Name: Optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Découvrez un protocole optimisé de culture rénale organoïde sur membrane chorioallantoïde d'embryon de poulet. Cette méthode améliore la vascularisation, la survie des bourgeons rénaux et permet une imagerie haute résolution pour étudier le développement embryonnaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu financièrement par l’Akatemia Suomen (Académie de Finlande) (206038, 121647, 250900, 260056; Subvention du Centre d’excellence 2012-2017 251314), Munuaiss-iti - Association finlandaise des reins et du foie, sigrid Juseliuksen S’iti, Victoriastiftelsen, La Fondation culturelle suédoise en Finlande, Novo Nordisk, Septième Programme-cadre de la Communauté européenne (FP7/2007-2013; subvention FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608), et H2020 Marie Sklodowska-Actions Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 64297. Les auteurs remercient Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias et Hannele Hôrkman pour leur assistance technique.
Les figures 3, 4 et le film 2 sont réimprimées avec la permission de Développement.

Les soins et procédures des animaux étaient conformes à la législation nationale finlandaise pour l’utilisation d’animaux de laboratoire, à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres scientifiques (ETS 123) et à la directive 86/609/CEE de l’UE.
1. Fabrication de minireservoirs pour la culture de reins embryonnaires de souris et d’organoïdes rénaux sur le poulet CAM et mise en place d’expériences de xénotransplantation
<ol><li>Utilisez des inserts de culture cellulaire transwell conçus pour 6 plaques de puits ou 12. REMARQUE : Selon l’expérience particulière, de grands ou de petits minireservoirs peuvent être utilisés. Il est préférable d’utiliser de petits minireservoirs pour le xenografting jusqu’à huit reins embryonnaires ou lorsque plusieurs minireservoirs seront placés sur le même embryon de poulet (p. ex., des échantillons d’expérience et de contrôle sur le même MCA de poulet).</li>
	<li>Couper les côtés des inserts à l’aide d’un multi-courant rotatif avec une lame de scie circulaire ou une scie à main pour créer un anneau en plastique de 2 mm de haut avec une membrane perméable attachée à elle.</li>
	<li>Polonais les bords de ces minireservoirs avec un scalpel ou un couteau pointu.</li>
	<li>Stériliser les minireservoirs dans 70% d’éthanol pour au moins 1 h.</li>
	<li>Laver les minireservoirs dans de l’eau autoclaved à double distillation et les laisser sécher dans une hotte laminar.</li>
	<li>Rincez les minireservoirs en PBS et milieu de culture (haute teneur en glucose DMEM/10% FBS/1% pénicilline-streptomycine).</li>
	<li>Placer le réservoir dans un plat Petri, au-dessus d’une goutte (600 L/400 l) de milieu de culture avec la membrane face vers le haut.</li>
	<li>Disposer les reins embryonnaires ex vivo disséqués ou les organoïdes rénaux uniformément sur la membrane à l’aide d’une pipette ou d’un tube capillaire en verre. Évitez de laisser beaucoup de liquide autour des reins.</li>
	<li>Laissez les échantillons se fixer à la membrane pendant 2 à 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% de CO2. REMARQUE : Jusqu’à huit reins de souris embryonnaires ou organoïdes de rein d’E11.5 peuvent être disposés sur le petit insert. Le grand insert est recommandé si soit de plus gros morceaux de tissu embryonnaire seront utilisés pour le xénotransplant ou un mélange de cellules-hydrogel sur une plus grande surface de la CAM.</li>
	<li>Prenez 8-day-old ex ovo cultivé poulets embryonnaires préparés selon les méthodes publiées précédemment de l’incubateur de culture cellulaire12,13.</li>
	<li>Transférer les minireservoirs au CAM afin que les greffes soient face au CAM, et la membrane les recouvre. Placez les minireservoirs à la périphérie de l’ACM, afin qu’ils ne couvrent pas l’embryon de poulet. REMARQUE : Lors de l’utilisation des minireservoirs plus petits fabriqués à partir d’inserts transwell pour 12 plaques de puits, jusqu’à trois minireservoirs peuvent être placés sur un CAM.</li>
