Name: Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez un protocole de dépistage de drogues par xénogreffe chez le poisson-zèbre pour l'oncologie. Cette méthode permet l'imagerie automatisée et la quantification des réponses des cellules cancéreuses humaines in vivo.

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Cette recherche a été appuyée par un V Foundation V Scholar Award et des NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (à J.S. Blackburn) et la subvention de formation des NIH T32CA165990 (à M.G. Haney).

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Kentucky (protocole 2015-2225). Des échantillons de patients ont été prélevés par la Commission d’examen institutionnel de l’Université du Kentucky (protocole 44672). Toutes les expériences animales effectuées à la suite de ce protocole doivent être approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’utilisateur.
1. Dégel des cellules lymphoblastiques lymphoblastiques aigues du patient primaire
<ol><li>Dégelez les cellules mononucléaires périphériques du sang (PBMC) des patients primaires dans un bain d’eau de 37 oC. Immédiatement après le dégel des cellules, transférer des cellules dans leur support de congélation (90 % de FBS et 10 % de sulfoxide de diméthyle [DMSO]) dans un tube conique de 15 ml avec tuyauterie lente, évitant les bulles d’air. Ajoutez 10 ml de milieu de décongélation pré-imminable de 37 oC (25 % de sérum bovin fœtal [FBS] dans le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove (environ 2 à 3 s par mL) aux cellules du tube conique de 15 ml. REMARQUE : Des PBMC ont été prélevés sur des échantillons de sang de patients au moment du diagnostic. Le pelage de buffy a été séparé par centrifugation de densité et les cellules ont été lavées 2x dans RPMI 1640 - 10% FBS. Les cellules ont été comptées et 107 cellules ont été congelées par cryovial dans 1 ml de congélateur et stockées à -80 oC.</li>
	<li>Cellules de centrifugeuse à 100 x g pendant 10 min et les supports d’aspiration de la pastille cellulaire. Répétez l’ajout de supports de dégel, de centrifugation et d’aspiration un délai supplémentaire pour éliminer tout DMSO résiduel.</li>
	<li>Résuspendez les cellules dans 5 ml de saline tamponnée par phosphate (PBS) et retirez 10 l pour compter sur un compteur cellulaire automatisé ou un hémocytomètre. Ajouter 10 L de bleu trypan à 10 l de cellules enlevées pour le comptage. Comptez le nombre de cellules par ml et enregistrez pour calculer plus tard le volume pour réutilire les cellules pour le xenografting (voir étape 2.5). REMARQUE: Typiquement, 500 cellules sont xénogreffées par poisson zèbre larvaire larvaire. Par exemple, 5 x 105 cellules sont nécessaires pour injecter 1 000 poissons zèbres. La viabilité devrait être de 85 % à utiliser pour le xenografting. Dans cette expérience, la viabilité cellulaire était de 96 % après la décongélation, évaluée par la coloration bleu trypan.</li>
</ol>2. Cellules d’étiquetage fluorescent avec DiI
<ol><li>Centrifuge le nombre de cellules désirée en 5 ml de PBS à 200 x g pour 5 min et supernatant aspiré. Tacher un minimum de 2 x 106 cellules en cas d’agglutination ou de problèmes de chargement de l’aiguille lors de l’injection.</li>
	<li>Faire 1,1'-dioctadecyl-3,3',3',3'3'3'-tétramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) solution de colorant (5 ml de PBS contenant 4 'L par mL de tache DiI, Table of Materials) et resuspendre le granulé de cellules dans la solution de coloration. REMARQUE: La densité cellulaire ne doit pas dépasser 2 x 106 cellules/mL lorsqu’elle est résiliée dans la solution de coloration.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 oC protégées de la lumière pendant 20 min, vortex doucement, puis incuber les cellules sur la glace pendant 15 min à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Cellules de centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et supernatant aspiré. Laver les cellules avec 5 ml de PBS, centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min et aspirer le supernatant. Répétez le lavage, la centrifugation et l’aspiration une fois de plus.</li>
	<li>Résuspendez les cellules dans 1 L de PBS par 250 000 cellules vivantes et transférez-les à un tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Gardez les cellules résuspendées sur la glace dans l’obscurité et continuez immédiatement à microinjections. REMARQUE: Cela garantit que 500 cellules patientes sont injectées dans le poisson zèbre avec chaque pompe d’injection de 2 nL de volume.</li>
</ol>3. Microinjecter les larves de poisson zèbre
REMARQUE: Les microinjections doivent être complétées dans un rayon de 1 à 3 h de coloration afin d’améliorer la viabilité des cellules.
