Name: In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez l'assay de ligature de proximité pour détecter les interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans. Cette méthode révèle les patterns spatiaux et temporels essentiels au développement.

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Certaines souches de nématodes utilisées dans cette étude ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center financé par les NIH (P40OD010440). La microscopie confocale a été réalisée au Laboratoire de recherche de base biospectroscopy de l’Université du Montana, exploité avec le soutien des NIH Awards P20GM103546 et S10OD021806. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention des NIH GM109053 à E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 à X.W., et le Montana Academy of Sciences Award à X.W. Les bailleurs de fonds n’ont pas participé à la conception ou à la rédaction du rapport. Nous remercions M. Ellenbecker pour la discussion.

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Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Lors de l’étude des IPP dans la lignée germinale C. elegans, la résolution plus élevée offerte par l’APL par rapport à la co-immunostaining permet la visualisation et la quantification des endroits où les interactions se produisent dans la lignée germinale. Il a déjà été signalé que DLC-1 interagit directement avec OMA-1 à l’aide d’un essai in vitro de retrait de la TPS26; cependant, cette interaction n’a pas été récupérée par un retrait in vivo. La co-immunostaining fluorescente...

On estime que plus de 80 % des protéines ont des interactions avec d’autres molécules1, ce qui souligne l’importance des IPP pour l’exécution de fonctions biologiques spécifiques dans la cellule2. Certaines protéines fonctionnent comme des plaques tournantes facilitant l’assemblage de plus grands complexes qui sont nécessaires pour la survie cellulaire1. Ces moyeux médiateur plusieurs IPP et aider à organiser des protéines dans un réseau qui facilite des fonctions spécifiques dans une cellule3. La formation de complexes protéiques est également affectée par le contexte biologique, comme la présence ou l’absence de partenaires interagissant spécifiques4,les événements de signalisation cellulaire et le stade de développement d’une cellule.
C. elegans est couramment utilisé comme organisme modèle pour une variété d’études, y compris le développement. La simple anatomie de cet animal est composée de plusieurs organes, dont le gonad, l’intestin et la cuticule transparente, ce qui facilite l’analyse du développement du ver. La lignée germinale résidant dans le gonad est un excellent outil pour étudier comment les cellules souches germinales mûrissent engamètes 5 qui se développent en embryons et éventuellement la prochaine génération de progéniture. La région de pointe distale de la lignée germinale contient un bassin de cellules souches auto-renouvelées(figure 1). Au fur et à mesure que les cellules souches quittent la niche, elles se transforment en pachytène méiotique et finissent par se transformer en oocytes au stade des jeunes adultes(figure 1). Ce programme de développement dans la lignée germinale est étroitement réglementé par différents mécanismes, y compris un réseau de réglementation post-transcriptionnelle facilité par des protéines liant l’ARN (RBP)6. Les IPP sont importantes pour cette activité réglementaire, car les RBP s’associent à d’autres cofacteurs pour exercer leurs fonctions.
Il existe plusieurs approches qui peuvent être utilisées pour sonder les IPP dans le ver, mais chacune a des limites uniques. L’immunoprécipitation in vivo (IP) peut être utilisée pour isoler les complexes protéiques-protéines des extraits de vers entiers; cependant, cette approche n’indique pas où l’IPP se produit dans le ver. En outre, les complexes protéiques qui sont transitoires et ne se forment qu’à un stade spécifique de développement ou dans un nombre limité de cellules peuvent être difficiles à récupérer par co-immunoprécipitation. Enfin, les expériences de propriété intellectuelle doivent répondre aux préoccupations du réassorignement complexe en protéines après lyse et de la rétention non spécifique des protéines sur la matrice d’affinité.
Les approches alternatives pour la détection in situ des IPP sont la co-immunostaining, le transfert d’énergie de résonance de la résonance (FRET) et la compléments de fluorescence bimoléculaire (BiFC). La co-immunostaining repose sur la détection simultanée de deux protéines d’intérêt dans le tissu ver fixe et la mesure de l’étendue de la colocalisation du signal. L’utilisation de la microscopie super-résolution, qui offre plus de détails que la microscopiestandard 7, aide à tester plus rigoureusement la colocalisation des protéines au-delà de la barrière limitée à la diffraction de 200-300 nm8. Cependant, la co-immunostaining utilisant la microscopie conventionnelle et super-résolution fonctionne mieux pour des protéines avec des modèles bien définis de localisation. En revanche, il devient beaucoup moins instructif pour les partenaires en interaction distribués de façon diffuse. Mesurer la co-localisation des signaux en fonction du chevauchement ne fournit pas d’informations précises sur la question de savoir si les protéines sont en complexitéles unesavec les autres 9,10.
