Name: Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez un protocole d'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs chimiques contre Toxoplasma gondii par essai de croissance à la luciférase. Cette méthode sensible permet le criblage à haut débit et le calcul du temps de doublement.

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Les auteurs tient à remercier les Drs Sibley et Carruthers d’avoir partagé des anticorps pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT et anti-TgCPL et TgActin. Ce travail a été soutenu par le fonds Clemson Startup (à Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (à Z.D.), une subvention pilote d’une subvention COBRE NIH P20GM109094 (à Z.D.), et NIH R01AI143707 (à Z.D.). Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle à jouer dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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<li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14(2014).</li>
<li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096(2017).</li>
<li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo%2Fexocytic+system+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li>
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<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomics%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit un protocole basé sur la luciferase pour évaluer la croissance intracellulaire de Toxoplasma et évaluer l’efficacité de l’inhibition des composés chimiques contre la croissance des parasites. Comparée aux stratégies existantes disponibles pour mesurer la croissance intracellulaire de Toxoplasma, cette méthode présente une sensibilité et une spécificité élevées. Tout en surveillant la croissance des parasites, un essai simulé dans une microplaque claire de puits est recommandé pour co...

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire très réussi qui infecte environ un tiers de la population humaine. Son taux de transmission élevé est principalement dû à ses diverses voies de transmission, y compris la consommation de viande insuffisamment cuite, l’exposition aux réservoirs de mammifères et la transmission congénitale pendant la naissance. T. gondii provoque principalement des infections opportunistes qui peuvent conduire à une morbidité sévère et la mortalité chez les individus immunodéprimés1,2,3,4,5,6. Les antibiotiques actuellement utilisés pour le traitement de la toxoplasmose aigue sont particulièrement inefficaces dans le traitement des infections congénitales et latentes et provoquent des réactions graves chez certaines personnes3,7,8. Il existe donc un besoin urgent d’identifier de nouvelles thérapies. Comprendre les différences dans les processus subcellulaires au sein de Toxoplasma et de son hôte aidera à identifier les cibles potentielles de médicaments. Par conséquent, des techniques efficaces et pratiques de manipulation du génome sont nécessaires pour étudier les rôles des gènes individuels au sein de Toxoplasma. En outre, Toxoplasma appartient au phylum Apicomplexa, qui comprend plusieurs autres agents pathogènes humains importants, tels que Plasmodium spp. et Cryptosporidium spp. Par conséquent, Toxoplasma peut être utilisé comme un organisme modèle pour aider à étudier la biologie de base chez d’autres parasites apicomplexan.
Pour identifier de nouveaux antibiotiques contre les agents pathogènes microbiens, le dépistage à haut débit d’une bibliothèque de composés chimiques est initialement effectué pour déterminer leur efficacité dans la répression de la croissance microbienne. Jusqu’à présent, plusieurs essais de croissance à base de microplates ont été développés pour mesurer la croissance intracellulaire de T. gondii (c.-à-d. la quantification à base d’incorporation 3H-uracil9, la détection quantitative des parasites à base d’ELISA à l’aide de T. gondii-anticorps spécifiques10,11, la mesure protéinée journaliste à l’aide de souches Toxoplasma 12,13et une imagerie à haute teneur récemment développée assay14).
Ces stratégies individuelles ont toutes des avantages uniques; toutefois, certaines limitations limitent également leurs demandes. Par exemple, puisque Toxoplasma ne peut se répliquer qu’à l’intérieur des cellules animales nucléées, l’autofluorescence et la liaison non spécifique des anticorpsanti-T. gondii pour héberger des cellules provoquent des interférences dans les mesures à base de fluorescence. De plus, l’utilisation d’isotopes radioactifs exige une conformité particulière à la sécurité et des problèmes de sécurité potentiels. Certains de ces essais sont plus appropriés pour évaluer la croissance à un seul moment plutôt que la surveillance continue de la croissance.
Présenté ici est un protocole basé sur la luciferase pour la quantification de la croissance intracellulaire de Toxoplasma. Dans une étude précédente, le gène NanoLuc luciferase a été cloné sous le promoteur de toxoplasma tubulin, et cette construction d’expression luciferase a été transfected dans le type sauvage (RH-ku80ô hxg souche) parasites pour créer un RH'ku80hxg::NLuc souche (appelé RH'ku80::NLuc ici)15. Cette souche a servi de souche parentale pour la détermination intracellulaire de croissance et la suppression de gène dans cette étude. À l’aide duRH-ku80:: soucheNLuc, la croissance des parasites dans les fibroblastes en prépuce humain (FSF) a été surveillée sur une période de 96 h post-infection pour calculer le temps de doublement des parasites.