<ol><li>Avant de colorer les cellules et d’injecter, faire des plaques d’agarose pour l’injection en versant 25 ml d’agarose de 3 % dans 1x Tris/borate/EDTA (TBE) dans un plat Petri et lui permettre de se solidifier. Conserver les assiettes à 4 oC jusqu’à 2 semaines.</li>
	<li>Aussi avant de colorer les cellules et l’injection, déchorionate 2 poissons zèbres dpf à l’aide de forceps sous un microscope disséquant. Pour la déchorionation manuelle, tirer des extrémités opposées de la corvée protectrice du poisson zèbre avec des forceps jusqu’à ce que les déchirures de chorion et le poisson zèbre deviennent nonveloped10. REMARQUE: La déschorionation peut également être effectuée en utilisant le traitement enzymatique avec le pronase, comme précédemment décrit10. Casper (roy-/-;nacre-/-) poissons zèbres ont été utilisés pour ces expériences11. Toute souche larvaire de poisson zèbre peut être utilisée pour le xenografting. Si le pigment interfère avec l’imagerie ou la visualisation, le traitement de propylthiouracil (PTU) peut être employé pour bloquer la synthèse de mélanine si les souches optiquement claires de zèbre ne sont pas disponibles12.</li>
	<li>Aiguilles de préchill à 4 oC ou sur la glace pour empêcher l’agglutination des cellules pendant la microinjection. Chargez 5 L de cellules tachées dans une aiguille en verre borosilicate non rechargeable réfrigérée à l’aide de pointes de pipette de microchargeur. REMARQUE: Les méthodes de configuration des microinjecteur et des aiguilles ont déjà été publiées13.</li>
	<li>Charger l’aiguille dans le bras du microinjecteur. Biseau la pointe d’aiguille à l’aide d’une lame de rasoir stérile. Mesurer la taille des gouttelettes dans l’huile minérale à l’aide d’un micromètre d’étape, en gardant le volume des gouttelettes uniformément à 2 nL (0,15 mm de diamètre) tout au long.</li>
	<li>Utilisez 350 ll de 4 mg/mL tricaine-S pour anesthésier 30 poissons zèbres déchorionés de 2 dpf dans un plat Petri contenant 25 ml de support E3. Après le transfert de 1 min des larves anesthésiées dans une plaque d’injection à surface plane (3 % d’agarose dans un plat Petri) et injectez des larves avec une pompe de cellules tachées au site d’injection désiré (p. ex., le jaune ou le péricarde; voir la figure 2A,B). REMARQUE: Le site d’injection doit être choisi en fonction de l’objectif de l’expérience. Le site d’injection le plus commun est le jaune. Pour faire circuler les cellules dans la circulation sanguine, le péricarde, le conduit de Cuvier, l’espace périvitelline ou l’espace rétroorbital peut être utilisé comme sites d’injection. Des sites d’injection orthotopique peuvent également être utilisés, comme le cerveau.</li>
	<li>Laver les larves de la plaque d’injection dans un plat Petri de 10 cm2 (30 larves par assiette) contenant le support E314 sans bleu méthylène et incuber à 28 oC pendant une période de récupération de 1 h. Continuer à injecter jusqu’à ce qu’un nombre désiré de larves ait été injectée. REMARQUE: Idéalement, insufflez 2 à 2,5 fois le nombre de larves nécessaires pour les expériences. Il y aura quelques décès de larves en raison du stress causé par l’injection et de l’augmentation de la température d’incubation. Typiquement, après la pratique avec la technique, 800 à 1500 larves de poisson zèbre peuvent être injectées par une seule personne dans le 1/3 h lorsque les cellules tachées doivent être injectées.</li>
	<li>Déplacer les plaques de larves injectées dans un incubateur de 34 oC. Ne placez pas les plats de larves Petri directement sur une étagère en métal dans l’incubateur pour éviter la surchauffe de l’eau E3. Par exemple, placez un plat Petri vide entre l’étagère et le plat de larves Petri pour agir comme tampon. Enlever les larves de poissons zèbres mortes après 24 et 48 heures après l’injection (hpi).</li>
</ol>4. Mise en place d’écran de drogue avec le poisson zèbre Xenogrefted
<ol><li>
À 48 hpi, dépister les larves de poisson zèbre pour la fluorescence/l’engraftment tumoral et la santé(figure 2C,D). Retirez tout poisson zèbre mort ou mal formé et sélectionnez le poisson zèbre avec un engraftment similaire(figure 2C,D, 1-3 et 1'3'). Enlever les poissons zèbres non parfumés(figure 2C,D, 5 et 5').
