Name: Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez le transport axonal dans les neurones moteurs à l'aide de chambres microfluidiques en PDMS. Cette méthode permet de visualiser en temps réel les mitochondries et compartiments acides pour étudier les mécanismes neurodégénératifs comme la SLA.

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Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF, 561/11) et du Conseil européen de recherches (ERC, 309377).

<ol><li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitostasis+in+Neurons%3A+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li>
<li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
<li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).</li>
<li>Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li>
<li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+acidic+intracellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li>
<li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li>
<li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport%2C+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li>
<li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li>
<li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Dans ce protocole, nous décrivons un système pour suivre le transport axonal des mitochondries et des compartiments acides dans les neurones moteurs. Cette plate-forme in vitro simplifiée permet un contrôle précis, la surveillance et la manipulation des compartiments neuronaux subcellulaires, permettant l’analyse expérimentale des fonctions locales des neurones moteurs. Ce protocole peut être utile pour étudier les maladies de MN telles que la SLA, pour se concentrer sur la compréhension du mécanisme sous-jacent du dysfo...

Les MN sont des cellules fortement polarisées avec de longs axones, atteignant jusqu’à un mètre de long chez les humains adultes. Ce phénomène crée un défi critique pour le maintien de la connectivité et de la fonction MN. Par conséquent, les MN dépendent d’un bon transport d’informations, d’organites et de matériaux le long des axones de leur corps cellulaire à la synapse et au dos. Divers composants cellulaires, tels que les protéines, l’ARN et les organites, sont transportés régulièrement à travers les axones. Les mitochondries sont des organites importants qui sont systématiquement transportés dans les MN. Les mitochondries sont essentielles pour une activité et une bonne fonction des MN, responsables de la fourniture de l’ATP, de la mise en mémoire tampon du calcium et des processus de signalisation1,,2. Le transport axonal des mitochondries est un processus bien étudié3,4. Intéressant, des défauts dans le transport mitochondrial ont été rapportés pour être impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives et spécifiquement dans les maladies de MN5. Les compartiments acides servent d’autre exemple pour les organites intrinsèques qui se déplacent le long des axones MN. Les compartiments acides comprennent les lysosomes, les endosomes, l’appareil trans-Golgi, et certaines vésicules sécrétrices6. Des défauts dans le transport axonal des compartiments acides ont été trouvés dans plusieurs maladies neurodégénératives aussi bien7, et les articles récents soulignent leur importance dans les maladies de MN8.
Pour étudier efficacement le transport axonal, les chambres microfluidiques qui séparent les compartiments somatiques et axonaux sont fréquemment utilisées9,10. Les deux avantages significatifs du système microfluidique, et la compartimentation et l’isolement des axones, le rendent idéal pour l’étude des processus subcellulaires11. La séparation spatiale entre les corps des cellules neuronales et les axones peut être utilisée pour manipuler les environnements extracellulaires de différents compartiments neuronaux (p. ex., axones vs soma). Les essais biochimiques, neuronaux de croissance/dégénérescence et d’immunofluorescence bénéficient tous de cette plate-forme. Les IMF peuvent également aider à étudier la communication de cellule à cellule en cocultant des neurones avec d’autres types de cellules, tels que les muscles squelettiques12,13,14.
Ici, nous décrivons un protocole simple mais précis pour surveiller les mitochondries et le transport de compartiment acide dans les neurones moteurs. Nous montrons en outre l’utilisation de cette méthode en comparant le pourcentage relatif d’organites mobiles rétrogrades et antérgrades, ainsi que la répartition de la vitesse de transport.