En outre, l’efficacité d’inhibition de LHVS contre la croissance de parasite peut être déterminée en traçant des taux de croissance de Toxoplasma contre des concentrations sérieuses de LHVS pour identifier la valeurIC 50. La littérature précédente a rapporté que TgCPL est une cible principale de LHVS dans les parasites et que le traitement avec LHVS diminue le développement des infections aigues et chroniques de Toxoplasma 16,17,18,19. En outre, RH-ku80::NLuc a été utilisé comme la souche parentale pour la modification du génome pour générer une souche TgCPLdéficiente (RH'ku80'cpl::NLuc), et l’inhibition de LHVS a été mesurée par rapport à ce mutant. En observant un décalage des valeurs IC50 pour LHVS dans les parasites TgCPL-déficientspar rapport à la souche WT, il a été validé que TgCPL est ciblé par LHVS in vivo.
Dans ce protocole,RH-ku80::NLuc est utilisé comme la souche parentale, qui n’a pas une voie efficace non-homologe de jointure (NHEJ), facilitant ainsi double multisegment homologie-dépendance recombinaison (HDR)20,21. En outre, 50 régions homologues bp sont flanqués aux deux extrémités d’une cassette de résistance aux médicaments par PCR. Le produit PCR sert de modèle de réparation pour enlever l’ensemble du locus génétique via HDR à l’aide d’outils d’édition du génome à base de CRISPR-Cas9. Ces courtes régions homologues peuvent être facilement incorporées dans les amorces, fournissant une stratégie pratique pour la production du modèle de réparation. Ce protocole peut être modifié pour effectuer la suppression universelle des gènes et le marquage des gènes endogènes.
Par exemple, dans notre publication la plus récente, trois gènes de protéase, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease), et TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1), ont été génétiquement ablés dans TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistance transporteur) -parasites déficients en utilisant cette méthode15. En outre, TgAMN (un aminopeptidase putatif N [TgAMN, TGGT1_221310]) a été étiqueté endogènement15. Le laboratoire de Lourido a également rapporté l’utilisation de régions homologues courtes dans la gamme de 40-43 bp pour l’introduction de la mutation génétique dirigée par le site et le marquage de gène endogène dans le génome de Toxoplasma utilisant une méthode similaire22. Ces modifications réussies du génome suggèrent qu’une région homologue de 40-50 bp est suffisante pour la recombinaison efficace de l’ADN dans la souche TgKU80-déficiente,qui simplifie grandement la manipulation du génome dans Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Kit d’extraction de gel d’agarose</td><td>New England BioLabs</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0316S</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H1 Lecteur de microplaques multimode hybride</td><td>BioTek Instuments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX Gemini Twin Waveform Système d’électroporation</td><td>Appareil de Harvard Cellules</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli chimiquement compétentes</td><td>New England BioLabs</td><td>C29871</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR premix</td><td>Takara Bio</td><td>639298</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine h</td><td>Prolume</td><td>301-10 hCTZ</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>F170L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4054</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagénèse dirigée New</td><td>England BioLabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Geneious pour la conception d’ARNsg (version : R11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel GraphPad Prism (version 8th)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SnapGene pour le clonage moléculaire (version : 4.2.11)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de toxoplasma gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii est un agent pathogène protozoaire qui affecte largement la population humaine. Les antibiotiques actuels utilisés pour le traitement de la toxoplasmose clinique sont limités. En outre, ils présentent des effets secondaires indésirables dans certains groupes de personnes. Par conséquent, la découverte de nouvelles thérapies pour la toxoplasmose clinique est impérative. La première étape du développement d’antibiotiques de nouveau est d’identifier des composés chimiques montrant une efficacité élevée dans l’inhibition de la croissance des parasites à l’aide d’une stratégie de dépistage à haut débit. En tant qu’agent pathogène intracellulaire obligatoire, Toxoplasma ne peut se répliquer qu’à l’intérieur des cellules hôtes, ce qui interdit l’utilisation de mesures d’absorption optique comme indicateur rapide de croissance. Présenté ici est un protocole détaillé pour un essai de croissance basé sur la luciferase. À titre d’exemple, cette méthode est utilisée pour calculer le temps de doublement des parasites Toxoplasma de type sauvage et mesurer l’efficacité du phényl de sulfone morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyle (LHVS, un composé de protéase-ciblage de cystéine) concernant l’inhibition de la croissance intracellulaire parasite. Un protocole de suppression de gènes à base de CRISPR-Cas9 à base de CRISPR-Cas9 dans Toxoplasma utilisant 50 régions homologues de 50 bp pour la recombinaison dépendante de l’homologie (HDR). En quantifiant les efficacités d’inhibition du LHVS dans les parasites de type sauvage et TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease), il est démontré que le LHVS inhibe la croissance des parasites de type sauvage plus efficacement que la croissance de la TgCPL est une cible à laquelle LHVS se lie dans Toxoplasma. La sensibilité élevée et le fonctionnement facile de cet essai de croissance basé sur la luciferase le rendent approprié pour surveiller la prolifération de Toxoplasma et évaluer l’efficacité de drogue d’une manière élevée de débit.

