs fonctionnels qui contrôlent l’expression des gènes du développement.
Depuis le développement de la technique de capture de conformation chromosomique (3C)16, la cartographie des contacts chromosomiques a été intensivement utilisée pour évaluer la distance physique entre les éléments réglementaires. Fait important, des variantes à haut débit de techniques 3C ont récemment été développées, fournissant différentes stratégies pour la fixation, la digestion, la ligature, et la récupération des contacts entre les fragments de chromatine17. Parmi eux, in situ Hi-C est devenu une technique populaire permettant le séquençage des produits de ligature 3C à l’échelle du génome18. Cependant, les coûts élevés de séquençage requis pour parvenir à une résolution adaptée à l’analyse des contacts enhancer-promoteur rendent cette technique peu pratique pour l’étude de loci spécifiques. Par conséquent, d’autres méthodes ont été développées pour analyser les loci ciblés à la résolutionsupérieure 19,20,21,22. L’une de ces méthodes, à savoir 4C, connue sous le nom de stratégie un contre tous, permet de détecter toutes les séquences qui contactent un site choisi comme point de vue. Cependant, un inconvénient de la technique standard 4C est le PCR inverse requis, qui amplifie des fragments de taille différente, favorisant les petits produits et la quantification biaisée après le séquençage à haut débit. Récemment, UMI-4C, une nouvelle variante de la technique 4C à l’aide d’identificateurs moléculaires uniques (UMI) a été développé pour le profilage de contact chromosomique quantitatif et ciblé qui contourne ce problème23. Cette approche utilise des coupeurs fréquents, une sonication et un protocole PCR imbriqué, impliquant ainsi l’amplification de fragments d’ADN avec une répartition de longueur relativement uniforme. Cette homogénéité réduit les biais dans le processus d’amplification des préférences PCR pour des séquences plus courtes et permet une récupération efficace et un comptage précis des molécules/fragments connectés à l’espace.
Ici, nous décrivons un protocole qui adapte la technique UMI-4C pour identifier et quantifier les contacts de chromatine entre les promoteurs et les exhausteurs des facteurs de transcription instructifs de lignée pendant la différenciation d’EB.

<table><tbody><tr><td>0,1 % de gélatine EmbryoMax</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td></td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>10136224</td><td>Purification 4C/ADN</td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico</td><td>Diagencode</td><td>B01060010</td><td>4C/sonication</td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td>4C</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0212</td><td>4C</td></tr><tr><td>cOmplete Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td>4C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>4C</td></tr><tr><td>ESGRO Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde (37 %)</td><td>Sigma</td><td>252549-25ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>GE17-1323-01</td><td>4C</td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>ThermoFischer</td><td>R0551</td><td>4C</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA polymérase</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>4C</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I3021-50ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td></td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td>4C</td></tr><tr><td>MEM acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>N2 supplément</td><td>Gibco</td><td>A1370701</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>NEBNext DNA Library prep</td><td>NEB</td><td>E6040</td><td>4C</td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 NEB</td><td></td><td>B7202S</td><td>4C/digestion</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1036</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td>4C</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 4</td><td>ThermoFischer</td><td>Q33238</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dosage</td><td>ThermoFischer</td><td>Q32851</td><td>4C</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer</td><td>EN0531</td><td>4C</td></tr><tr><td>Solution de pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Réactif de dissociation cellulaire</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>T4 Tampon de réaction ADN ligase</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>4C Tampon</td></tr> de <tr><td>réaction ADN ligase</td><td>T4 NEB</td><td>M0202M</td><td>4C</td></tr></tbody></table>

identification des contacts enhancer-promoteur dans les corps embryonnaires par capture quantitative de conformation des chromosomes (4c)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Pendant le développement des mammifères, les destins cellulaires sont déterminés par l’établissement de réseaux de réglementation qui définissent la spécificité, le moment et les modèles spatiaux de l’expression des gènes. Les corps embryonnaires (EB) dérivés des cellules souches pluripotentes ont été un modèle populaire pour étudier la différenciation des trois principales couches germinales et pour définir les circuits réglementaires pendant la spécification du destin cellulaire. Bien qu’il soit bien connu que les exhausteurs spécifiques aux tissus jouent un rôle important dans ces réseaux en interagissant avec les promoteurs, leur attribution à leurs gènes cibles pertinents demeure difficile. Pour ce faire, des approches quantitatives sont nécessaires pour étudier les contacts enhancer-promoteur et leur dynamique pendant le développement. Ici, nous avons adapté une méthode 4C pour définir les exhausteurs et leurs contacts avec les promoteurs cognate dans le modèle de différenciation EB. La méthode utilise fréquemment des enzymes de restriction de coupe, la sonication, et un protocole PCR imbriqué-négocié compatible avec les kits commerciaux de préparation de bibliothèque d’ADN. Par la suite, les bibliothèques 4C sont soumises à un séquençage à haut débit et analysées bioinformatement, permettant la détection et la quantification de toutes les séquences qui ont des contacts avec un promoteur choisi. Les données de séquençage qui en résultent peuvent également être utilisées pour obtenir des informations sur la dynamique des contacts enhancer-promoteur lors de la différenciation. La technique décrite pour le modèle de différenciation EB est facile à mettre en œuvre.