<table><tbody><tr><td>Plat à fond en verre 35mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre 50mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon DU-897 Caméra EMCCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARA-C (Cytosine &beta ;-D-arabinofuranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>stock de 2mM en filtre Supplément DDW</td></tr><tr><td>B-27 (50X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>Dilué à 10 &micro ; g/mL dans du ddw filtré avec 0,01 % BSA)</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie 1,25mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504530</td><td>Pour la préparation d’un grand</td></tr><tr><td>poinçon de biopsie MFC 6mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504533</td><td>Pour la préparation d’un petit</td></tr><tr><td>poinçon de biopsie MFC 7mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504534</td><td>Pour la préparation d’un grand</td></tr><tr><td>MFC Bitplane Logiciel Imaris - version 8.4.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A3311-100G</td><td>5 % p/v dans ddw</td></tr><tr><td>Chlorotrimetylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Alomone Labs</td><td>C-240</td><td>Diluer à 10 &micro ; g/mL dans du ddw filtré avec 0,01 % BSA)</td></tr><tr><td>Gradient de densité moyen - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Déoxyribonucléase I (DNAse) du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>stock 10mg/mL dans la graisse silicone neurobasale</td></tr><tr><td>Dow Corning Graisse silicone sous vide poussé</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>Pour la préparation du moule époxy</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14200-067</td><td>Diluer 1:10 en DDW</td></tr><tr><td>Pince fine Dumont #55 0.05 &times ; 0.02 mm</td><td>F.S.T</td><td></td><td></td></tr> 1125520 <tr><td>Durcisseur époxy</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>Pour la préparation de moules époxy</td></tr><tr><td>Résine époxy</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>Pour la préparation de moules époxy FIJI</td></tr><tr><td>software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>Diluer à 10 &micro ; g/mL dans de la ddw filtrée avec 0,01 % BSA)</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9 :GFP souche</td><td>de souris Jackson Laboratories</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14185-045</td><td>Diluer 1:10 dans ddw avec ajout de 1 % P/S et filtre</td></tr><tr><td>iQ software</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris ciseaux, courbés, 10 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris, droits, 9 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Deep-Red FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (P/S) Solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8638</td><td>Dilué 1:1000 dans un kit d’élastomère de silicone 1X PBS</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>modifié DOW Corning Corporation</td><td>#3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>stock 25 mg/mL dans des</td></tr><tr><td>ciseaux de microdissection à ressort</td> 1XPBS Vannas, lame de 3 mm <td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU X-1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transport axonal des organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Les neurones moteurs (MNs) sont des cellules fortement polarisées avec de très longs axones. Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé de MN, contribuant à la croissance neuronale, au développement, et à la survie. Nous décrivons une méthode détaillée pour l’utilisation des chambres microfluidiques (MFC) pour le suivi du transport axonal des organites étiquetés fluorescents dans les axones MN. Cette méthode est rapide, relativement peu coûteuse, et permet la surveillance des indices intracellulaires dans l’espace et le temps. Nous décrivons un protocole étape par étape pour : 1) Fabrication de MFC en polydiméthylsiloxane (PDMS); 2) Le plating des explantations ventrales de moelle épinière et de la culture dissociée de MN dans les CFC ; 3) Étiquetage des mitochondries et des compartiments acides suivis de l’imagination confocale vivante; 4) Analyse de transport axonal manuelle et semi-automatique. Enfin, nous démontrons une différence dans le transport des mitochondries et des compartiments acides de HB9::GFP ventrale moelle épinière explant axones comme une preuve de la validité du système. Au total, ce protocole fournit un outil efficace pour étudier le transport axonal de divers composants axonaux, ainsi qu’un manuel simplifié pour l’utilisation de MFC pour aider à découvrir les possibilités expérimentales spatiales.

Suivant le protocole décrit, souris embryonnaire HB9::GFP épidullaires explants ont été cultivés dans MFC (figure 4A). Les explantations ont été cultivées pendant 7 jours, quand les axones ont complètement traversé dans le compartiment distal. Mitotracker Deep Red et Lysotracker Des colorants rouges ont été ajoutés aux compartiments distal et proximal afin d’étiqueter les mitochondries et les compartiments acides(figure 4...

Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé des neurones moteurs. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour suivre le transport axonal des compartiments acides et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs à l’aide de chambres microfluidiques.

Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Le transport axonal est vital pour la santé neuronale et la viabilité. Notre protocole décrit une méthode élégante de surveillance et d’analyse du transport axonal. Et peut être adapté pour divers modèles de maladies neuronales.L’utilisation de chambres microfluidiques permet un contrôle temporel spatial précis, ce qui est crucial pour l’étude de la biologie axonale. Des anomalies axonales de transport sont impliquées avec plusieurs maladies neurodégénératives telles que la SLA. La plate-forme microfluidique permet d’étudier les mécanismes de base ainsi que de tester des thérapies pour réparer les défauts de transport axonal.La plate-forme de chambre microfluidique peut être facilement adaptée à différents aspects de la recherche axonale, y compris la croissance axonale et la dégénérescence de divers sous-types neuronaux. Cette méthode est complexe et généralement enseignée sur le bras. La démonstration visuelle augmentera l’accessibilité de cette procédure à tout scientifique intéressé à étudier le transport axonal.Commencez par moulage PDMS dans les moules primaires. Utilisez de l’air pressurisé pour enlever toute saleté de la plate-forme de gaufrette, en vous assurant que les gaufrettes semblent lisses et claires avant de procéder. Ensuite, remplissez un récipient d’azote liquide et préparez une seringue de 10 millilitres à l’aide d’une aiguille de calibre 23.Dans une hotte chimique, placer la plaquette contenant de la plaque dans un contenant étanche et remplir la seringue de deux millilitres d’azote liquide par plaquette contenant de la plaque. Ouvrir une bouteille de chlorotrimethylsilane. Percer le bouchon en caoutchouc avec la seringue et injecter l’azote dans la bouteille.Sans retirer l’aiguille, retourner la bouteille à l’envers et réduire de deux millilitres de chlorotrimethylsilane pour chaque plaquette contenant de la plaque. Étendre le chlorotrimethylsilane dans le récipient, mais pas directement sur la plaque de gaufrette contenant de la plaque. Fermez le récipient.Et l’incuber pendant cinq minutes par gaufrette. Ensuite peser 47,05 grammes de base PDMS dans un tube de 50 millilitres, et ajouter pdms agent de séchage à un rapport de 16 à 1 base à l’agent curateur pour un total de 50 grammes. Mélanger le PDMS pendant 10 minutes sur un rotateur à basse vitesse, puis le verser dans chaque plaquette contenant de la plaque à la hauteur désirée.Placez les plaques à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide pendant deux heures. Qui va enlever l’air emprisonné dans le PDMS, et former un moule uniforme clair. Ensuite, incuber les assiettes dans un four pendant trois heures ou toute la nuit à 70 Degrés Celsius.Pour créer la chambre microfluidique ou MFC. Couper et enlever les moules PDMS de la plaque avec un scalpel, en s’assurant de ne pas forcer les moules parce qu’ils sont fragiles. Suivez les instructions dans le manuscrit du texte pour poinçonner et couper les chambres, en fonction de la configuration expérimentale.Pour la culture d’explantation de moelle épinière, poinçonner deux puits de sept millimètres dans le côté distal d’un grand MFC, en s’assurant qu’ils se chevaucheront avec les bords du canal. Sur le côté proximal, poinçonner un puits de sept millimètres au milieu du canal avec un chevauchement minimal, de sorte qu’il reste suffisamment d’espace pour les explants. Perforer deux trous supplémentaires d’un millimètre dans les deux bords du canal proximal.Et couper le PDMS en chambres simples. Tournez ensuite le MFC vers le haut et utilisez une aiguille de calibre 20 pour sculpter trois petites grottes d’explantation sur le puits perforé de sept millimètres. Pour la culture dissociée des motoneurones, poinçonner quatre puits de six millimètres, sur les bords des deux canaux d’un petit MFC et couper le PDMS en chambres simples.Pour stériliser le MFC, étalez 50 centimètres de long bandes de ruban adhésif sur le banc. Appuyez ensuite sur les deux faces de la chambre sur la bande et tirez-la en arrière. Placez les chambres propres dans une nouvelle plaque et incubez-les en qualité analytique, de 70% d’éthanol pendant 10 minutes sur un shaker orbital.Disposer de l’éthanol et sécher les chambres dans une hotte de culture tissulaire ou dans un four à 70 degrés Celsius. Placez ensuite la chambre au centre d’un fossé inférieur en verre de qualité culture tissulaire, et appliquez une force mineure sur les bords pour lier le PDMS au fond du plat. Incuber le plat pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius.Ensuite, appuyez sur les chambres pour renforcer l’adhésion. Incuber le plat sous UV pendant 10 minutes, puis procéder au codage du MFC. Ajouter 1,5 nanogramme par millilitre plo aux deux compartiments.S’assurer que l’OLP traverse les canaux. En pipetant le supports de revêtement directement dans l’entrée du canal. Examinez le MFC au microscope léger, pour vérifier s’il y a des bulles.Si des bulles d’air bloquent les micro rainures, placez le MFC dans un dessiccators sous vide pendant deux minutes. Retirez l’excès d’air des canaux MFC. Puis l’incuber toute la nuit avec l’OLP.Remplacez l’OLP par de laminine et incubez le MFC pour une nuit supplémentaire. Avant le placage, laver la laminine avec le milieu de culture. Disséquer une souris enceinte de l’ICR E12.5 et séparer les embryons du sac amniotique.Mettre l’embryon dans le plat de silicium HBSS. Retirez la tête et la queue et retournez-la sur son ventre. Peler délicatement la peau superficielle des embryons en arrière, exposant la moelle épinière.Séparez la moelle épinière du corps de la tête à la queue, à l’aide d’une pince à épiler douce. Retirer les méninges, puis enlever les cornes dorsales et couper la moelle épinière en sections transversales d’un millimètre d’épaisseur. Disposer de tout milieu du compartiment proximal du MFC.Ramasser une seule explantation de moelle épinière avec une pipette, dans un volume total de quatre microlitres. Et injectez-le le plus près possible de la grotte. Sortir tout excès de liquide du puits proximal par l’intermédiaire des prises latérales.Répétez l’étape précédente deux fois de plus et assurez-vous que les explants sont intégrés dans le canal proximal. Ajouter lentement 150 microlitres de milieu SCEX au puits proximal. Un jour après le placage.Remplacement du milieu SCEX dans le compartiment proximal et ajout d’un milieu SCEX riche au compartiment distal. Maintien d’un gradient de volume d’au moins 15 microlitres par puits entre les puits distals et proximaux. Après quatre à six jours, les axones doivent traverser vers le compartiment distal et être prêts pour l’imagerie axonale de transport.Pour étiqueter les mitochondries et les compartiments acides, préparez un milieu SCEX frais avec 100 nanomolaires MitoTracker Deep Red FM et 100 nanomolaires LysoTracker Red. Et ajoutez-le aux chambres microfluidiques. Incubez-les pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius.Laver ensuite trois fois avec un milieu SCEX chaud. Procéder à l’imagerie en direct du transport axonal. Acquisition d’une série d’images de 100 time lapse à trois intervalles de seconde.Avec un total de cinq minutes par film. Après sept jours dans les chambres microfluidiques. Souris embryonnaire HB9 GFP explants moelle épinière.Nous sommes tachés de teintures MitoTracker Deep Red et LysoTracker Red. Pour étiqueter les mitochondries et les compartiments acides. Des axones dans les rainures distales ont été imaged et l’analyse de Kymograph a été employée pour déterminer la distribution générale de mouvement.Ceci a indiqué un biais dans la direction rétrograde seulement dans les compartiments acides de ville, mais pas dans le transport mitochondrique. La densité des particules a également été quantifiée, révélant un plus grand nombre de particules mitochondriales par rapport aux compartiments acides dans les axones explantés de la moelle épinière HB9 GFP. Ensuite, une seule analyse du transport de particules a été effectuée à l’aide d’un logiciel semi-automatisé suivi d’un code interne.Cette analyse a révélé que les composants acides et les mitochondries ont des vitesses de particules similaires. Mais seuls les compartiments acides affichent un biais vers le mouvement rétrograde. Isoler la moelle épinière embryonnaire peut être difficile au début.Pratiquez cette procédure plusieurs fois, en vous assurant d’utiliser l’âge embryonnaire correct et les outils de dissection appropriés. L’utilisation de chambres microfluidiques modifie notre façon d’étudier la biologie axonale. Il nous permet de visualiser les processus axonals localisés, que nous sommes une fois supposés se produire uniquement dans le corps cellulaire.

