Name: Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Découvrez un modèle sphéroïde 3D pour étudier l'invasion du glioblastome dans le tissu cérébral sain. Cette méthode permet de quantifier la migration et la prolifération cellulaire avec précision.

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Ce travail a été soutenu par Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon est diplômé du CHU de Toulouse.

Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients (de l’hôpital Haukeland, Bergen, Norvège selon les règlements des comités d’éthique locaux). Notre protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche humaine de notre institution.
1. Génération de sphéroïdes de tumeur de taille uniforme
REMARQUE : Les cellules de tige-comme sont cultivées dans le milieu neurobasal complété avec le supplément de B27, l’héparine, FGF-2, la pénicilline, et la streptomycine, comme décrit dans les articles précédents12. Ces cellules forment spontanément des sphéroïdes dans la culture.
<ol><li>Laver les cellules tumorales avec 5 mL phosphate tamponné saline (PBS) et incuber les cellules avec 0,5-1 mL enzyme de dissociation (voir Tableau des matériaux) pendant 5 minutes à 37 oC.</li>
	<li>Laver avec 4-4,5 ml PBS et ajouter 10 ml du milieu de croissance complète (milieu neurobasal complet, cNBM).</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique avec du bleu trypan et d’une diapositive de chambre de comptage cellulaire.</li>
	<li>Pour générer 100 sphéroïdes avec 104 cellules par sphéroïde (selon la taille préférée), mélanger 106 cellules dans 8 ml de NBM avec 2 ml de méthylcellulose de 2 %.</li>
	<li>Transférer la suspension dans un contenant de système stérile et distribuer 100 L/puits avec une pipette multicanal dans une plaque inférieure ronde de 96 puits.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 oC, 5% de CO2 et 95% d’humidité. Des sphéroïdes de taille égale se formeront et peuvent être utilisés après 3-4 jours.</li>
</ol>2. Expériences tridimensionnelles
<ol><li>Prolifération<ol>
<li>Préparation<ol>
<li>Suspendre les inhibiteurs (p. ex., la roténone comme dans la figure 4A)et les produits chimiques dans 100 l de milieu et ajouter à la 100 L de milieu dans chaque puits (c.-à-d. un spheroid par puits).</li>
			<li>Incuber la plaque à 37 oC, 5% de CO2, et 95% d’humidité.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisition et analyse d’images<ol>
<li>Prenez des photos avec un microscope vidéo dans brightfield pour créer une série de conditions à T0 et les heures suivantes attendues.</li>
			<li>Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatique. Pour ce faire manuellement, dessiner un cercle autour du noyau sphéroïde avec l’outil de sélection à main levée et mesurer la zone de chaque sphéroïde. Pour analyser les images d’une manière semi-automatique, utilisez la macro montrée dans le document supplémentaire 1 avec //Zone centrale seulement.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invasion<ol>
<li>Préparation<ol>
<li>Préparer la matrice de collagène dans un tube sur glace avec du collagène de type I à 1 mg/mL de concentration finale, 1x PBS,collagène0,023xV , 1 M d’hydroxyde de sodium, et stérile H2O. Incubate la solution sur la glace pendant 30 min.</li>
			<li>Recueillir des sphéroïdes à partir de la plaque ronde de puits de fond dans des tubes de 500 L et laver 2x avec 200 L 1x PBS.</li>
			<li>Pipette les sphéroïdes soigneusement dans 100 L de la matrice de collagène et insérer au centre d’un puits dans la normale 96 plaques de puits.</li>
			<li>Incuber le gel de collagène pendant 30 min à 37 oC, puis ajouter le cNBM sur le gel. Les inhibiteurs ou les activateurs (p. ex., le chlorure d’hydrogène comme indiqué dans la figure 4B, 4C)peuvent être ajoutés au milieu à cette étape.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisition et analyse d’images<ol>
<li>Prenez des photos séquentiellement avec un microscope vidéo en mode brightfield 24 h après l’inclusion de collagène.</li>
			<li>Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatique. Pour ce faire manuellement, dessiner autour du noyau et la zone totale du sphéroïde avec l’outil de sélection à main levée et mesurer la zone invasive de chaque sphéroïde en soustrayant la zone totale avec la surface centrale. Pour analyser les images d’une manière semi-automatique, utilisez la macro comme indiqué dans le document supplémentaire 1 pour déterminer la zone invasive.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Migration<ol>
