Name: Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez une méthode pour évaluer en temps réel la migration et l'invasion des cellules de glioblastome U-118MG sans coloration ni marqueurs fluorescents. Cette approche permet d'étudier les effets des traitements sur la métastase cancéreuse.

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Nous remercions Olivia Funk pour son assistance technique aux données du système d’analyse cellulaire en temps réel. Nous remercions également le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City d’avoir édité ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (à TP) et par children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Council funding (to TP).

REMARQUE: Tous les matériaux de culture cellulaire doivent être stériles et toute l’expérience doit être effectuée dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles.
1. Culture et électroporation de la lignée cellulaire U-118MG Glioblastoma
<ol><li>Culture la lignée cellulaire U-118MG dans le sérum bovin fœtal (FBS) à 5 % contenant le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco (milieu culturel) et maintenue à 37 oC dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2 incubateur (conditions culturelles).</li>
	<li>Utilisez des cellules saines confluentes de 70 à 80 % pour l’électroporation.</li>
	<li>Pour la récolte des cellules, laver les cellules qui poussent dans des plats de culture avec 1x PBS et ajouter 2 ml de trypsin-EDTA de 0,05%. Placer dans l’incubateur pendant 30 s et retirer la trypsin-EDTA. Recueillir des cellules dans le milieu de la culture dans un tube de 15 mL.</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé de poche, des cellules centrifuges à 100 x g pendant 5 min, et jetez le supernatant.</li>
	<li>Suspendre la pastille cellulaire dans le milieu de la culture et prendre 600 000 cellules pour chaque condition dans un tube de microcentrifuge. Ajuster le nombre de cellules en fonction des conceptions expérimentales et des taux de croissance.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge et ajouter 800 L de la solution saline tamponnée par le phosphate (DPBS) de Dulbecco. Vers le bas à l’aide d’une minicentrifugeuse pour 30 s et jeter le supernatant.</li>
	<li>Ajoutez 60 l de tampon de résuspension R à la pastille cellulaire et ajoutez les siARN (c.-à-d. siRNA non-ciblage, Crk siRNA, CrkL siRNA, ou les deux siRNAs Crk et CrkL) à une concentration de 6 m au tube de microcentrifuge respectif. Mélangez-les doucement en tapant.</li>
	<li>Électroporé 10 L de cellules avec un système d’électroporation à 1.350 V pour 10 ms avec trois impulsions et transférer les cellules électropolées dans 5 mL du milieu de culture. Répétez l’électroporation pour le reste des cellules préparées pour chaque condition.</li>
	<li>Complétez toutes les électroporations respectives. Transférer les cellules électropolées dans deux plats de 35 mm par condition et les culturer dans des conditions culturelles pendant 3 jours.</li>
	<li>Le troisième jour, traiter toutes les cellules électropolées dans 0,5% FBS contenant DMEM (milieu de sérum faible) pendant 6 h avant la mesure réelle de l’impédance cellulaire.</li>
</ol>2. Préparation du système d’analyse cellulaire en temps réel, des plaques d’invasion et de migration cellulaires (ICM) et des cellules U-118MG électropolées pour le platage
<ol><li>Placez le système d’analyse cellulaire en temps réel dans un incubateur de CO2 dans des conditions culturelles de 5 à 6 h avant le début de l’expérience pour stabiliser le système aux conditions de culture.</li>
	<li>Pour l’essai d’invasion, la plaque 50 L de DMEM (moyen uni) contenant le gel de matrice extracellulaire (ECM) à 0,1 g/l dans chaque puits de la chambre haute de la plaque de l’ICM. Pour éviter d’avoir des bulles d’air, utilisez la méthode de tuyauterie inversée. Retirez immédiatement 30 L de gel ECM, en laissant 20 ll dans le puits.</li>
	<li>Après le revêtement de gel ECM, garder l’assiette dans l’incubateur dans des conditions de culture pendant 4 h avec son couvercle allumé. Pendant le revêtement et le séchage du gel ECM, prenez des mesures préventives pour éviter le contact direct des électrodes de la chambre haute des plaques avec les mains, les surfaces de l’armoire de biosécurité, ou l’incubateur de CO2.</li>
	<li>Pour configurer le programme de mesure de l’impedance, cliquez deux fois sur l’icône logicielle associée (voir Tableau des matériaux) pour ouvrir l’application logicielle du système (unité de contrôle). Chaque berceau dispose d’une fenêtre individuelle avec des onglets différents pour définir les conditions expérimentales, l’impédance mesurant l’intervalle de temps et la durée, et l’analyse des données.</li>
	<li>Sous l’onglet Layout, placez les puits quadruplicate pour chaque affection biologique et définissez les mesures d’impédance cellulaire en deux étapes sous l’onglet Annexe. La première étape est pour une mesure de base unique (un balayage avec un intervalle de 1 min), et la deuxième étape consiste à mesurer l’impédance cellulaire dans les berceaux individuels respectifs pour une expérience réelle. Pour la migration, utilisez 145 balayages avec un intervalle de 10 minutes, et pour l’invasion, 577 balaye avec un intervalle de 10 minutes, individuellement mis) dans les berceaux individuels respectifs.</li>