	<ol>
<li>Pour les poissons injectés de jaune, retirer les poissons lorsque les bordures du jaune ne peuvent pas être vues autour de la masse cellulaire engrafted(figure 2C, 4) car il rend la quantification difficile. Pour les poissons injectés au péricarde, retirer les poissons lorsqu’ils injectaient des empiètements de masse cellulaire dans le sac jaune(figure 2D, 4').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter le poisson zèbre dans une assiette de 96 puits. Pour ce faire, couper la pointe d’une pointe de pipette de 200 L, juste assez grand pour un poisson zèbre de 4 dpf pour s’adapter à travers. Aspirez 150 L de support E3 avec un poisson zèbre de l’assiette à l’aide d’une pipette P200, et ajoutez à un puits vide d’une plaque à fond plat de 96 puits.</li>
	<li>Diluer le médicament à tester dans le volume requis de support E3, à 150 lL par puits. Préparer le médicament à 2 fois la concentration désirée. Par exemple, préparer 20 M de médicaments en E3 si la concentration finale souhaitée est de 10 m, puisque la moitié du volume total de chaque puits est constituée de la solution médicamenteuse. Pour le groupe témoin DMSO, ajoutez DMSO au même volume que le médicament.</li>
	<li>Ajoutez 150 L de solution médicament diluée de 2x à chaque puits contenant des larves de poisson zèbre dans 150 L d’E3, pour un volume final de 300 l avec solution de médicament 1x par puits.</li>
	<li>Incuber la plaque à 34 oC. Vérifiez les poissons zèbres morts tous les jours. Après 2 jours, si désiré, rafraîchir le médicament en enlevant 200 L de liquide de chaque puits de la plaque de 96 puits et en remplaçant par 200 l de 1x solution de médicament dilué ou DMSO dans les médias E3. REMARQUE: Les meilleurs résultats ont été trouvés après 3 jours de traitement médicamenteux pour cette expérience; cependant, la durée du traitement médicamenteux peut varier entre 2 et 4 jours et peut devoir être optimisée en fonction de l’expérience en cours ou des médicaments utilisés.</li>
</ol>5. Imagerie du poisson zèbre xénogreffé à l’aide d’une unité d’imagerie équipée de microscope à fluorescence et d’une unité d’échantillonneur automatisé
<ol><li>Préparer 1 L de 4 mg/mL tricaine frais et 1,5 L de supports E3. Remplissez la bouteille multimédia 1 avec les supports E3 et la bouteille multimédia 2 avec tricaine.</li>
	<li>Supprimer tous les canaux fluorescents indésirables dans le logiciel d’imagerie et ajouter le canal désiré (DiI pour cette expérience). Vérifiez le canal fluorescent souhaité car une image ne sera prise que pour les canaux avec une marque de contrôle. Aussi, sélectionnez comment les images seront prises (z-stacks, automatisation, boucles en série, etc.). REMARQUE: Pour cette expérience, l’accent a été mis manuellement pour chaque poisson photographié pour obtenir le plus grand nombre d’images avec une mise au point optimale.</li>
	<li>Imagez le poisson de contrôle DMSO avant le poisson traité par la drogue afin que le temps d’exposition approprié puisse être réglé dans le logiciel d’imagerie. Une fois l’exposition définie, ne modifiez pas le temps d’exposition pour la durée de l’expérience. REMARQUE: L’accent peut être ajusté manuellement pour chaque poisson zèbre pour s’assurer qu’il n’y a pas d’images floues, ou pour l’imagerie entièrement automatisée, la même mise au point peut être utilisée entre les poissons avec des images floues jetées ou le poisson réimaged avant d’effectuer l’analyse. En outre, cette expérience pourrait être menée en utilisant n’importe quel imageur fluorescent suivi par la quantification de la fluorescence à l’aide du logiciel ImageJ.</li>
</ol>6. Quantifier la fluorescence à l’aide d’ImageJ
<ol><li>Logiciel Open ImageJ.</li>
	<li>
Aller au fichier (fr) Ouvrez et sélectionnez le fichier .czi souhaité. Le logiciel mettra en place une fenêtre d’options d’importation.