Six jours après l’intronisation de la différenciation esc DANS les gouttes suspendues, nous avons obtenu une population homogène d’EB qui ont été utilisés pour d’autres analyses(figure 1). Nous avons adapté la méthodeUMI-4C 23 pour quantifier l’interaction spécifique de chromatine chez les promoteurs de gènes spécifiques de lignée dans les EB24. Une vue d’ensemble schématique du protocole avec des gels de contrôle de la qualité représentatifs à différentes étapes est indiquée dans la figure 2A. Le premier contrôle de la qualité a été effectué pour déterminer l’efficacité de la digestion enzymatique de restriction MboI. Une digestion efficace a montré une taille fragment de moins de 3 kbp(figure 2B). Notez, la digestion de la chromatine mESC et EB était difficile et parfois résiduelle chromatine non digérée persistait. Le deuxième contrôle de la qualité a été effectué après la ligature pour vérifier que la plupart des fragments étaient maintenant 'gt; 3 kbp (figure 2B). Ensuite, des fragments de chromatine obtenus après la sonication ont été analysés par l’électrophoresèse de gel. Des fragments de 400 à 500 bp étaient attendus(figure 2B).
Après la déphosphorylation et la ligature adaptateur à extrémité unique, deux tours de PCR ont été exécutés pour amplifier les cibles d’intérêt. Une approche imbriquée a été utilisée pour concevoir un ensemble de deux amorces pour chaque locus. Cela a contribué à améliorer la spécificité. Chaque cible a été amplifiée séparément avec deux paires d’amorce différentes pour optimiser les conditions de PCR (c.-à-d. les paires d’amorce A et B pour les paires de locus et d’amorce Pou5f1 C et D pour le locus T, respectivement) et a entraîné un frottis d’ADN autour de 400 bp(figure 2C). Alternativement, le MULTIPLEx PCR a été exécuté pour amplifier les cibles A et C simultanément(figure 2D) et a donné lieu à une taille de fragment similaire après purification(figure 2D). Les amorces utilisées pour la préparation de la bibliothèque 4C (loci de Pou5f1 et T) peuvent être trouvées dans le tableau 6.
Pour l’analyse des données, les lectures brutes de séquençage ont d’abord été alignées par rapport au génome de la souris mm10 de réfutation, ont toutes été dupliquées, et des lectures de faible qualité (lt; 20) ont été supprimées. Pour chaque appât, les informations sur chaque fragment de restriction ont été obtenues en calculant le nombre de fragments de lecture, et un profil de contact brut a été obtenu. Ensuite, la région d’intérêt a été définie comme tous les fragments de restriction avec 2 kbp et 250 kbp distance à l’appât. La taille de chaque fragment de restriction a été augmentée en agrégeant séquentiellement les fragments de restriction adjacents pour lisser les profils jusqu’à ce qu’un seuil de 5 % du nombre total de contacts bruts soit atteint dans la région d’intérêt. Pour nous assurer que les répliques étaient intégrées et que les conditions étaient comparées, nous avons inclus à la fois des pentes et des interceptions aléatoires au niveau des fragments de restriction. Le profil moyen par condition et le changement de pli entre eux ont été tracés comme le montre la figure 3. Pendant la différenciation d’EB, les contacts entre les exhausteurs et le promoteur du gène de pluripotence Pou5f1 ont diminué, tandis que les contacts d’exhausteur-promoteur du facteur de transcription instructif de lignée de méendoderm T ont augmenté(figure 3), fournissant des aperçus fonctionnels au sujet de ces exhausteurs développementaux.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig1.jpg"> Figure 1 : Images représentatives du MESC et des corps embryonnaires dérivés. Jour 0 mESC cultivé dans des conditions sans sérum (à gauche) et le jour homogène 6 EBs (à droite) observé par un microscope inversé. Barre d’échelle à 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig2.jpg"> Figure 2 : flux de travail 4C et images représentatives des principales étapes du protocole. (A) Flux de travail schématique du 4C quantitatif. RS - site de restriction; États-Unis et en amont; DS en aval; UP - amorce universelle; D - la distance entre RS et DS devrait idéalement être de 5-15 bp. (B) Exemples de chromatine digérée MboI (I), en chromatine ligatée en noyau (II), et chromatine sonicée (III). Les chiffres sur la gauche indiquent les tailles d’ADN déterminées par l’échelle d’ADN courir pour chaque échantillon. (C) Exemples d’amplification PCR aux deux loci : Pou5f1 (amorces A et B) et T (amorce C et D). (D) Exemples d’amplification de PCR multiplex chez Pou5f1 et T loci à l’aide d’amorces A et C. ES - cellules souches embryonnaires; EB et corps embryonnaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig3.jpg"> Figure 3 : Exemples de profils 4C. Profils quantitatifs 4C pour les appâts situés sur les promoteurs de gènes Pou5f1 et T analysés dans les MESC et jour 6 EBS. Le panneau supérieur montre des parcelles de contacts moyens générés à partir de deux répliques biologiques indépendantes; le panneau inférieur montre le changement moyen de pli de contact du jour 6 EBS par rapport aux MESC (moyenne des deux répliques). Les boîtes bleu clair indiquent l’emplacement des exhausteurs avec des changements dynamiques pendant la différenciation. Figure adaptée de Tian et coll.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Pour 5mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH8.0</td>
			<td>50 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>5M NaCl</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% Igepal CA630</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>50x Roche inhibiteurs complets de protéase</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau MilliQ</td>