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Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique

Cette vidéo présente une méthode de suivi du transport axonal dans les motoneurones à l’aide d’un système de chambre microfluidique. Il s’agit de cultiver des tissus embryonnaires de la moelle épinière de souris dans des puits recouverts de polymères avec un milieu nutritif pour induire la croissance axonale. Le mouvement des organites colorés par fluorescence dans l’imagerie en direct confirme le transport axonal bidirectionnel.

Suivi du transport axonal d’organites dans les motoneurones à l’aide d’un dispositif microfluidique

Cellules S2 de drosophile et des neurones en culture sont de grands systèmes pour l'imagerie du transport motorisé organite in vivo. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour la culture des deux types de cellules, leur imagerie et d'analyse de transport.

Organite Transport en culture d' Drosophila Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.

Les protocoles pour seul neurone de formation de réseau microfluidique et le masquage de l'eau pour le motif de revêtements de biomatériaux plasma dans la puce sont décrits. Co-cultures fortement interconnectés peuvent être préparés en utilisant les entrées de cellules minimales.

Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Le transport intracellulaire des cargaisons, telles que les vésicules ou les organites, est effectué par des protéines motrices moléculaires qui suivent les microtubules polarisés. Ce protocole décrit la corrélation entre la directionnalité du transport des particules de cargaison individuelles se déplaçant à l’intérieur des neurones et la quantité relative et le type de protéines motrices associées.

Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l&#39;analyse &quot;Cargo Mapping&quot;

Ce protocole fournit une procédure complète pour fabriquer l’organoïde humain de nerf moteur iPS cellule-dérivée par l’assemblage spontané d’un faisceau robuste d’axones étendus d’un sphéroïde dans une puce de culture de tissu.

Génération organoïde tridimensionnelle de nerf moteur

Nous décrivons une méthode pour générer des unités motrices humaines dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce en co-cultivant des motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme avec des myotubes primaires dérivés de mésoangioblastes humains, ce qui entraîne la formation de jonctions neuromusculaires fonctionnellement actives.

Génération d’unités motrices humaines avec des jonctions neuromusculaires fonctionnelles dans des dispositifs microfluidiques

Le présent protocole décrit l’ensemencement et la coloration des mitochondries neuronales dans des chambres microfluidiques. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres permet le traitement sélectif des mitochondries dans les axones pour analyser leurs propriétés en réponse à des défis pharmacologiques sans affecter le compartiment du corps cellulaire.

Dépolarisation sélective des mitochondries axonales assistée par microfluidique

Découvrez le transport axonal dans les neurones moteurs à l'aide de chambres microfluidiques en PDMS. Cette méthode permet de visualiser en temps réel les mitochondries et compartiments acides pour étudier les mécanismes neurodégénératifs comme la SLA.

Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques

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