	<li>Un h avant le début de la mesure de l’impédance cellulaire, ajouter 160 L de DMEM avec 10% FBS comme chimioattractant dans les puits de la chambre basse de la plaque. Assembler soit la chambre haute contenant les puits enduits de gel ECM ou les puits non revêtus avec la chambre basse pour mesurer l’invasion et la migration, respectivement.</li>
	<li>Remplissez les puits de la chambre haute de 50 l de milieu de sérum bas et placez-les dans le berceau du système. Vérifiez si tous les puits sont reconnus par l’unité de contrôle en cliquant sur l’onglet Message. Si le message s’affiche comme OK, la plaque dans le berceau est prête pour l’expérience.</li>
	<li>Préinventer les plaques complètement emballées dans l’incubateur dans des conditions de culture pendant 1 h avant les mesures dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel, qui est essentiel pour l’aclimatation d’une plaque emballée aux conditions de culture cellulaire.</li>
	<li>Pour la récolte des cellules traitées avec un milieu de sérum bas, trypsiniser les cellules comme dans l’étape 1.3, les recueillir dans le milieu de sérum bas, et compter les cellules comme dans l’étape 1.4.</li>
	<li>Après le comptage, les cellules de centrifugeuses à 100 x g pendant 5 min et jettent le supernatant.</li>
	<li>Résuspendez 800 000 cellules dans 800 l de milieu de sérum bas pour les essais de migration et d’invasion. De plus, réutilisez 300 000 cellules dans un milieu de culture et des graines de 2 ml dans un plat de 35 mm pour l’analyse des taches occidentales afin de confirmer le knockdown réglementé de Crk et CrkL.</li>
</ol>3. Lecture de base, ensemencement des cellules et mesure et visualisation de l’impédance cellulaire
<ol><li>Mesurez la lecture de base en cliquant sur le bouton De démarrage du berceau. La ligne de base doit être lue après avoir préincubé les plaques pendant 1 h dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel dans des conditions de culture dans l’incubateur de CO2 et avant d’ensemencer les cellules aux puits respectifs de la chambre haute. REMARQUE: Une fois que le bouton De démarrage du berceau est cliqué, l’unité de contrôle se demandera s’il y a à enregistrer le fichier expérimental. Une fois le fichier enregistré, l’analyseur de berceau mesure l’impédance cellulaire de base telle qu’elle est définie dans le programme au départ et entre en mode pause jusqu’à ce que le bouton De démarrage du berceau soit cliqué à nouveau pour mesurer l’impédance cellulaire dans la deuxième étape.</li>
	<li>Prenez les deux plaques pour la migration et l’invasion des berceaux après la mesure de base et gardez-les dans l’armoire de biosécurité.</li>
	<li>Graine 100 L de cellules (100 000 cellules) dans les quadruplicates pour chaque état biologique de la chambre haute de la plaque de l’ICM dans les puits respectifs, comme programmé dans l’unité témoin du berceau en faisant marche arrière pour éviter les bulles d’air.</li>
	<li>Après l’ensemencement, garder la plaque sous une armoire de biosécurité pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément vers le bas. Transférer la plaque vers le berceau respectif et cliquez sur le bouton de démarrage du berceau pour commencer à mesurer l’impédance cellulaire comme programmé dans la deuxième étape de 2,5.</li>
	<li>Après le dernier balayage, l’expérience est terminée, et les résultats sont enregistrés automatiquement.</li>
	<li>Sous l’onglet Analyse des données, visualisez les changements dans l’impédance cellulaire en tant qu’index cellulaire d’une manière dépendante du temps pendant ou après la fin de l’expérience. Chacune des conditions respectives des quadruplicates peut être visualisée individuellement ou en moyenne et/ou en cliquant sur les cases Option pour un écart moyen et standard.</li>
	<li>Pour exporter des données d’index cellulaires vers un fichier de feuilles de calcul, ouvrez un fichier de tableur vide, placez le curseur au milieu de la fenêtre d’analyse des données et cliquez à droite. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, choisissez l’option Copy Data dans le format de listeet collez les données dans la feuille de calcul ouverte.</li>
	<li>Ajuster le temps dans les données brutes pour représenter l’heure de début réelle de la mesure de l’obstacle cellulaire. L’heure de début de la deuxième étape est définie comme nulle. REMARQUE: L’unité témoin a la possibilité d’obtenir l’index cellulaire avec ou sans normalisation (c.-à-d. l’indice cellulaire normalisé) et de visualiser les résultats comme une présentation graphique d’une manière dépendante du temps. Dans cet exemple, les données de l’index cellulaire sont exportées sans normalisation pour le traitement et la présentation graphique.</li>
	<li>Relâchez l’expérience en cliquant sur le bouton Libération dans chaque berceau.</li>
</ol>