			<td>4,74 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Tampon Lysis.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Pour 1000 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau MilliQ</td>
			<td>869 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X NEB T4 ADN Ligase Buffer</td>
			<td>120 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumin de sérum bovin de 20 mg/mL</td>
			<td>6 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>2000 U/L T4 ADN Ligase</td>
			<td>5 ll</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Préparation de mélange principal de Ligation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Pour 15 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>5X Quick Ligation Reaction Buffer</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptateur NEBNext</td>
			<td>3 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligase d’ADN T4 rapide</td>
			<td>2 l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Réaction de ligature d’adaptateur.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Configuration PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptateur ligated bibliothèque-sur-morts</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau de qualité PCR</td>
			<td>20,25 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 M Cible amorce spécifique</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce de l’indice NEB de 10 M</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herculase II 5X tampon</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 MM DNTPs</td>
			<td>1,25 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polymérase Herculase II</td>
			<td>1 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>50 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Programme PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 1 : 98 oC - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 2 : 98 oC - 20s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 3 : 65 'C - 30s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 4 : 72 'C - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 5 : passez à l’étape 2 pour faire un total de 15-18 cycles</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 6 : 72 oC - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 7 : 4 oC - tenir</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Amplification de bibliothèque d’interaction chromatine 4C, premier PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Configuration PCR imbriquée</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fragment d’ADN du premier PCR</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau de qualité PCR</td>
			<td>20,25 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce illuminante de 10 M</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce éclairante P7 Illumina de 10 M</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Herculase II 5X tampon</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 MM DNTPs</td>
			<td>1,25 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polymérase Herculase II</td>
			<td>1 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>50 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Programme PCR imbriqué</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 1 : 98 oC - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 2 : 98 oC - 20s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 3 : 65 'C - 30s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 4 : 72 'C - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 5 : passez à l’étape 2 pour faire un total de 15-18 cycles</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 6 : 72 oC - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape 7 : 4 oC - tenir</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5 : Amplification de bibliothèque d’interaction de 4C de chromatine, PCR imbriqué.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Séquence (5'-3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-A</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCCCGCGATCTACACTCTCCCTACGAGACG CTCTTCCGATCTTCTTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>États-Unis-Oct4-A</td>
			<td>TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-B</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCCCGCGATCTACACTCTCCCTACGAGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGGGAGGGGCGCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>États-Unis-Oct4-B</td>
			<td>ACCAGGGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-C</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCCCGCGATCTACACTCTCCCTACGAGACG CTCTTCCGATCCTGGGTCCCTGCACATTCGACCCAAAGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>États-Unis-T-C</td>
			<td>GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-D</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCCCGCGATCTACACTCTCCCTACGAGACG CTCTTCCGATCTGGCTGGAGAGGTCAAGGAGACCGGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>États-Unis-T-D</td>
			<td>GCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC</td>
		</tr>
<tr>
<td>UP-4C</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i1</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i2</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i3</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i4</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 6 : Apprêts utilisés pour la préparation de la bibliothèque 4C.