	<li>Ajouter 500 L (6 insert de puits) ou 300 L (12 insert de puits) de milieu de culture aux minireservoirs.</li>
	<li>Cultiver les échantillons sur le poulet CAM pendant un maximum de 9 jours. Remplacer le milieu de culture dans les minireservoirs tous les jours. REMARQUE : La vascularisation des échantillons peut être observée dès 24-48 h après la transplantation.</li>
</ol>2. Fabrication de plaques conçues sur mesure et mise en place de cultures FiZD
<ol><li>Percer des trous de 20 mm de diamètre dans le fond d’une plaque de 6 puits. REMARQUE : Pour les expériences FiZD, utilisez 6 plaques de puits avec une profondeur de puits de 16 mm (spécifiée dans le tableau des matériaux).</li>
	<li>Polonais les jantes des trous (en particulier sur le côté supérieur) à l’aide d’une perceuse électrique avec un bit de perceuse à vis- à effet de compteur, d’un scalpel ou d’un couteau tranchant.</li>
	<li>Stériliser les plaques dans 70% d’éthanol pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Laver les assiettes dans de l’eau autoclaved à double distillation et les laisser sécher dans des conditions stériles.</li>
	<li>Laver complètement les couvertures en verre de 22 mm x 22 mm avec 70 % d’éthanol ou les nettoyer selon le protocole publié par Saarela et al.11.</li>
	<li>Collez les couvertures sur le côté supérieur des trous dans 6 plaques de puits à l’aide d’une colle de tissu non toxique. Appliquer de la colle autour du trou et placer délicatement le coverlip pour le couvrir. Laisser sécher la colle.</li>
	<li>Inspectez les plaques sous un stéréomicroscope et retirez l’excès de colle séchée de la surface des coverlips si nécessaire. REMARQUE : Vérifiez qu’il n’y a pas de colle au-dessus du coverlip pour assurer même la compression des échantillons.</li>
	<li>Mélanger les perles de polystyrène (70 m de taille de particules) avec un volume égal d’hydrogel. Un volume de 50 à 100 ll par puits est suffisant. REMARQUE : Gardez le mélange de perles d’hydrogel et de polystyrène sur la glace.</li>
	<li>Placer un insert transwell sous un microscope disséquant avec la membrane vers le haut.</li>
	<li>Disposer les échantillons (p. ex., reins embryonnaires ex vivo ou organoïdes rénaux) uniformément sur la membrane.</li>
	<li>Ajouter le mélange de perles d’hydrogel/polystyrène à côté des échantillons soigneusement pour éviter des dommages aux tissus fragiles.</li>
	<li>Retourner l’insert transwell de sorte que la membrane avec les échantillons assemblés sur elle est orientée vers le bas.</li>
	<li>Placez doucement l’insert dans un puits de la plaque de puits modifiée de 6 et appuyez doucement vers le bas afin que les échantillons soient comprimés au niveau des perles. REMARQUE : Suivez l’évolution de la compression à l’aide d’un microscope.</li>
	<li>Gardez l’insert légèrement pressé au puits avec une main et fixez-le à la plaque en faisant fondre le plastique avec un fer à souder à trois points à la périphérie de l’insert.</li>
	<li>Lorsque l’insert est fixé à la plaque, ajouter 2 ml de milieu de culture (DMEM/10% FBS/1% pénicilline-streptomycine) au puits et continuer à assembler les puits restants dans la plaque de la même manière.</li>
	<li>Transférer la plaque finie dans un incubateur sur scène d’un microscope inversé pour l’imagerie par time-lapse.</li>
	<li>Effectuez l’imagerie en accéléré des échantillons à l’aide de paramètres expérimentaux appropriés. REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de changer le milieu de culture dans les puits de la plaque pendant les expériences en time-lapse, mais il peut être facilement fait à travers les trous sur les côtés de l’insert.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Deux protocoles détaillés sont présentés qui affinent la méthode classique de culture organotypique rénale, et permettent la vascularisation, le développement prolongé, et l’imagerie optimale 4D (c.-à-d. image et temps 3D) des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes. Cette section met en évidence les étapes critiques des méthodes et traite du dépannage.
La différence significative entre d’autres méthodes de culture DE CAM et cette méthode améliorée de culture de CAM de poulet est l’utili...