	<ol>
<li>Pour la visualisation de pile sélectionner Hyperstacks, vérifier les fichiers ouverts individuellement, vérifier Autoscale, et vérifier les canaux split. Pour l’option de couleur sélectionnez Colorized.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cliquez sur Plugins (fr) Macros Enregistrement.</li>
	<li>Cliquez sur l’image (fr) Ajuster Seuil. Sélectionnez le type d’image en rouge dans le menu de dépôt sur le côté droit de la fenêtre de seuil. Ajuster le seuil minimum jusqu’à ce que le logiciel ne souligne que les zones à fluorescence(figure 3A) et cliquez sur Appliquer. Le logiciel convertira la photo en noir et blanc, avec la zone sélectionnée en noir. REMARQUE: Utilisez le même seuil pour chaque image dans l’écran de drogue pour garder les résultats standardisés et comparables.</li>
	<li>Cliquez sur Analyse de l’analyse Mesure. Le logiciel tirera vers le haut d’une fenêtre de résultats contenant la zone fluorescente pour cette image.</li>
	<li>Cliquez sur Créer sur la fenêtre Macro Recorder. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec le code pour la macro. Mettez en évidence toutes les images souhaitées pour l’analyse et ouvrez comme dans l’étape 6.2.</li>
	<li>Sélectionnez Exécuter sur la fenêtre avec la macro. La fenêtre de résultats contiendra désormais la zone pour chaque image. REMARQUE: L’analyse d’image peut être faite individuellement sans enregistrer et exécuter une macro ainsi qu’en répétant les étapes ci-dessus pour chaque image.</li>
	<li>Copiez les données mesurées en feuille de calcul. Moyenne de la fluorescence totale de tous les échantillons témoins (DMSO). Calculer la différence de pourcentage à l’aide de la formule suivante : [(zone DMSO moyenne - zone expérimentale)/zone DMSO moyenne] x 100%(figure 3B).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous avons démontré une méthode normalisée pour la décongélation et l’injection des cellules laucémiques des patients primaires dans le poisson zèbre comme modèle de xénogreffe. Nous avons également établi un protocole pour le dépistage à haut débit des poissons zèbres xénogreffes à l’aide d’une unité d’imagerie équipée d’un microscope à fluorescence et d’une unité d’échantillonneur automatisé. Précédemment, des xénogreffes ont été rapportées avec des lignées cellulaires humaines, et la quantification d...

Xenografting des cancers primaires de patient ou des lignées humaines de cellules cancéreuses dans les organismes modèles est une technique largement utilisée pour étudier la progression et le comportement de tumeur in vivo, la réponse de tumeur au traitement de drogue, et l’interaction de cellules cancéreuses avec le microenvironnement, entre autres. Traditionnellement, les cellules sont xénogreffées dans des souris immunodéprimées, ce qui reste la norme sur le terrain. Cependant, ce système modèle a plusieurs limitations, telles que le coût élevé, les nombres bas de réplique, les difficultés à quantifier avec précision la charge de tumeur in vivo, et le temps prolongé qu’il faut pour que les tumeurs à l’engraft et le test de drogue pour être accompli. Ces dernières années, le poisson zèbre est apparu comme un modèle alternatif de xénogreffe, avec le premier signalé en 2005, avec des lignées de cellules de mélanome humain étiquetées protéine fluorescente verte (GFP) transplantées dans des embryons de stade blastule1,2. Plus récemment, 2 jours après la fertilisation (dpf) larves de poisson zèbre ont été utilisés comme destinataires de xénogreffe pour permettre le contrôle de l’emplacement anatomique de l’injection et pour une utilisation dans l’imagerie in vivo à haute résolution de l’interaction tumorale avec le microenvironnement environnant3,4.
Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que modèle de xénogreffe. Tout d’abord, le poisson zèbre adulte peut être logé et rapidement élevé en grandes quantités à un coût relativement faible. Chaque paire d’accouplement de poissons zèbres adultes peut produire des centaines de poissons larvés par semaine. En raison de leur petite taille, ces poissons zèbres larvaires peuvent être maintenus dans des plaques de 96 puits pour le dépistage des médicaments à haut débit. Les larves n’ont pas besoin d’être nourries au cours d’une expérience typique de xénogreffe, car leur jaune-sac fournit les nutriments pour les soutenir pour leur première semaine de vie. En outre, les poissons zèbres n’ont pas un système immunitaire entièrement fonctionnel jusqu’à 7 dpf, ce qui signifie qu’ils ne nécessitent pas d’irradiation ou de régimes immunosuppresseurs avant l’injection de xénogreffe. Enfin, les lignes de poissons zèbres optiquement claires permettent l’imagerie à haute résolution des interactions tumeur-microenvironnement.