La figure 1 représente un exemple de courbe de croissance pour le RHku80::NLuc strain et le calcul dérivé pour son temps de doublement. En général, l’essai est effectué en trois répliques techniques pour chacune des trois répliques biologiques pour tenir compte des variations des lectures d’activité de luciferase. Afin de calculer le changement de pli normalisé de la croissance des parasites, chaque lecture à 24-96 h post-infection a été div...

Présenté ici est un protocole pour évaluer l’efficacité d’inhibition des composés chimiques contre la croissance intracellulaire in vitro de Toxoplasma gondii en utilisant un essai de croissance à base de luciferase. La technique est utilisée pour confirmer la spécificité de l’inhibition par la suppression génétique du gène cible correspondant. L’inhibition de LHVS contre la protéase TgCPL est évaluée en exemple.

Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Ces stratégies sensibles peuvent être utilisées pour évaluer l’efficacité de l’inhibition des inhibiteurs chimiques et en combinaison avec la suppression du gène CRISPR-Cas9 pour étudier les cibles du médicament. Au lieu d’utiliser un test de point de terminaison, la croissance des parasites peut être surveillée au fil du temps pour permettre le calcul du temps de doublement des parasites à l’aide d’une protéine sensible reporter. Cet essai peut potentiellement être mis à l’échelle en 384 ou 1 536 microplaques de puits pour l’essai de composés multiples ou pour le criblage des bibliothèques d’une manière à haut débit.Cette stratégie peut être modifiée pour quantifier la croissance d’autres agents pathogènes microbiens intracellulaires et leurs réponses au médicament d’intérêt. Pour effectuer un essai de croissance toxoplasma à base de luciferase, commencez par aspirer soigneusement le milieu des cultures microplaquées présemencées de 96 puits de fibroblastes de prépuce humaine et inoculez 150 microlitres de suspension parasite B dans les puits dans un format de trois colonnes cinq rangées. Après une incubation de quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, aspirez soigneusement le milieu de chaque puits pour éliminer les parasites non envahis et remplir les puits dans chaque, mais la première rangée avec la température ambiante phénol rouge milieu libre.Ajouter ensuite 100 microlitres d’une solution de substrat de luciferase de 12,5 micromolaires dans PBS dans chaque puits de la rangée supérieure et incuber les microplaques pendant 10 minutes à température ambiante pour permettre une lyse cellulaire complète. À la fin de l’incubation, mesurer l’activité de luciferase sur un lecteur de microplaques. Chaque lecture représente le nombre initial de parasites envahis à quatre heures après l’infection.Répétez l’analyse toutes les 24 heures pendant les quatre prochains jours sans changer le milieu. Pour calculer le changement normalisé de la croissance des parasites, chaque lecture peut être divisée par la lecture initiale à quatre heures après l’infection. Le journal 2 du changement de pli normalisé de la croissance parasitaire peut alors être tracé contre chaque point de temps et soumis à une fonction de régression linéaire pour obtenir la pente qui représente le temps de doublement.Pour évaluer l’efficacité de l’inhibition d’un composé d’intérêt sur la croissance de Toxoplasma, cultiver des fibroblastes de prépuce humaine dans des microplaques de 96 puits pendant au moins sept jours avant d’inoculer chaque puits de cellules avec 150 microlitres de parasites comme démontré pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pendant l’incubation, préparer le composé d’intérêt à huit concentrations différentes dans un réservoir de 12 puits par dilution en série. Diluer les composés dans un réservoir de 12 puits à une dilution d’un à trois par pipetting chaque mélange de haut en bas à plusieurs reprises avec une pipette d’un millilitre.À quatre heures après l’infection, remplacer le milieu dans chaque puits à partir des colonnes deux à neuf avec 150 microlitres de milieu complété par chaque dilution du composé, laissant la première colonne remplie de milieu régulier pour servir de contrôle non traité. Ensuite, retournez les cultures cellulaires à l’incubateur de culture cellulaire pendant 96 heures et mesurez l’activité de luciferase pour chaque puits afin de déterminer le pourcentage d’inhibition de croissance dans les cultures à chaque concentration de composé. Pour calculer l’activité normalisée de luciferase en pourcentage, divisez l’activité moyenne de luciferase pour chaque concentration composée par l’activité moyenne de luciferase dérivée des parasites non traités.Ensuite, utilisez un logiciel graphique approprié pour tracer les activités normalisées de luciferase contre le composé individuel et pour