En outre, la co-immunoprecipitation et la co-immunostaining des complexes protéines-protéines ne sont pas quantitatives, ce qui rend difficile de déterminer si de telles interactions sont significatives. FRET et BiFC sont deux techniques fluorescentes. FRET s’appuie sur le marquage des protéines d’intérêt avec des protéines fluorescentes (FP) qui ont chevauchement spectral à laquelle l’énergie d’un FP (donneur) est transférée à un autre FP (accepteur)11. Ce transfert nonradiatif d’énergie entraîne la fluorescence de l’accepteur FP qui peut être détectée à sa longueur d’onde respective d’émission. BiFC est basé sur la reconstitution d’une protéine fluorescente in vivo. Il s’agit de diviser GFP en deux fragments complémentaires, tels que les hélies 1-10 et l’hélice 1112, qui sont ensuite fusionnés à deux protéines d’intérêt. Si ces deux protéines interagissent, les fragments complémentaires de GFP deviennent assez proches à proximité pour se coucher et assembler, reconstituant le fluorophore GFP. Le GFP reconstitué est alors directement observé comme fluorescence et indique où un IPP s’est produit.
En tant que tel, FRET et BiFC dépendent de grandes étiquettes fluorescentes qui peuvent perturber la fonction de la protéine étiquetée. En outre, FRET et BiFC ont besoin d’une expression abondante et comparable des protéines étiquetées pour obtenir des données précises. FRET peut ne pas convenir à des expériences où l’un des partenaires est au-dessus de l’autre, ce qui peut conduire à un arrière-plan élevé13. La surexpression dans les expériences BiFC devrait également être évitée, car cela peut induire l’assemblage non spécifique14 qui a comme conséquence l’arrière-plan accru. Les deux techniques nécessitent l’optimisation des conditions d’expression et d’imagerie des protéines étiquetées, ce qui peut prolonger le temps nécessaire pour terminer les expériences.
L’essai de ligation de proximité (PLA) est une approche alternative qui peut répondre aux limites des techniques mentionnées ci-dessus. L’APL tire parti des anticorps primaires qui reconnaissent les protéines d’intérêt (ou leurs étiquettes). Ces anticorps primaires sont ensuite liés par des anticorps secondaires contenant des sondes d’oligoucléotide qui peuvent s’hybrider les uns avec les autres lorsqu’ils se trouvent à une distance de 40 nm (ou plus courte)15. L’ADN hybride qui en résulte est amplifié par une réaction de PCR, qui est détectée par des sondes qui complètent l’ADN. Il en résulte des foyers qui sont visualisés par un microscope. Cette technologie permet de détecter les IPP in situ dans les tissus complexes (c’est-à-dire le gonad ver), qui est organisé comme une chaîne d’assemblage contenant des cellules à divers stades de développement et de différenciation. Avec l’APL, les IPP peuvent être directement visualisées dans un gonad de ver fixe, ce qui est avantageux pour déterminer si les IPP se produisent à un stade spécifique de développement. L’APL offre une plus grande résolution des IPP par opposition aux essais basés sur la co-localisation, ce qui est idéal pour effectuer des mesures précises. Si elle est utilisée, la microscopie super-résolution a le potentiel de fournir des détails plus fins sur l’emplacement des foyers PLA dans une cellule. Un autre avantage est que les foyers résultant des réactions de l’APL peuvent être comptés par un flux de travail d’analyse basé sur ImageJ, ce qui rend cette technique quantitative.
La famille LC8 de chaînes lumineuses de dynein a d’abord été décrite comme un sous-unité du complexe moteur de dynein16 et a émis l’hypothèse de servir d’adaptateur de cargaison. Depuis sa découverte initiale, LC8 a été trouvé dans de multiples complexes protéiques en plus du complexe moteur de dynein17,18,19,20. Balayage pour les séquences de protéines qui contiennent le motif d’interaction LC819 suggère que LC8 peut avoir de nombreuses interactions avec un large éventail de protéines différentes17,18,19,20,21,22. En conséquence, les protéines de la famille LC8 sont maintenant considérées comme des plaques tournantes qui aident à promouvoir l’assemblage de plus grands complexes protéiques19,22, tels que des assemblages de protéines intrinsèquement désordonnées21.
Une protéine de la famille C. elegans LC8, la chaîne de lumière de la dynein-1 (DLC-1), est largement exprimée sur de nombreux tissus et non enrichie dans des structures souscellulaires spécifiques23,24. Par conséquent, l’identification des partenaires in vivo biologiquement pertinents de DLC-1 dans C. elegans est difficile pour un certain nombre de raisons : 1) la co-immunoprécipitation n’indique pas la source tissulaire où l’interaction se produit; 2) l’expression limitée de partenaires particuliers ou d’interactions transitoires peut entraver la capacité de détecter une interaction par co-immunoprécipitation; et 3) la distribution diffuse du DLC-1 entraîne un chevauchement non spécifique avec les protéines partenaires potentielles par co-immunostaining. Sur la base de ces défis, PLA est une approche idéale pour tester les interactions in vivo avec DLC-1.
Il a été précédemment rapporté que DLC-1 interagit directement avec et sert de cofacteur pour les protéines de liaison ARN (RBPs) FBF-223 et GLD-125. Notre travail prend en charge le modèle de DLC-1 servant de protéine de plaque tournante et suggère que DLC-1 facilite un réseau d’interaction qui s’étend au-delà de la dynein19,22. À l’aide d’un essai de retrait de la TPS, un nouveau RBP d’interaction DLC-1 nommé OMA-1 a été identifié26. OMA-1 est important pour la croissance oocyte et la maturation méiotique27 et fonctionne en conjonction avec un certain nombre de répresseurs translationnels et activateurs28. Alors que FBF-2 et GLD-1 sont exprimés dans les cellules souches et les régions méiotiques pachytene, respectivement, OMA-1 est exprimée diffusement dans la lignée germinale du pachytene méiotique par les oocytes27 (figure 1). Ceci suggère que DLC-1 forme des complexes avec des RBPs dans différentes régions du gonad. Il a également été constaté que l’interaction directe entre DLC-1 et OMA-1 observée in vitro n’est pas récupérée par une ADRESSE in vivo. L’APL a été utilisé avec succès comme une approche alternative pour étudier plus avant cette interaction dans la lignée germinale C. elegans, et les résultats suggèrent que l’APL peut être utilisé pour sonder de nombreux autres IPP dans le ver.