La culture organotypique des reins embryonnaires est devenue un modèle important pour étudier la néphrogenèse il y a des décennies1,2,3. Les organoïdes rénaux représentent un système modèle avancé pour étudier le développement des reins sains et malades4. Le principal inconvénient pour les deux méthodes, cependant, est que ni l’une ni l’autre méthode ne récapitule la fonction principale du rein: la filtration sanguine. Les néphrons et la vascularisation rénale se développent dans les organoïdes rénaux et les cultures organotypiques de la même façon qu’au développement in vivo à un stade précoce; cependant, le glomeruli formé in vitro restent avascular5. La vascularisation des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes rénaux a été précédemment démontrée dans des expériences de transplantation seulement dans des conditions in vivo. Par exemple, la transplantation d’organoïdes rénals pluripotents humains dérivés de cellules souches sous une capsule rénale de souris permet le développement des néphrons dans l’organoïde à un stade fonctionnel6.
Une approche intermédiaire entre les cultures purement in vitro et les méthodes de transplantation in vivo est la xénotransplantation à l’ACM des embryons aviaires. La vascularisation de la primordia rénale de souris intacte a été démontrée précédemment utilisant ce système7,8. Cependant, il a également été démontré que la vascularisation rénale dans le rein murin xénotransplanted a été dérivée de l’endothélium hôte, et non de la greffe9. Cette observation a réduit de manière significative le potentiel des modèles chimériques (mammifères aviaires) du rein embryonnaire pour étudier le développement de la vascularisation rénale, parce que les conditions expérimentales étaient non permémissives pour la survie des cellules endothéliales de donneur-dérivé.
Présenté dans la première partie de ce protocole est une méthode améliorée pour la culture des reins embryonnaires de souris sur CAM des oeufs aviaires, combinant des conditions microenvironmentales de la culture organotypic et la xénotransplantation. La principale amélioration des méthodes précédentes est qu’au lieu de placer les reins embryonnaires de souris et les organoïdes rénaux directement sur le CAM, la zone d’implantation est recouverte de minireservoirs perméables remplis de milieu de culture qui fournissent le tissu transplanté avec des nutriments et le protéger contre le séchage. Le taux de réussite des expériences augmente considérablement et les conditions de développement de la vascularisation dérivée du donateur s’améliorent. L’application de cette méthode aux cultures xénotransplantes entraîne le développement de la vascularisation glomerulaire composée des cellules endogènes endothéliales des reins de donneur.
L’analyse détaillée de la morphogenèse cellulaire est une autre application importante des modèles de culture rénale. Les méthodes précédemment rapportées d’acquisition d’image en time-lapse des cultures rénales ne sont suffisantes que pour l’analyse de la morphologie globale et le modelage des reins embryonnaires, mais pas pour le suivi des cellules individuelles10. Récemment, une nouvelle méthode fixe Z-Direction (FiZD) visant à la formation à temps 3D confocale haute résolution des organoïdes rénaux et des cultures organotypiques a été décrite11. Dans cette méthode, les organoïdes et les organes embryonnaires sont doucement comprimés entre un housse en verre et une membrane perméable d’un insert transwell dans une plaque conçue sur mesure jusqu’à ce que l’épaisseur de l’échantillon atteigne 70 m, offrant des conditions optiques optimales pour l’imagerie. Dans la deuxième partie des méthodes, un protocole détaillé pour la fabrication d’une plaque conçue sur mesure et la configuration d’expériences FiZD pour l’imagerie organoïde à long terme est décrit.