Nous rapportons l’application de la capture quantitative de conformation de chromosome suivie du séquençage à haut débit dans les corps embryonnaires générés par les cellules souches embryonnaires. Cette technique permet d’identifier et de quantifier les contacts entre les exhausteurs putatifs et les régions promoteurs d’un gène donné lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires.

Identification des contacts Enhancer-Promoteur dans les corps embryonnaires par capture quantitative de conformation des chromosomes (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

La régulation spatiotemporale précise des gènes est contrôlée par divers éléments cis-réglementaires qui interagissent entre eux. Notre protocole permet d’interroger quantitativement les contacts chromatineux de certains loci tels que les promoteurs. Cette technique nous permet d’identifier et de quantifier simultanément les fréquences d’interaction entre les différents éléments réglementaires.Pour générer des corps embryoïdes, commencez par la culture des cellules souches embryonnaires de souris à 60% de confluence. Retirez ensuite le milieu de culture et lavez-le deux fois avec deux millilitres de PBS stérilisé. Retirez complètement le PBS et ajoutez deux millilitres de milieu de détachement cellulaire.Incuber le plat de culture à 37 degrés Celsius. Après l’incubation pendant cinq minutes, ajouter huit millilitres de milieu de différenciation EB au plat. Pour dissocier les colonies du MESC pour obtenir une suspension à cellule unique, pipette le milieu de haut en bas 15 à 20 fois, et transférer la suspension dans un tube de 10 millilitres.Centrifuger les cellules à 300 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez ensuite soigneusement le surnatant. Après avoir compté les cellules, résuspendez la pastille cellulaire avec le milieu de différenciation EB.Inverser le couvercle d’un plat de culture de 15 centimètres. À l’aide d’une pipette multicanal de 200 microlitres, déposer des gouttes de 20 microlitres de cellules résuspendues sur le couvercle. Inversez soigneusement le couvercle et placez-le sur la partie inférieure du plat de culture.Incuber le plat avec les gouttes suspendues pendant trois jours. Pour recueillir les cellules après l’incubation, lavez doucement le couvercle avec 10 millilitres de PBS. Transférez le PBS, qui contiendra les EBs, dans un tube en plastique de 50 millilitres.Après avoir laissé reposer le tube pendant 30 minutes à température ambiante, retirez soigneusement le surnatant. Les ER seront laissés au bas du tube. Resuspendez doucement les ER en 10 millilitres de milieu de différenciation EB frais.Transférer la suspension dans une boîte de Pétri bactériologique de 10 centimètres. Trois à six jours plus tard, utilisez un microscope inversé pour vérifier la formation d’EB. Les ER doivent avoir une taille ronde et homogène.Recueillir les ER de deux ou trois plats de 10 centimètres dans un tube en plastique de 50 millilitres. Centrifuger les ER à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le supernatant et réutilisez les ER en 10 millilitres de PBS.Centrifugez les EBs à 300 fois g à température ambiante à nouveau, cette fois pendant trois minutes. Retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA à la pastille. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Pendant l’incubation, pipette de haut en bas toutes les trois minutes pour obtenir une suspension à cellule unique. Pour arrêter la réaction de trypsine, ajoutez huit millilitres de milieu de différenciation EB. Après avoir réutilisé les cellules dans le milieu eb frais, ajouter le paraformaldéhyde à une concentration finale de 1% Incuber les cellules pendant 10 minutes à température ambiante sous rotation.