<table><tbody><tr><td>Solution de paraformaldéhyde à 16 %</td><td>Services de microscopie électronique</td><td>15710</td><td>utilisés pour fabriquer une solution de travail à 4 %</td></tr><tr><td>1M KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Préparer une pellicule de 1 M</td></tr><tr><td>1 x M9</td><td>divers</td><td></td><td>préparé comme 10 fois la matière utilisée à 1x ; voir wormbook.org pour</td></tr><tr><td>le protocole 1x PBS</td><td>divers</td><td>voir</td><td> wormbook.org pour protocole</td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 26,5 Aiguille</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>Aiguilles utilisées pour la dissection</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>50ml Tube à centrifuger Oak ridge utilisé pour la synchronisation</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>Couverture pour congélation</td><td>Globe d’échantillon Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm, n° 1</td></tr><tr><td>Couverture pour sceller Globe</td><td>de lame Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22mm, n° 1,5</td></tr><tr><td>Support de montage DAPI pour vecteur d’immunofluorescence</td><td></td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligase, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Rouge DUO92008</td></tr><tr><td>Tampon rouge d’amplification</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Tampon rouge d’amplification Duolink 5x, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Red DUO92008</td></tr><tr><td>Tampon de ligature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>Tampon de ligature Duolink 5x, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Red DUO92008</td></tr><tr><td>Diluant</td><td>d’anticorps Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Diluant d’anticorps Duolink, livré avec DUO92004 et DUO92002, Remarque : Une solution 1x PBS / 1 % BSA peut également être utilisée comme substitut pour diluer l’anticorps.</td></tr><tr><td>Solution de blocage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>Solution de blocage Duolink, livrée avec DUO92004 et DUO92002</td></tr><tr><td>Support de montage pour PLA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>Milieu de montage in situ Duolink avec</td></tr><tr><td>sonde DAPI MINUS</td><td>Sonde Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink Sonde In Situ Anti-Mouse</td></tr><tr><td>MINUS PLUS Sonde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink In Situ Tampon de lavage Anti-Rabbit PLUS</td></tr><tr><td>A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink Tampon de lavage in situ A</td></tr><tr><td>Tampon de lavage B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Tampon de lavage in situ Duolink B</td></tr><tr><td>Polymérase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink Polymérase, Fait partie du kit de réactifs de détection in situ Duolink Red DUO92008</td></tr><tr><td>microscope épifluorescent</td><td>Leica</td><td></td><td>DFC300G caméra, DM5500B microscope</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>Utilisation à 1:500</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>Utilisation à 1:200</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’image</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>Pipette en verre</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Lévamisole</td><td>ACROS Organiques</td><td>187870100</td><td>Préparez un stock de travail de 250 mM</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Utilisation à 1:1000 pour l’immunofluorescence et le PLA, pré-blocage avec sérum de chèvre normal recommandé</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>L.A. Couleurs</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des nématodes (NGM)</td><td>divers</td><td></td><td>Voir wormbook.org pour protocole</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en polyéthylène</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>Préparée sous forme de solution mère à 0,1 % dans l’eau, stockée à -20 °C et diluée 1:100 dans l’eau pour enrober les lames Boîtes</td></tr> de <tr><td>Pétri</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>60 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Lapin anti-GFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td> À <td>utiliser au 1:200 pour l’immunofluorescence, 1:4000 pour</td></tr><tr><td>les lames</td> PLA <td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>Les lames autoclavables à trois carrés 14x14 mm avec barres sont commandées sur mesure par Fisher Scientific. Poly-L-Lysine ajouté aux lames en laboratoire</td></tr><tr><td>Solution d’hypochlorite de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes de travail</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>4,4 x 8,4 pouces</td></tr><tr><td>Plateaux (242 x 241 x 20 mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>Utilisé pour fabriquer une chambre humide</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultrapure</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Eau ultrapure obtenue à partir du système de purification d’eau intégral Milli-Q</td></tr><tr><td>Watchglass</td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg ; C congélateur-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg ; C congélateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>souche OP50 E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nematode souches utilisées dans cette étude (toutes deux disponibles sur demande)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II ; UNC-119(ED3) III ; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom ::3xFLAG ::d lc-1 ::d lc-1 3'UTR ; oma-1 prom ::oma-1 ::GFP ; Référence 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II ; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td></td><td>UMT 422</td><td>dlc-1 prom ::3xFLAG ::d lc-1 ::d lc-1 3'UTR ; gld-1 prom ::ceGFP ::fbf-1 3'UTR + unc-119(+) ; Référence : cette étude</td></tr></tbody></table>