<ol><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+%28Crk%29+and+Crk-like+%28CrkL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li>
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<li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74(2012).</li>
<li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li>
<li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li>
<li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li>
<li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li>
<li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li>
<li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La mesure en temps réel de la migration cellulaire et de l’invasion à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel est un processus de surveillance simple, rapide et continu avec des avantages multiples et significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles qui fournissent des données à un moment donné. Comme pour les méthodes traditionnelles, les conditions expérimentales doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire pour le système d’analyse cellulaire en temps réel, car chaque lignée cellulaire peut...

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. La détermination des génotypes et des phénotypes du cancer est essentielle à la compréhension et à la conception de stratégies thérapeutiques efficaces. Des décennies de recherche sur le cancer ont mené au développement et à l’adaptation de différentes méthodes pour déterminer les génotypes et les phénotypes du cancer. L’un des derniers développements techniques est la mesure en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion basée sur l’impédance cellulaire. L’adhérence cellulaire aux substrats et aux contacts cellulaires joue un rôle important dans la communication et la régulation des cellules à cellule, le développement et l’entretien des tissus. Les anomalies dans l’adhérence cellulaire conduisent à la perte de contact cellule-cellule, la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM), et le gain des capacités migratrices et envahissantes par les cellules, qui contribuent tous à la métastase des cellules cancéreuses à différents organes1,2. Diverses méthodes sont disponibles pour déterminer la migration cellulaire (cicatrisation des plaies et les essais de chambre Boyden) et l’invasion (Matrigel-Boyden chamber assay)3,4,5. Ces méthodes conventionnelles sont semi-quantitatives parce que les cellules doivent être étiquetées avec un colorant fluorescent ou d’autres colorants avant ou après l’expérience pour mesurer les phénotypes cellulaires. En outre, des perturbations mécaniques sont nécessaires dans certains cas pour créer une plaie pour mesurer la migration des cellules vers le site de la plaie. En outre, ces méthodes existantes sont longues, à forte intensité de main-d’œuvre, et mesurent les résultats à un moment donné. En outre, ces méthodes sont sujettes à faire des mesures inexactes en raison de la manipulation incohérente au cours de la procédure expérimentale6.
Contrairement aux méthodes conventionnelles, le système d’analyse cellulaire en temps réel mesure l’impédance cellulaire en temps réel sans nécessiter de dommages pré- ou post-posts et mécaniques des cellules. Plus important encore, la durée d’une expérience peut être prolongée afin que les effets biologiques puissent être déterminés d’une manière dépendante du temps. L’exécution de l’expérience est efficace dans le temps et n’est pas exigeante en main-d’œuvre. L’analyse des données est relativement simple et précise. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode est l’une des meilleures mesures en temps réel pour mesurer la migration cellulaire et l’invasion6,7,8,9.
Giaever et Keese ont été les premiers à décrire la mesure basée sur l’impedance d’une population cellulaire à la surface des électrodes10. Le système d’analyse cellulaire en temps réel fonctionne sur le même principe. La superficie de chaque puits de microplaque est couverte à environ 80 % d’une gamme de microélectrtrodes en or. Lorsque la surface de l’électrode est occupée par des cellules en raison de l’adhérence ou de la propagation des cellules, l’obstacle électrique change. Cet obstacle est affiché comme l’indice cellulaire, qui est directement proportionnel aux cellules couvrant la surface de l’électrode après qu’ils pénètrent dans la membrane microporous (la taille médiane de pores de cette membrane est de 8 m)11.