calculer la concentration inhibitrice demi-maximale pour chaque composé. Pour générer une construction plasmide exprimant l’ARN à guide unique et Cas9 pour la suppression d’un gène d’intérêt, naviguez vers la page ressources génomiques de Toxoplasma et récupérez l’ensemble de la séquence de codage génétique, y compris les introns et les exons, ainsi que les régions non traduites de 1,5 kilobase cinq et trois premières. Copiez la séquence TgCPL récupérée dans le logiciel d’analyse de séquence et étiquetez les cinq et trois premières régions non traduites.Sur la page Ressources génomiques de Toxoplasma, cliquez sur Télécharger, Fichiers de données et Current_Release. Dans le dossier T.gondii GT1, sélectionnez FASTA. À partir du dossier de données, téléchargez le fichier séquence du génome de la souche Toxoplasma gondii GT1.Créez ensuite un dossier local nommé Génome de Toxoplasma dans le logiciel d’analyse des séquences d’ADN et importez le fichier séquence du génome de Toxoplasma dans le dossier. Sélectionnez outils, clonage et trouver des sites CRISPR et définissez trois premiers cas9 pour l’emplacement du site PAM. Sélectionnez un ARN à guide unique qui démontre un score de spécificité élevé, généralement supérieur à 98% et n’a pas de G suivant le NGG.L’ARN à guide unique sélectionné est habituellement situé à des sites proches du début et arrête les codons du gène d’intérêt. Utilisez ensuite un prémétrage PCR avec les paramètres indiqués dans le tableau pour effectuer une réaction PCR pour modifier le plasmide préexistant exprimant l’ARN à guide unique qui cible le gène TgUPRT. Pour la transfection de Toxoplasma, mélangez deux microgrammes d’ADN de modèle réparé avec 20 microgrammes des plasmides d’expression d’ARN Cas9 à guide unique et mélangez 400 microlitres de résuspension parasite, d’ADN et de cinq microlitres de 200 millimolaires ATP 500 millimolaires de glutathion réduite dans un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre.Ajouter le tampon de cytomix pour porter le volume total jusqu’à 500 microlitres au besoin et transférer le mélange d’ADN parasite à un espace de quatre millimètres avec cuvette d’électroporation. Puis électroporer les parasites à deux kilovolts et 50 ohms de résistance. Pour cloner les parasites knock-out, d’abord effectuer une dilution en deux étapes des parasites pour atteindre un 10 parasites par millilitre de D10 moyen complété par la concentration appropriée d’antibiotiques.Ensuite, transférez 150 microlitres des parasites purifiés résuspendus à chaque puits d’une microplaque de 96 puits présemencée avec des fibroblastes de prépuce et incubez la microplaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant sept jours. À la fin de l’incubation, identifier les puits contenant une seule plaque et transférer 75 microlitres des fibroblastes humains en prépuce infectés par toxoplasma résuspendants de chaque puits de la culture microplaquée de 96 puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les granulés dans 10,25 microlitres de tampon de lyse contenant tampon de dilution dans l’additif de libération d’ADN.Ensuite, incuber les échantillons pendant quatre minutes à température ambiante et deux minutes à 98 degrés Celsius avant d’effectuer pcr pour tester l’intégration de la cassette de résistance aux médicaments et la perte du gène d’intérêt. Les efficacités d’inhibition du LHVS et du type sauvage dans les souches delta CPL peuvent être déterminées en traçant leurs activités de luciferase contre différentes concentrations d’inhibiteurs. Après PCR, le plasmide muté est linéarisé et chargé dans un gel d’agarose de 1% pour la vérification d’une amplification réussie.Après extraction de gel et transformation d’E.coli, les clones contenant les plasmides prévus peuvent être examinés par digestion d’endonuclease de restriction dans le séquençage d’ADN. Après amplification de modèle de réparation, l’électrophoresis de gel d’agarose peut être employé pour vérifier la taille correcte du produit de PCR. En général, sept à huit clones sont sélectionnés pour le dépistage initial afin de vérifier la suppression de la séquence de codage du gène d’intérêt, suivi de la détection des cinq et trois bras principaux pour aider à réduire au minimum le nombre total de clones à dépister.D’autres vérifications peuvent être effectuées par immunoblotting si un anticorps reconnaissant la protéine cible est disponible. Avant d’obtenir des mesures de l’activité de la luciferase, une microplaque claire avec une infection simulée doit être vérifiée au microscope pour s’assurer que les parasites ne lysent pas complètement les cellules hôtes.

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Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase

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