<li>Préparation<ol>
<li>Enrober une plaque de 6 puits avec du Matrigel (0,2 mg/mL) en NBM pendant 30 min à 37 oC, puis retirer le Matrigel et ajouter 2 ml de cNBM.</li>
			<li>Transférer les sphéroïdes dans 50 L de cNBM de la plaque de puits de fond rond à la plaque de 6 puits.</li>
			<li>Incuber la plaque à 37 oC et attendre 30 min pour que les sphéroïdes adhèrent.</li>
			<li>Après 24 h d’incubation, tache avec 10 ng/mL de Hoechst et incubate 30 min à 37 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisition et analyse d’images<ol>
<li>Obtenez des images à l’aide d’un microscope vidéo dans le champ lumineux. Un laser de 405 nm est utilisé pour la visualisation de la coloration Hoechst.</li>
			<li>Utilisez le logiciel Fidji pour analyser les images et exécuter la macro comme indiqué dans le document supplémentaire 1. REMARQUE : Toucher le fond du puits ou enlever complètement les dommages supernatants les sphéroïdes. Pour la manipulation du gel de type collagène I, conserver le gel sur la glace pour éviter la polymérisation du collagène, n’ajoutez pas un composant acide parce que le changement de pH affectera la compacité du gel, et les cellules de pipette rapidement dans le collagène pour empêcher la mort cellulaire et la dégradation du gel.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Macro Fidji
REMARQUE : Fidji est un programme d’analyse d’images développé dans le domaine public qui permet au développement de macros d’accélérer l’analyse d’image. L’analyse manuelle est également possible, mais il s’agit d’un processus lent et peut introduire des biais. Les images peuvent être importées par drag-and-drop dans le logiciel et quantifiées avec le plugin ROI Manager Tools. La procédure utilisée dans cette étude est décrite ci-dessous :
<ol><li>Ouvrez la fenêtre macro : Plugins Macros Interprète interactif.</li>
	<li>Copiez et collez la boucle violette adaptée suivante. Conservez les phrases violettes et ajoutez les phrases vertes d’intérêt(Document supplémentaire 1).</li>
	<li>Pour analyser l’ensemble de la série, ajustez les paramètres en rouge pour une quantification spécifique et exécutez la macro à l’aide de Macros . Exécuter Macro ou presser Ctrl-R.</li>
	<li>Vérifier et, si nécessaire, adapter manuellement la région d’intérêt (ROI).</li>
</ol>4. Microscopie électronique des sphéroïdes
REMARQUE : La plupart des étapes suivantes doivent être faites dans une hotte chimique.
<ol><li>Étape de fixation<ol>
<li>Recueillir le sphéroïde avec une pointe de pipette coupée, le mettre dans un tube de 1,5 mL, et laver 1x avec 0,1 M tampon de phosphate (PB).</li>
		<li>Fixer le sphéroïde pendant la nuit à 4 oC en glutaraldéhyde de 2% /2% paraformaldéhyde (PFA) en 0,1 M PB.</li>
		<li>Remplacez la solution de fixation par une solution de 1% de PFA en 0,1 M PB suivie d’une préparation d’échantillon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de l’échantillon<ol>
<li>Transférer les sphéroïdes dans une passoire et les mettre dans un bécher de verre afin d’éviter les dommages sphéroïdes.</li>
		<li>Laver soigneusement 3x avec 0,1 M PB.</li>
		<li>Incuber avec de l’osmium pendant 2 h dans l’obscurité. Diluer l’osmium à 4 % dans un tampon de 0,1 M PB de 1 %.</li>
		<li>Laver soigneusement 3x avec 0,1 M PB.<ol>
<li>Déshydrater comme suit: tremper dans 50% d’éthanol pendant 10 min, 70% d’éthanol pour 10 min, 2x 90% d’éthanol pendant 15 min, 2x 100% d’éthanol pendant 20 min, et 2x acétone pour 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incuber les échantillons dans un mélange de 50/50 d’acétone/résine pendant 2 h. Au cours de cette étape, préparer la résine EPON (Embed-812 : 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).</li>
		<li>Jeter le mélange d’acétone/résine, remplacer par de la résine fraîchement préparée et incuber toute la nuit.</li>
		<li>Remplacer la résine par une nouvelle et incuber entre 2-6 h.</li>
		<li>Ajouter les sphéroïdes dans la résine dans un moule à 60 oC pendant 48-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les essais sphéroïdes de tumeur sont bien adaptés pour étudier les caractéristiques de tumeur comprenant la prolifération, l’invasion, et la migration, aussi bien que la mort cellulaire et la réponse de drogue. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D formant un microtumor invasif, comme on le voit dans la figure 4B,C. Pendant le processus invasif, les métalloproteinases de matrice (MMP) digèrent les matrices entourant les cellules tumorales13</su...