Crk et CrkL sont des protéines adaptatrices contenant des domaines SH2 et SH3 et jouent des rôles importants dans diverses fonctions cellulaires, telles que la régulation du cytosquelette, la transformation cellulaire, la prolifération, l’adhérence, la transition épithéliale-mésenchymale, la migration, l’invasion et la métastase en médiateur des interactions protéines-protéines dans de nombreuses voies de signalisation1,12,13,14,15,16 ,16, 17, 18. Par conséquent, il est important de déterminer les capacités migratrices et invasives dépendantes de Crk/CrkL des cellules cancéreuses. L’analyse de cellules en temps réel a été effectuée pour déterminer les capacités migratrices et invasives des cellules de glioblastoma sur le knockdown de gène de Crk et de CrkL.
Ce document de méthode décrit des mesures détaillées de la migration et de l’invasion de cellules de glioblastome humain.

<table><tbody><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1300 Series Classe II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>Plaques CIM</td><td>Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>Plaques d’invasion et de migration cellulaires</td></tr><tr><td>Crk siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>J-010503-10</td><td></td></tr><tr><td>CrkL siRNA</td><td>Ambion</td><td>ID : 3522 et ID : 3524</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s aigle modifié' milieu (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>302002</td><td>Milieu de culture utilisé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS utilisé pour laver les cellules</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 incubateur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030285</td><td>CO2 incubateur</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>Gel matriciel extracellulaire</td></tr><tr><td>Système d’électroporation au néon</td><td>ThermoFisher Scientific</td> MPK5000 <td>Système d’électroporation</td><td></td></tr><tr><td>Système de transfection au néon 10 &micro ; L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>Kit d’électroporation</td></tr><tr><td>SiRNA non ciblé</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-01</td><td>siRNA pour contrôle non targated</td></tr><tr><td>Odyssey CLx (système d’imagerie)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Système d’imagerie Western blot</td></tr><tr><td>Logiciel RTCA</td><td>Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc</td><td></td><td>Instrument utilisé pour l’expérience</td></tr><tr><td>Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>Compteur de cellules automatisé portable</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>U-118MG</td><td></td><td>ATCC ATCC HTB15</td><td>Lignées cellulaires utilisées pour les expériences</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc</td> 380601050 <td>Instrument utilisé pour l’expérience</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Le cancer survient en raison de la prolifération incontrôlée des cellules initiées par l’instabilité génétique, les mutations, et l’environnement et d’autres facteurs de stress. Ces anomalies acquises dans les réseaux de signalisation moléculaire complexes et multicouches induisent la prolifération et la survie aberrantes de cellules, la dégradation extracellulaire de matrice, et la métastase aux organes éloignés. On estime qu’environ 90 % des décès liés au cancer sont causés par les effets directs ou indirects de la dissémination métastatique. Par conséquent, il est important d’établir un système très fiable et complet pour caractériser les comportements des cellules cancéreuses sur les manipulations génétiques et environnementales. Un tel système peut donner une compréhension claire de la régulation moléculaire des métastases cancéreuses et la possibilité de développer avec succès des stratégies thérapeutiques stratifiées et précises. Par conséquent, une détermination précise des comportements des cellules cancéreuses telles que la migration et l’invasion avec gain ou perte de fonction du gène(s) permet d’évaluer la nature agressive des cellules cancéreuses. Le système de mesure en temps réel basé sur l’impédance cellulaire permet aux chercheurs d’acquérir continuellement des données au cours d’une expérience entière et de comparer et de quantifier instantanément les résultats dans diverses conditions expérimentales. Contrairement aux méthodes conventionnelles, cette méthode ne nécessite pas de fixation, de coloration et de traitement d’échantillon pour analyser les cellules qui migrent ou envahissent. Ce document de méthode met l’accent sur les procédures détaillées pour la détermination en temps réel de la migration et l’invasion des cellules cancéreuses de glioblastome.