in situ détection de l’assemblage du complexe ribonucleoprotéine dans le c. elegans germline à l’aide de proximity ligation assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Il est essentiel de comprendre quand et où se produisent les interactions protéines-protéines (IPP) pour comprendre la fonction protéique dans la cellule et comment des processus plus larges tels que le développement sont affectés. La germline d’elegans de Caenorhabditis est un excellent modèle pour étudier les IPP qui sont liées à la régulation des cellules souches, à la méiose et au développement. Il existe une variété de techniques bien développées qui permettent aux protéines d’intérêt d’être étiquetées pour la reconnaissance par des anticorps standard, ce qui rend ce système avantageux pour les réactions d’analyse de ligature de proximité (PLA). En conséquence, l’APL est capable de montrer où les IPP se produisent d’une manière spatiale et temporelle dans les lignées germinales plus efficacement que les approches alternatives. Décrit ici est un protocole pour l’application et la quantification de cette technologie pour sonder les IPP dans la lignée germinale C. elegans.

Co-immunostaining des deux 3xFLAG::DLC-1; GFP et 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines avec DES anticorps FLAG et GFP a révélé leurs modèles d’expression dans la lignée germinale (Figure 3Aii-iii,3Bii-iii). Alors que GFP a été exprimée tout au long de la germline (figure 3Aiii), OMA-1::GFP expression a été limitée à la pachytene tardive et les oocytes (figure 3...

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

L’analyse de ligature de proximité permet aux utilisateurs de détecter les interactions protéine-protéine in situ, révélant les modèles spatiaux et temporels des interactions. Cette technique peut aider à répondre à d’importantes questions sur la réglementation du développement de C.elegans. Cette technique offre une sensibilité comparable pour la détection des interactions protéines-protéines sans la complexité d’autres techniques, telles que fret et BiFC.Les individus qui n’ont jamais disséqué les vers pour libérer les 9eds peuvent avoir du mal avec cette étape. Pratiquez la dissection des vers et utilisez-les pour l’immunofluorescence afin de perfectionner les techniques de manipulation et de dissection avant de passer à l’APL. Pour commencer, choisissez de 30 à 40 jeunes vers adultes dans un plat en verre de montre contenant 500 microlitres de 1x M9 et levamisole.Après avoir recueilli les vers, retirer soigneusement et jeter la plupart des médias pour éliminer les bactéries qui sont transférées avec les vers. Ajouter 500 microlitres frais de 1x M9 et levamisole, et utiliser la pipette pour dessiner doucement et distribuer le média pour rincer les vers. Retirez et jetez soigneus

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Découvrez l'assay de ligature de proximité pour détecter les interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans. Cette méthode révèle les patterns spatiaux et temporels essentiels au développement.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay (Vidéo) | JoVE Journal

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

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