Peut-être l’application la plus prometteuse du poisson zèbre comme modèle de xénogreffe est la capacité d’effectuer le dépistage de médicaments à haut débit sur des échantillons de cancer humain d’une manière qui n’est pas possible en utilisant tout autre organisme modèle. Les larves absorbent les médicaments de l’eau à travers la peau, améliorant la facilité de l’administration de la drogue5. Étant donné que les animaux sont maintenus dans des assiettes de 96 puits, généralement dans 100 à 300 ll d’eau, les écrans nécessitent des quantités de médicaments plus petites que chez les souris. Actuellement, il existe plusieurs méthodes différentes pour la normalisation et la quantification de l’effet des médicaments sur le fardeau tumoral humain chez les poissons zèbres, dont certains sont plus pratiques que d’autres pour l’échelle des tests de dépistage de drogues simples à haut débit de dépistage. Par exemple, certains groupes dissocient les poissons en suspensions à cellule unique, et quantifient les cellules tumorales étiquetées fluorescentes ou tachées en imagerie des gouttelettes individuelles de la suspension et en quantifiant la fluorescence à l’aide d’une macro4imageJ semi-automatisée. Une méthode semi-automatisée d’imagerie des larves entières a été mise au point dans laquelle les poissons larvaire ont été fixés dans des plaques de 96 puits et photographiés à l’aide d’un microscope fluorescent inversé avant le réalignement des images composites et la quantification des foyers de cellules tumorales6. Ces deux essais sont des méthodes assez laborieuses pour la quantification, qui a rendu le dépistage de médicaments vraiment à haut débit dans les modèles de xénogreffe de poisson zèbre impraticable.
Cette question a été abordée par le développement de la technologie de dépistage automatisé des vertébrés (VAST) Bioimager et Large Particle (LP), une unité d’imagerie équipée d’un microscope à fluorescence et une unité d’échantillonneur automatisé(figure 1 et tableau des matériaux), qui est une méthode vraiment automatisée pour l’imagerie à haut débit des larves de poissons zèbres7,8,9. Avec cette unité, les poissons sont anesthésiés, échantillonnés automatiquement à partir d’une plaque de 96 puits, placés dans un capillaire et tournés dans l’orientation définie en fonction d’une préférence préétablique de l’utilisateur, photographié, puis soit remis dans le même puits d’une nouvelle plaque de 96 puits pour d’autres études ou jeté. La combinaison de cette technologie d’imagerie avec des xénogreffes de poisson zèbre peut permettre la possibilité d’un médicament personnalisé qui utilise le dépistage de médicaments à haut débit des grandes bibliothèques de composés de médicaments contre les tumeurs individuelles des patients. Les xénogreffes de poisson zèbre offrent également une méthode à grande échelle et à faible coût pour tester à la fois la toxicité et l’efficacité de nouveaux composés in vivo. Le poisson zèbre peut être utilisé comme étape préliminaire de dépistage avant de passer aux modèles de xénogreffe de souris.
Nous avons développé un flux de travail simplifié pour les cellules de leucémie des patients primaires de xenografting dans le poisson zèbre et effectuant des écrans de drogue à haut débit avec l’imagerie automatisée et la quantification, qui peuvent être appliquées à n’importe quelles autres cellules tumorales de patient primaire ou ligne de cellules cancéreuses. Ce flux de travail a utilisé une unité d’imagerie équipée de microscope de fluorescence et une unité d’échantillonneur automatisée pour améliorer les méthodes actuelles de normalisation et de quantification et offre une alternative automatisée aux méthodes précédentes et plus laborieuses de quantification de la masse tumorale in vivo.