<table><tbody><tr><td>Mèche plate réglable</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>Pour percer des trous de 20 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Retourneur automatique d’œufs</td><td>OLBA B.V., Pays-Bas</td><td>AT-42</td><td>Pour l’incubation des œufs avant la configuration ex ovo.</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>cellulaire Panasonic</td><td>13090543</td><td>Température réglée à 37&deg ; C, 90 % d’humidité, 5 % CO2</td></tr><tr><td>Cell Incubateur</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Chicken CAM-culture. Température réglée à 37&deg ; C, 90 % d’humidité, 5 % CO2Cellstar</td></tr> <tr><td>Plaque</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>16 mm de profondeur des puits pour correspondre aux inserts</td></tr><tr><td>Lame de scie circulaire pour outil rotatif Dremel</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Plaque à puits multiples avec inserts de membrane en polycarbonate perméable</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>Pour plaques à 6 puits. 40 et micro ; m pore size</td></tr><tr><td>Foret à fraiser</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Pour le polissage (20,5 mm, 1/4", HSS)</td></tr><tr><td>Tube capillaire en verre jetable</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Professional</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td> Incubateur <td>d’œufs à haute teneur en glucose</td></tr><tr><td>Compact S84</td><td>Grumbach, Allemagne</td><td>8012</td><td>Pour l’incubation des œufs avant la configuration ex ovo. Température réglée à 38&deg ; C avec humidité relative supérieure à 60 %</td></tr><tr><td>Éthanol (70 %)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Œufs fécondés</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlande</td><td></td><td>Hy-Line White et Nick Chick</td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Forceps DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Menzel-Gl&auml ; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Histoacryl Glue</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur sur scène</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, sur mesure</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Lavage des mini réservoirs.</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Perles de polystyrène</td><td>Corpusculaire</td><td>1000263-10</td><td>70 &micro ; m de diamètre</td></tr><tr><td>Système d’outils multifonctions rotatifs</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Fer à souder</td><td>Weller</td><td>TCP S Capillaire</td><td>en verre chauffé peut également être utilisé</td></tr><tr><td>Thincert 12-well Inserts de culture cellulaire avec 0,4 &micro ; Membrane en polystyrène m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6 puits inserts de culture cellulaire avec 0,4 &micro ; m-pore Membrane polystyrène</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Les cultures organotypiques rénales embryonnaires, et en particulier les organoïdes rénaux pluripotents dérivés de cellules souches, sont d’excellents outils pour suivre les processus développementaux et modéliser les maladies rénales. Cependant, les modèles sont limités par un manque de vascularisation et de fonctionnalité. Pour remédier à cela, un protocole amélioré pour la méthode des cellules et des tissus de xenografting à la membrane chorioallantoïque (CAM) d’un embryon aviaire pour gagner la vascularisation et la restauration du flux sanguin a été développé. Les greffes sont recouvertes de minireservoirs sur mesure qui réparent les échantillons à la CAM et leur fournissent un milieu de culture qui protège les greffes du séchage. La méthode de culture améliorée permet aux xénogreffes de croître jusqu’à 9 jours. Le manuscrit décrit également comment fournir des conditions optimales pour l’imagerie confocale à long terme des organoïdes rénaux et des cultures organotypiques en utilisant la méthode précédemment publiée Fixed Z-Direction (FiZD). Cette méthode comprime doucement un organe embryonnaire ou un organoïde entre un housse de verre et une membrane dans une grande quantité de milieu et fournit d’excellentes conditions pour l’imagerie pendant jusqu’à 12 jours. Ensemble, ces méthodes permettent la vascularisation et le flux sanguin vers les organoïdes rénaux et les cultures rénales organotypiques avec l’imagerie confocale améliorée. Les méthodes décrites ici sont très bénéfiques pour étudier les fonctions fondamentales et appliquées des reins ex vivo. Les deux méthodes s’appliquent à divers types de tissus et d’organoïdes.

Le protocole de culture CAM présenté ici a permis une vascularisation très efficace des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires à la suite de la xénotransplantation sur le poulet CAM(figure 1, Film 1). Les minireservoirs contenant le milieu de culture fournissaient des éléments nutritifs au tissu de distributeur et les protégeaient du séchage pendant la période précédant la vascularisation appropriée. Cette méthode a fourni des conditions permissives pour que les cellul...