Étancher le formaldéhyde en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 0,125 molaire. Terminer le processus de fixation tel que décrit dans le manuscrit, puis casser-congeler les granulés cellulaires dans l’azote liquide. Resuspendez doucement la pastille cellulaire dans un tampon de lyse glacée fraîchement préparé et placez le tube sur la glace.Après 15 minutes, centrifuger les cellules à 1000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et lavez la pastille avec 500 microlitres de tampon de lyse froide. Resuspendez la pastille dans un tube de 1,5 millilitre avec 50 microlitres de 0,5%SDS en 1x tampon deux, et placez le tube dans un bloc chauffant à 62 degrés Celsius.Après 10 minutes, retirer le tube du bloc chauffant et ajouter le tampon de digestion. Bien mélanger en pipetage, en évitant la mousse excessive, et incuber le tube à 37 degrés Celsius. Pour assurer une digestion efficace des enzymes de restriction, dans ce protocole, nous avons inclus une étape répétitive de digestion.C’est pourquoi il est également important de bien résuser les noyaux dans le tampon de digestion. Ajouter 25 autres microlitres de tampon de digestion, mélanger en inversant, et prendre huit microlitres comme un contrôle non digéré. Conservez l’échantillon de contrôle non digéré à un taux négatif de 20 degrés Celsius.Ensuite, vous ajouterez plusieurs aliquots de l’enzyme de restriction Mbol, incubant à 37 degrés Celsius sous rotation après chaque aliquot. Prenez huit microlitres comme échantillon de contrôle digéré. Pour dissocier les deux échantillons de contrôle, ajoutez 80 microlitres de tampon TE dans 10 microlitres de proteinase K.Incubate à 65 degrés Celsius pendant une heure.Pour vérifier l’efficacité de la digestion, exécutez des aliquots de 20 microlitres sur un gel de 0,6 %. Les digestions réussies montrent des fragments principalement de l’aire de répartition de 3,0 à 5,0 paires de kilobases. Préparez l’ADN pour le cisaillement tel que décrit dans le manuscrit.Utilisez un sonicateur pour cisailler l’ADN à une taille de 150 à 700 paires de base. Transférez l’ADN cisaillé dans un nouveau tube de verrouillage sécuritaire normal, mettant en commun plusieurs sonications à partir du même échantillon. Ajouter les perles de purification de l’ADN réchauffées dans une quantité égale à 1,8 fois le volume existant, et mélanger en réutilisant.Après cinq minutes d’incubation, recueillir les perles à l’avec une grille magnétique. En gardant les tubes dans la grille magnétique, laver les perles deux fois avec un millilitre d’éthanol fraîchement préparé. Après avoir assécher à l’air les perles à température ambiante pendant deux à trois minutes, élitz l’ADN en résustant les perles dans le tampon 1x Tris.Utilisant la méthode de pendaison-goutte, une population homogène d’EBs a été obtenue six jours après l’induction de la différenciation d’ESC. L’électrophoresis de gel a été exécuté tout au long du protocole pour le contrôle de qualité. Une digestion efficace par Mbol se traduit par des fragments de moins de trois paires kilobase.L’électrophoresis après ligature a prouvé que la plupart des fragments étaient plus grands que trois paires de kilobase. Des fragments de 400 à 500 paires de base sont attendus après la sonication. Après la déphosphorylation et la ligature de l’adaptateur à extrémité unique, deux séries de PCR ont été effectuées pour amplifier les cibles d’intérêt.Chaque cible a été amplifiée séparément avec deux paires d’amorce différentes, A et B pour le locus Pou5f1 et C et D pour le locus T. Il en est résulté un frottis d’ADN d’environ 400 paires de base. Alternativement, le PCR multiplex a été exécuté pour amplifier des cibles A et C simultanément, ayant pour résultat une taille semblable de fragment après purification.Dans ces profils 4C, les boîtes bleu clair indiquent l’emplacement des exhausteurs avec des changements dynamiques lors de la différenciation. Les régions chromatines contactent les promoteurs des gènes Pou5f1 et T lors de la différenciation EB. Pou5f1 a été régulé pendant la différenciation EB.Inversement, T a été régulée pendant la différenciation eb. La digestion efficace d’enzyme de restriction et puis la ligature de proximité de l’ADN génomique de croisement sont des facteurs clés pour assurer le succès de ce protocole. Une autre chose est la conception de l’amorce pour interroger la carte de contact de chaque lieu.Cette procédure est idéale pour interroger le contact chromatine sur des loci ciblés. Si des changements mondiaux sont nécessaires, des approches à l’échelle du génome telles que Hi-C, promoteur capture Hi-C, ou HiChIP pourraient être effectuées.

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Génétique

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Identification des contacts Enhancer-Promoteur dans les corps embryonnaires par capture quantitative de conformation des chromosomes (4C) (Vidéo) | JoVE Journal

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