Dans la plupart des études utilisant des lignées cellulaires primaires ou disponibles dans le commerce, des essais sont effectués sur des cellules cultivées sur des surfaces en plastique comme cultures monocouches. La gestion de la culture cellulaire en 2D représente des inconvénients, car elle n’imite pas un environnement cellulaire in vivo 3D. Dans les cultures 2D, toute la surface cellulaire est directement en contact avec le milieu, modifiant la croissance cellulaire et modifiant la disponibilité des médicaments. En outre, la surface plastique non physiologique déclenche la différenciation cellulaire1. Des modèles de culture tridimensionnels ont été développés pour surmonter ces difficultés. Ils ont l’avantage d’imiter l’architecture multicellulaire et l’hétérogénéité des tumeurs2, et pourrait donc être considéré comme un modèle plus pertinent pour les tumeurs solides3. La morphologie complexe des sphéroïdes contribue à mieux évaluer la pénérance et la résistance des médicaments4. L’hétérogénéité tumorale dans le sphéroïde a un impact sur la diffusion de l’oxygène et des nutriments, et la réponse aux agents pharmacologiques (figure 1A). La diffusion de l’oxygène est modifiée lorsque la taille du sphéroïde atteint 300 m, induisant un environnement hypoxique au centre du sphéroïde(figure 1A,C). Les métabolites sont également moins pénétrants à travers les couches cellulaires et les réactions métaboliques compensatoires ont lieu5. Lorsque le diamètre du sphéroïde augmente, des noyaux nécrotiques peuvent être observés, imitant davantage les caractéristiques trouvées dans de nombreux cancers solides, y compris le glioblastome agressif de cancer du cerveau (GBM)6.
Plusieurs essais d’invasion 2D ou 3D pour le glioblastome ont été rapportés dans la littérature7,8. Les essais bidimensionnels sont principalement pour étudier l’invasion dans un plan horizontal sur une fine couche de matrice ou dans un essai de chambre Boyden9. Des essais tridimensionnels ont été décrits avec des cultures sphéroïdes 3D utilisant des lignées cellulaires classiques de glioblastome10. Des variantes plus complexes sont représentées par l’invasion des organoïdes cérébraux par des sphéroïdes tumoraux dans les cultures de confrontation11. Cependant, il est toujours important de développer un essai facile à utiliser et reproductible à la disposition de n’importe quel laboratoire. Nous avons mis au point un protocole pour générer des cellules souches de glioblastome à partir d’échantillons de patients. La quantification de ces essais est facilement gérable et ne nécessite qu’un logiciel en ligne en libre accès. En bref, les morceaux de tumeur sont coupés en petits morceaux et enzymatiquement digérés. Les cellules simples dérivées de la digestion sont cultivées dans le milieu neurobasal. Après 4-7 jours, les structures sphéroïdes se forment spontanément. Sur l’implantation intracrânienne dans les modèles de souris, ils forment des tumeurs présentant un noyau nécrotique entouré de cellules pseudo-palisading12. Cela ressemble étroitement aux caractéristiques trouvées dans les patients gbM.
Dans cet article, nous décrivons notre protocole pour produire des sphéroïdes à partir d’un nombre déterminé de cellules pour assurer la reproductibilité. Deux matrices complémentaires peuvent être utilisées à cette fin : le matrigel et le type de collagène I. Matrigel est enrichi en facteurs de croissance et imite la membrane basale mammifère nécessaire à l’attachement et à la migration des cellules. D’autre part, le type de collagène I, un élément structurel du stroma, est la matrice extracellulaire fibrillaire la plus commune et est utilisé dans les essais d’invasion cellulaire. Ici, nous élisons notre modèle de sphéroïde GBM en effectuant des essais de migration et de prolifération. L’analyse a été effectuée non seulement aux points fixes, mais aussi en surveillant l’expansion des sphéroïdes et le mouvement cellulaire par imagerie en direct. En outre, la microscopie électronique a été faite pour visualiser les détails morphologiques.