<table><tbody><tr><td>10x TBE Liquid Concentrate</td><td>VWR</td><td>0658-5L</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 96 puits, fond plat</td><td>CELLTREAT</td><td>229195</td><td>VAST est compatible avec une variété de plaques standard ou profondes à 24, 48 ou 96 puits</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilicaté sans filament</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-EI126-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>Média</td><td></td> E3 <td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Embouts de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (Premium Heat Inactivated)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIJI</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://imagej.net/Fiji <tr><td>Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36150</td><td></td></tr><tr><td>Sampler de grosses particules (LP) Union</td><td>Biometrica</td><td>N/A</td><td>Unité d’échantillonnage automatisée http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td></tr><tr><td>Huile minérale de méthotrexate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10MG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (1x)</td><td>Caisson labs</td><td>PBL06-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Micromètre à platine (400 étage)</td><td>Hausser Scientific</td><td>400-S</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair Aquatic</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VAST Bioimager</td><td>Union Biometrica</td><td>N/ Une</td><td>unité d’imagerie microscope équipée d’une fluorescence https://www.unionbio.com/vast/</td></tr> <tr><td>Vincristine Sulfate</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T117-0005</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>Stain Thermo Fisher</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Les modèles de xénogreffe dérivés des patients sont essentiels pour définir comment différents cancers réagissent au traitement médicamenteux dans un système in vivo. Les modèles de souris sont la norme dans le domaine, mais le poisson zèbre a émergé comme un modèle alternatif avec plusieurs avantages, y compris la capacité pour le haut débit et le dépistage des médicaments à faible coût. Le poisson zèbre permet également le dépistage in vivo des médicaments avec un grand nombre de répliques qui n’étaient auparavant disponibles qu’avec des systèmes in vitro. La capacité d’effectuer rapidement des écrans de médicaments à grande échelle peut ouvrir la possibilité de la médecine personnalisée avec une traduction rapide des résultats de retour à la clinique. Les modèles de xénogreffe de poisson-zèbre pourraient également être employés pour dépister rapidement des mutations actionnables basées sur la réponse tumorale aux thérapies ciblées ou pour identifier de nouveaux composés anticancéreux des grandes bibliothèques. La principale limitation actuelle dans le domaine a été la quantification et l’automatisation du processus afin que les écrans de drogue puissent être effectués à plus grande échelle et être moins exigeants en main-d’œuvre. Nous avons mis au point un flux de travail pour les échantillons primaires de patients de xenografting dans les larves de poissons zèbres et effectuant des écrans de drogue à grande échelle utilisant une unité d’imagerie équipée de microscope de fluorescence et unité automatisée d’échantillonneur. Cette méthode permet la normalisation et la quantification de la zone tumorale engrafted et la réponse au traitement de drogue à travers un grand nombre de larves de poisson zèbre. Dans l’ensemble, cette méthode est avantageuse par rapport au dépistage traditionnel des médicaments de culture cellulaire car elle permet la croissance des cellules tumorales dans un environnement in vivo tout au long du traitement de drogue, et est plus pratique et rentable que les souris pour les écrans de drogue in vivo à grande échelle.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, le poisson zèbre a été xénogrefted dans le jaune et le péricarde avec le patient primaire PBMCs qui ont été à l’origine isolés d’un T-cellule aigue patiente de leucémie lymphoblastique (T-ALL) patient au diagnostic et incliné comme un échantillon viable et congelé. À 48 hpi, les poissons xénogreffiés ont été examinés pour les cellules tumorales étiquetées fluorescentes(figure 2C,D) et traités avec la chimiothérapie (dexaméthasone ou vin...

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Notre flux de travail de dépistage des médicaments contre la xénogreffe du poisson zèbre permet l’imagerie automatisée et la quantification des cellules cancéreuses humaines et leur réponse au traitement médicamenteux. Il peut être utilisé pour tester rapidement la réponse des cellules cancéreuses d’une patience à des médicaments connus ou pour identifier de nouveaux composés anticancéreux. L’utilisation de modèles xénographiques de poisson zèbre et de dépistage des médicaments permet d’obtenir des nombres réplicateurs Inviva qui n’étaient auparavant disponibles qu’avec des systèmes in vitro.Il est également beaucoup plus rentable que les modèles de souris lors du criblage à travers de grandes bibliothèques de composés. Ce flux de travail a plusieurs étapes de l’interjection des cellules cancéreuses chez le poisson zèbre à l’imagerie de la réponse médicamenteuses qui sont mieux apprises par la démonstration visuelle. Pour commencer, centrifugeuse un minimum de deux fois 10 à la sixième cellule en cinq millimètres de PBS à 200 fois g pendant cinq minutes, et aspirer le supernatant.Resuspendez la palette cellulaire en cinq millimètres de solution de coloration dii. Incuber les cellul

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Xénogreffe dérivée d’un patient de poisson-zèbre (zPDX) : un modèle de cancer

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Dépistage du mélanome Modificateurs l&#39;aide d&#39;un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone

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Prédiction rapide de la réponse médicamenteuse in vivo à l’aide de greffes de cellules leucémiques dans des embryons de poisson-zèbre

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Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

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