Ce travail décrit deux méthodes pour étudier le développement d’organes, une configuration améliorée de xénotransplantation sur la membrane chorioallantoïque (CAM) des embryons aviaires qui permet la vascularisation des organes embryonnaires et des organoïdes cultivés et une nouvelle z-direction fixe méthode de culture d’organe avec des conditions expérimentales modifiées qui permet l’imagerie confocale de time-lapse à haute résolution.

Optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

La culture des organes rénaux et les organites dérivés de cellules souches programmées fournissent d’excellents moyens d’étudier les mécanismes qui sous-œuvrent le développement du rein et la maladie. Le système actuel de culture d’organe ne fournissent pas le flux sanguin au rein, cependant. Pour cette raison, la raison pour laquelle les modèles actuels sont incomplets et ne parviennent pas à récapituler la fonction principale du rein, qui est la filtration du sang.Dans cette publication, nous présentons un protocole amélioré pour la culture et la visualisation des reins embryonnaires et organoïdes sur la membrane chorioallantoïque de l’embryon de poulet. Dans notre nouvelle mise en place expérimentale, nous superposons les rudiments rénaux transplantés sur cam avec des réservoirs perméables signifiants qui sont remplis de milieu culturel. Ce protocole augmente considérablement la survie des rudiments rénaux et aussi des cellules endothéliales intrinsèques.La méthode permet le flux sanguin vers le glomerulus en développement. Récemment, nous avons également publié une nouvelle méthode de culture d’organes à direction fixe qui offre haute résolution confocal 3D time-lapse imagerie. La méthode a fourni des conditions optimales pour l’imagerie confocale à long terme des organoïdes et des rudiments d’organe.Dans l’approche, nous comprimons doucement le tissu entre un glissement de couverture en verre et une membrane perméable. Ici, nous montrons comment les plaques conçues sur mesure sont faites et comment les expériences de culture sont mis en place. Ainsi, dans cette publication nous présentons une technique améliorée de culture rénale de tube d’organelle.Cette méthode offre une meilleure façon de modéliser la genèse organelle et de mener l’imagerie à haute résolution pour étudier les reins embryonnaires et organoïdes rénaux ex vivo. Selon votre expérience, prenez des contre-inserts de cellules de transfert conçus pour des plaques de six puits ou de 12 puits. Coupez les côtés de l’insert à l’aide d’un outil Dremel pour créer un anneau en plastique de deux millimètres de haut avec une membrane perméable attachée à elle.Polir les bords de l’anneau de swarf avec un scalpel ou un couteau pointu. Stériliser les mini réservoirs dans 70% d’éthanol pendant au moins une heure. Lavez ensuite les mini réservoirs en autoclave à l’eau distillée et séchez-les dans un capot laminaire.Rincer les mini réservoirs dans PBS et milieu de culture. Placez le réservoir sur une boîte de Pétri sur notre milieu de culture avec la membrane orientée vers le haut. Disposer les reins embryonnaires ex vivo disséqués ou les organoïdes rénaux sur la membrane.Évitez de laisser beaucoup de liquide autour des échantillons et laissez-les attachés de deux à 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. La transplantation exénale est faite à la membrane chorioallantoic du poulet embryonnaire ex ovo de huit jours. Transférer les mini réservoirs de sorte que la membrane couvre la greffe.Placez-les à la périphérie de l’AMC afin qu’ils ne couvrent pas l’embryon. Ajoutez ensuite le milieu de culture aux mini réservoirs. Cultiver les échantillons sur le poulet CAM pendant neuf jours au maximum.Remplacez quotidiennement le milieu de culture dans les mini réservoirs. La vascularisation des échantillons peut être observée déjà 24 à 48 heures après la transplantation. Pour faire les plaques de six puits conçues sur mesure pour la culture fixe.Vous devez commencer par percer des trous de 20 millimètres dans le fond de la plaque à l’aide d’une machine de forage avec un foret approprié. Ensuite, polir les jantes des trous sur le côté supérieur de la plaque. Enfin, stériliser les plaques à 70% d’éthanol pendant au moins une heure.Ensuite, lavez les assiettes en autoclave à l’eau distillée et séchez-les dans une hotte lemiar. Lavez le couvercle de 22 x 22 millimètres glissé dans 70% d’éthanol et laissez-les sécher complètement. Collez le bordereau de couverture sur le dessus d’un trou dans le fond d’un puits à l’aide de colle de tissu.Après séchage, inspecter les plaques au microscope stérile et enlever l’excès de colle. Tout d’abord, mélanger un aliquot de perles de polystyrène avec un volume égal d’hydrogène. Placez l’insert de transfill sous un microscope disséquant avec la membrane orientée vers le haut et arrangez les reins sur la membrane.Ajouter une goutte de mélange de perles hydro-gel à côté des reins avec soin. Retournez l’insert transfill de sorte que la membrane et les reins sont orientés vers le bas. Ensuite, placez soigneusement l’insert dans