Il a été suggéré que Crk et CrkL sont importants pour la migration cellulaire et l’invasion dans différentes lignées de cellules cancéreuses13,17. Bien que les protéines Crk et CrkL soient structurellement et fonctionnellement semblables les unes aux autres et jouent les fonctions de chevauchement essentielles16,19,20,21, beaucoup d’étu...

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. Déterminer la capacité des cellules cancéreuses à migrer et à envahir dans diverses conditions de traitement est crucial pour évaluer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole présente une méthode pour évaluer les capacités métastatiques en temps réel d’une lignée de cellules cancéreuses de glioblastome.

Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

En utilisant ce protocole, la migration cellulaire et l’invasion peuvent être dévoilées dans des conditions en temps réel permettant de déterminer la cinétique cellulaire sous perte ou gain de fonction génétique et de médicaments. Contrairement à d’autres méthodes, aucune coloration, dommages cellulaires mécaniques, ou marqueurs fluorescents nécessaires. Plus important encore, la cinétique cellulaire en temps réel peut être déterminée d’une manière efficace.Lorsque la culture de la lignée cellulaire U-118MG atteint 70 à 80% de confluence, laver les cellules avec PBS avant de traiter les cellules avec deux millilitres de 0,5% trypsine-EDTA. Après 30 secondes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de culture frais et transférer les cellules détachées à un tube conique de 15 millilitres. Après comptage, recueillir les cellules par centrifugation et résuspendre la pastille dans un six fois 10 à la cinquième cellule par concentration de condition dans le volume approprié de milieu frais.Transférer six fois 10 à la cinquième cellule dans un tube de microcentrifugeuse par condition et ajouter 800 microlitres de PBS de Dulbecco à chaque tube. Après centrifugation, resuspendez chaque granulé dans 60 microlitres de r tampon de resuspension et six micromolaires du siRNA d’intérêt. Mélanger chaque tube avec un taraudage doux avant d’électroporer 10 aliquots microlitres de chaque suspension cellulaire avec trois impulsions de 10 millisecondes 1, 350 volts.Après chaque traitement, mettre en commun les cellules électroporées de chaque condition dans des aliquots individuels de cinq millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, ensemencer les cellules en deux plats de culture de 35 millimètres par condition et placer les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Cinq à six heures avant l’analyse cellulaire en temps réel, placez le système d’analyse cellulaire en temps réel dans l’incubateur de culture cellulaire.Pour mettre en place un test d’invasion, utilisez le pipetage inversé pour placer 50 microlitres de DMEM complétés par 0,1 microgramme par millilitre de gel matriciel extracellulaire dans chaque puits de la chambre haute d’une plaque d’invasion cellulaire. Immédiatement après le placage, retirez 30 microlitres de la solution de matrice extracellulaire de chaque puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. Pour mettre en place un programme de mesure de l’impédance, six heures avant la mesure, remplacez le milieu dans toutes les cultures cellulaires électroporées par un milieu sérique faible.Sous l’onglet Mise en page dans le logiciel de mesure d’impédance associé, sélectionnez des puits quadruplicate pour chaque condition biologique. Sous l’onglet Annexe, définissez une étape unique de balayage de mesure de base avec un intervalle d’une minute et définissez une deuxième étape pour mesurer l’impedance cellulaire dans les berceaux individuels respectifs pour l’expérience proprement dite. Une heure avant le début de la mesure de l’impédance cellulaire, ajouter 160 microlitres de milieu complétés par 10% de sérum bovin fœtal comme chimioattractant dans les puits de la chambre inférieure de la plaque d’invasion cellulaire et de migration.Pour mesurer l’invasion, assemblez la chambre haute contenant les puits enduits de gel matriciel extracellulaire. Pour mesurer la migration, utilisez des puits non encoated dans la chambre haute. Pour l’un ou l’autre type d’expérience, remplissez les puits de la chambre haute de 50 microlitres de milieu sérique faible et placez les chambres dans le berceau du système.Cliquez sur l’onglet Message dans le logiciel pour déterminer si tous les puits sont reconnus par l’unité de