<table><tbody><tr><td>96 puits à fond rond</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Stocké à 4 &deg ; C, enzyme de dissociation de la sphère</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Stocké à -20 &deg ; C, décongeler avant utilisation</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes de base</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Stocké à -20 &deg ; C, décongeler avant utilisation</td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage cellulaire Comtesse</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Utilisé pour l’analyse des images</td></tr><tr><td>Flacon 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Stocké à -20 &deg ; C, dilué à une concentration finale de 0,2 mg/mL dans du NBM</td></tr><tr><td>froid Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Dilué dans du NBM pour une concentration finale de 2 %</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline - Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4 %</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Utilisé pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>Collagène de type I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Stocké à 4 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

un modèle sphéroïde 3d pour le glioblastome

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) n’imitent pas la croissance in vivo de tumeur de manière satisfaisante. Par conséquent, des modèles sphéroïdes de culture tridimensionnels (3D) ont été développés. Ces modèles peuvent être particulièrement importants dans le domaine de la neuro-oncologie. En effet, les tumeurs cérébrales ont tendance à envahir l’environnement sain du cerveau. Nous décrivons ici dans un essai idéal de glioblastoma spheroid-basé que nous avons développé pour étudier l’invasion de tumeur. Nous fournissons tous les détails techniques et les outils analytiques pour effectuer avec succès cet essai.

Des sphéroïdes ont été préparés comme décrit dans la section des protocoles et des observations ont été faites concernant la migration, l’invasion, la prolifération et la microscopie. Pour mesurer l’hypoxie dans des zones distinctes de la structure sphérique, la coloration carboxique d’anhydrase IX a été utilisée pour déterminer l’activité hypoxique(figure 1A-C). Plus de cellules CAIX-positives ont été observées dans le centre sphéroïde (<str...