notre puits de plaque de six puits conçue sur mesure.Poussez l’insert très doucement dans le puits. Suivez le degré d’aplatissement du microscope jusqu’à ce que le rein soit au niveau avec les perles. Gardez l’insert légèrement pressé au puits d’une main et fixez-le à la plaque en faisant fondre le plastique à trois points à la périphérie de l’insert avec un fer à soudé.Ajouter deux millilitres de culture dans le puits à travers une ouverture sur le côté. Lorsque vous démarrez une imagerie en accéléré, transférez la plaque dans l’incubateur sur scène d’un microscope inversé. Notre protocole modifié de capture cam permet une vascularisation très efficace des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires.De nombreux réservoirs contenant du milieu de culture alimentent les tissus des donneurs et les protègent contre le séchage pendant la période initiale du vascularizaton. Ce film montre le flux de cellules sanguines de poulet dans un centre embryonnaire de rein de souris greffé au poulet CAM et cultivé pendant sept jours. Ce panneau de figure montre que notre méthode améliorée de culture de CAM fournit des conditions permissives pour les cellules endothéliales dérivées rénales.Les figures A et B montrent que les reins embryonnaires cultivés pendant cinq jours sur la culture d’intervalle de jours ont été greffés au centre au poulet CAM pendant cinq jours. La coloration avec des spécificités de souris CD-31 anticorps montre que le réseau cellulaire endothélial du centre rénal greffé à CAM est plus étendu que dans le contrôle latéral gauche. Dans la figure C, nous voyons que les vaisseaux sanguins de souris tachés avec la souris spécifique CD-31 anticorps et c’est le plus avec les vaisseaux sanguins de poulet.Les figures D et E montrent des cryosections de reins embryonnaires de souris cultivés sur la culture de voyage ou cam de poulet pendant cinq jours et tachés avec CD-31 et Hoechst. La vasculature glomeruli est plus mature dans les reins cultivés sur le poulet CAM que dans les cultures de contrôle. La figure F montre un rein embryonnaire de souris cultivé sur cam d’un poulet transgénique de GFP pendant sept jours.Les cellules endothéliales de souris sont tachées d’anticorps CD-31 et nous pouvons observer que la vascularisation dans les reins de souris xénotransplantés est principalement, mais pas exclusivement dérivée de la souris. La nouvelle culture de la direction fixe permet la culture des reins embryonnaires et des organoïdes à une distance limitée. Dans une culture de voyage traditionnelle, les organes cultivés sont placés sur un filtre qui est maintenu dans une interface moyenne d’air par une grille métallique.Cette méthode permet de bonnes conditions pour le développement et la croissance, mais n’est pas optimale pour l’imagerie. Dans la culture de direction fixe, l’organe cultivé est pressé entre un fond de verre du plat et une membrane et l’épaisseur de celui-ci est contrôlée par les perles de polystyrène travaillant comme espaceurs ici. Les organes en développement peuvent être photographiés à travers le verre de couverture donnant une meilleure vue de l’organe.Ce panneau de figure montre que les reins embryonnaires et les organoïdes rénaux peuvent être cultivés dans la méthode fixe de culture de direction réglée. Les images lumineuses de champ des reins embryonnaires et des organoïdes de rein le septième jour montrent le développement normal. Dans la figure C, l’expression GFB a été activée dans les néphrons en développement d’un organoïde rénal par la figure D montre un rein avec un traumatisme une coloration sur le bourgeon eurétrique et six deux taches marquant les cellules précurseurs du néphron.Les figures E et F présentent le rein de souris cultivé pendant 12 jours. Le traumatisme un et la coloration du néphron montrent le bourgeon euréthrique et les podocites. Le film aussi, présente un rein embryonnaire de MTMG, Taiwan origine crie, où le cri de Taiwan induit l’expression GFB dans les cellules endothéliales.Nous pouvons voir que les cellules endothéliales rénales sont présentes dans le rein embryonnaire en développement et le réseau endothélial peut également se développer dans la méthode de culture. Dans le panneau sur la droite, vous pouvez voir comment les cellules endothéliales migrent dans la fente vasculaire d’un néphron de stade en forme de S. Ici, nous avons présenté le protocole amélioré pour la xénotransplantation des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires au poulet CAM.Ce protocole augmente considérablement la survie des rudiments rénaux et aussi de leurs cellules endothéliales intrinsèques. La méthode permet le flux sanguin vers le glomerulus en développement. L’autre protocole présenté ici est la méthode fixe de culture d’organe de direction réglée qui améliore la qualité d’imagerie et aide à étudier la genèse d’organelle au niveau de cellule simple.Les images à haute résolution conviennent à la segmentation automatisée des cellules et à l’étude informatique du comportement cellulaire chez les organoïdes rénaux et les cultures rénales.