contrôle. Si le message s’affiche comme prévu, la plaque dans le berceau est prête pour l’expérience. Ensuite, placez les plaques complètement emballées dans l’incubateur de culture cellulaire dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel pendant une heure pour acclimater la plaque aux conditions de culture cellulaire.Pendant que les plaques équilibrent, récoltez les cellules de glioblastome comme démontré et résuspendez les cellules de chaque condition à huit fois 10 à la cinquième cellule par 800 microlitres de faible concentration moyenne de sérum. En outre, réserver trois fois 10 à la cinquième cellule en deux millilitres de milieu de culture pour l’ensemencement dans un plat de 35 millimètres pour l’analyse des taches occidentales en aval. Pour mesurer la lecture de base avant la migration, à la fin de l’acclimatation, cliquez sur le bouton Démarrer du berceau.Une fois la mesure de base acquise, transférez les plaques de migration et d’invasion de leurs berceaux respectifs dans un cabinet de biosécurité. Pipette inverse 100 microlitres de cellules dans les puits de chambre supérieure quadruplicate pour chaque condition biologique dans le puits approprié des plaques d’invasion et de migration cellulaires tel que programmé dans l’unité de contrôle du berceau. Après l’ensemencement, conserver les plaques dans l’armoire de biosécurité pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément sur le fond de la plaque avant de transférer les plaques à leurs berceaux respectifs.Cliquez sur le bouton démarrer du berceau pour commencer à mesurer l’impédance cellulaire. Pour visualiser les changements dans l’impedance cellulaire en tant qu’index cellulaire d’une manière dépendante du temps pendant ou après la fin de l’expérience, ouvrez l’onglet Analyse de données. Pour visualiser les données pour chacune des conditions respectives individuellement ou en moyenne et/ou en écarts types, cliquez sur les boîtes d’options pour obtenir un écart moyen et type.Pour exporter les données de l’index cellulaire vers un fichier de feuille de calcul, placez le curseur au milieu de la fenêtre d’analyse des données et cliquez à droite. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, sélectionnez les données de copie dans l’option format liste et coller les données dans une feuille de calcul ouverte. Pour libérer l’expérience, cliquez sur le bouton Libération dans chaque berceau.Crk adaptateur protéine knockdown diminue les niveaux de protéines Crk1 et Crk2 de 85% et 86%, respectivement, sans induire des niveaux de protéines crk-like. Le knockdown de Crk-like réduit l’expression de protéine crk-like de 85%avec de légères réductions des niveaux de protéine de Crk1 et de Crk2. La combinaison des deux siRNAs réduit l’expression crk1, crk2 et crk-like de plus de 80%, tandis que ni vinculin ni expression alpha-tubulin n’est affectée par n’importe quelle combinaison de Crk ou Crk-like knockdown.Les cellules du glioblastome cérébral humain migrent le long d’un gradient en réponse à des concentrations élevées de sérum atteignant le niveau maximum de migration à 13 heures. Dans les cellules knockdown Crk, bien que la migration soit initialement retardée, les cellules ont continué à migrer jusqu’à 23 heures. Crk-like knockdown réduit considérablement la migration cellulaire avec la lignée cellulaire du glioblastome complètement perdre leur capacité migratoire à la fois crk et crk-like suggérant que Crk et Crk-like jouent des rôles essentiels chevauchement dans la migration des cellules cancéreuses.Cependant, lorsque l’invasion cellulaire est surveillée sur plusieurs jours, les cellules knockdown Crk atteindre un niveau maximum similaire d’invasion cellulaire par rapport aux cellules de contrôle du glioblastome à 60 heures avec crk-like cellules partiellement récupérer leur capacité invasive de 90 heures et double cellules Crk-Crk démontrant une capacité réduite d’envahir après 40 heures. Les résultats appuient clairement la suggestion selon laquelle l’invasion cellulaire devrait être analysée pendant toute la durée de l’expérience. L’ensemencement du bon nombre de cellules et l’éviter les bulles d’air tout en enregistrant la matrice extracellulaire pour l’essai d’invasion et les cellules d’ensemencement sont des points clés pour le succès de cette expérience.Suivant la procédure semblable mais utilisant des e-plaques, l’adhérence cellulaire et la cinétique de prolifération cellulaire peuvent être déterminées.