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo décrit une méthode d’étude du développement d’organes à l’aide d’un dispositif amélioré de xénotransplantation sur membrane chorioallantoïdienne (CAM) à partir d’embryons aviaires. Cette méthode permet le développement d’organes embryonnaires et d’organoïdes entièrement vascularisés.

Culture organotypique rénale sur Chicken CAM : une technique de transplantation d’explants de reins murins sur Chicken CAM pour induire la formation de l’architecture vasculaire rénale

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh). Ce protocole génère des organoïdes rénaux en deux semaines. Les organoïdes rénaux qui en résultent peuvent être cultivés dans des flacons de spinner à grande échelle ou des plaques d’agitation magnétiques multi-puits pour des approches parallèles de test de drogues.

Une méthode simplifiée pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Cet article présente un protocole de fabrication pour un nouveau type de substrat de culture avec des centaines de microconteneurs par mm2, dans lequel les organoïdes peuvent être cultivés et observés à l’aide de la microscopie à haute résolution. Les protocoles d’ensemencement cellulaire et d’immunomarquage sont également détaillés.

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la transplantation d’organoïdes rénaux dans la cavité celomique d’embryons de poulet. Cette méthode induit la vascularisation et une maturation accrue des organoïdes en 8 jours et peut être utilisée pour étudier ces processus de manière efficace.

Vascularisation efficace des organoïdes rénaux par transplantation intracélomique dans des embryons de poulet

Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.

Génération d’organoïdes rénaux en suspension à partir de cellules souches pluripotentes induites

Ici, nous présentons un protocole pour greffer des organoïdes cérébraux humains à plusieurs stades de maturation dans la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet. Les organoïdes cérébraux ont été cultivés selon des protocoles standardisés non guidés.

Modélisation précoce non guidée de la niche neurovasculaire organoïde du cerveau humain dans la membrane chorioallantoïde permissive de l’embryon de poussin

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Découvrez un protocole optimisé de culture rénale organoïde sur membrane chorioallantoïde d'embryon de poulet. Cette méthode améliore la vascularisation, la survie des bourgeons rénaux et permet une imagerie haute résolution pour étudier le développement embryonnaire.

Optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie (Vidéo) | JoVE Journal

Optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie

Explorer plus de vidéos