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Une technique basée Impédance électrique en temps réel pour mesurer Invasion de monocouche de cellules endothéliales par les cellules cancéreuses

Cette vidéo décrit un test d’invasion utilisant un réseau à trois chambres basé sur l’impédance électrique. Cette technique mesure le potentiel invasif des cellules cancéreuses sous l’influence de facteurs solubles sécrétés par les cellules stromales résidentes dans les microenvironnements tumoraux.

Test d’impédance basé sur un réseau à trois chambres : une technique d’analyse en temps réel pour évaluer le potentiel invasif des cellules cancéreuses en mesurant l’impédance électrique

Source : Mudduluru, G., et. al. Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses basée sur l’impédance. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo présente un test basé sur l’impédance pour mesurer l’invasion et la migration des cellules de glioblastome. Les cellules dégradent la matrice extracellulaire, se déplacent à travers des membranes microporeuses et adhèrent aux électrodes, générant ainsi de l’impédance. Cette analyse en temps réel reflète leur potentiel invasif pour...

Mesures basées sur l’impédance de l’invasion des cellules cancéreuses du cerveau

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Ce protocole d'évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d'impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Nous décrivons une approche pour détecter et capturer des sous-populations cellulaires invasives en temps réel. La conception expérimentale utilise l’analyse cellulaire en temps réel en surveillant les changements dans l’impédance électrique des cellules. Le cancer invasif, les cellules immunitaires, endothéliales ou stromales dans les tissus complexes peuvent être capturés et l’impact des co-cultures peut être évalué.

Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

De nombreux gènes régulés à la hausse stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Il est essentiel de déterminer quels gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce protocole présente une méthode permettant d’étudier en temps réel les effets de l’augmentation de l’expression d’un gène sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.

Mesure quantitative en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales après une transfection d’ARNm synthétique

Nous démontrons ici la technique d’utilisation de biocapteurs basés sur l’impédance : ECIS et cellZscope, pour mesurer la force de la barrière endothéliale cérébrale. Nous détaillons la préparation et la technique d’ajout de divers stimuli à un modèle in vitro de l’endothélium cérébral. Nous mesurons, enregistrons et donnons une analyse représentative des résultats.

Mesure des changements dans l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale à l’aide de deux biocapteurs basés sur l’impédance en réponse aux cellules cancéreuses et aux cytokines

Découvrez une méthode pour évaluer en temps réel la migration et l'invasion des cellules de glioblastome U-118MG sans coloration ni marqueurs fluorescents. Cette approche permet d'étudier les effets des traitements sur la métastase cancéreuse.

Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

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