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Les cultures cellulaires bidimensionnelles n’imitent pas adéquatement la croissance tumorale in vivo. Pour améliorer, des procédures 3D ont été développées à l’aide de sphéroïdes. Notre analyse 3D à base de sphéroïdes du glioblastome est particulièrement bien adaptée pour étudier l’invasion de tumeurs cérébrales dans l’environnement sain des tumeurs cérébrales.Les modèles de culture tridimensionnels peuvent être utilisés pour récapituler une architecture multicellulaire, l’hétérogénéité et l’état métabolique des tumeurs permettant une évaluation plus rigoureuse des effets des médicaments. Assurez-vous de ne pas toucher le fond du puits ou d’enlever complètement le surnatant, de garder le gel sur la glace et d’ajouter rapidement les cellules au gel. Pour générer des sphéroïdes tumoraux de taille uniforme, lavez d’abord la culture tumorale d’intérêt avec cinq millilitres de PBS et traitez les cellules avec 0,5 à un millilitre d’enzyme de dissociation.Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec quatre à 4,5 millilitres de PBS et transférer les cellules détachées dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance complet. Après comptage, résuspendez les cellules à une fois 10 à la sixième cellule par huit millilitres de milieu de croissance complet complété par deux millilitres de concentration de méthylcellulose de 2% et transférez la suspension dans un récipient stérile de système. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules à chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant trois à quatre jours.Pour effectuer un test d’invasion, lorsque les cellules tumorales ont formé des sphéroïdes de taille uniforme, transférer chaque structure cellulaire dans un tube de 500 microlitres et laver les sphéroïdes une fois avec 200 microlitres de PBS. Après le deuxième lavage, transférer soigneusement les sphéroïdes dans 100 microlitres de matrice de collagène fraîchement préparée et ajouter chaque suspension sphéroïde au centre de chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, ajouter 100 microlitres de milieu de croissance complet sur le gel de chaque puits.Assurez-vous de placer tous les sphéroïdes au centre de chaque puits pour la meilleure imagerie de l’invasion cellulaire tumorale. Pour effectuer un test de migration, lorsque les cellules tumorales ont formé des sphéroïdes de taille uniforme, enrober une plaque de six puits de 0,2 milligramme par millilitre de Matrigel en milieu de croissance pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirer le Matrigel et ajouter deux millilitres de milieu de croissance complet à chaque puits.Transférer les sphéroïdes de la plaque inférieure ronde en 50 volumes de microlitres dans les puits individuels de la plaque de six puits et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, tachez les sphéroïdes avec 10 nanogrammes par millilitre de Hoechst pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour l’acquisition d’images après une invasion ou un test de migration, placez la plaque sur la scène d’un microscope confocal Brightfield équipé d’une caméra vidéo et obtenez des images au cours de la période expérimentale appropriée.Pour analyser les images de manière semi-automatisée, importez les images aux Fidji et cliquez sur Plugins, Macros, Interactive Interpreter. Copiez et coller la boucle violette adaptée. Gardez les phrases violettes et ajoutez les phrases vertes d’intérêt si nécessaire.Ensuite, pour mesurer la zone de chaque sphéroïde, cliquez sur Analyser et mesurer. Pour mesurer l’hypoxie dans des zones distinctes de la structure sphérique, la coloration carbonique d’anhydrase IX peut être employée pour déterminer l’activité hypoxique. Dans cette analyse représentative, des cellules positives plus carboniques d’anhydrase IX ont été observées dans le centre sphéroïde.Les cellules hypoxiques situées dans le noyau sphéroïde ont tendance à être plus glycolytiques que les cellules entourant le noyau. Les mitochondries peuvent être photographiées par microscopie électronique pour une analyse plus approfondie. Le diamètre des sphéroïdes est directement corrélé à la densité des cellules qui composent la structure cellulaire 3D et les macros fidjiennes peuvent être utilisées pour quantifier la prolifération, l’invasion ou la migration des cellules dans chaque sphéroïde ou la migration des cellules dans chaque sphéroïde.Les augmentations du noyau sphéroïde reflètent la stimulation de la prolifération cellulaire. Sur l’inhibition du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, la grande majorité de la production d’ATP dans les mitochondries est compromise réduisant la prolifération de 20% après 72 heures. Le traitement au chlorure d’hydrogène améliore l’invasion du collagène de type I sur une période de 24 heures, mais réduit la zone migratoire des sphéroïdes 1,5 fois par rapport aux sphéroïdes non traités.Tels qu’évalués par imagerie en direct, les sphéroïdes démontrent une dynamique interne élevée et se déplacent rapidement. La taille des sphéroïdes doit être relativement uniforme et il faut prendre soin de manipuler les sphéroïdes au centre des puits pour obtenir les meilleurs résultats d’imagerie. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier la prolifération des cellules tumorales, la migration et la mort ainsi que l’expression de matrice extracellulaire, de récepteurs cellulaires ou de protéines intracellulaires d’intérêt.Les sphéroïdes peuvent également être encapsulés et l’effet de l’augmentation de la tension de surface cellulaire peut être étudié lors de l’enlèvement des capsules.

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Cette vidéo montre comment les gliomasphères, dérivées de tumeurs cérébrales, sont séparées en cellules uniques et encapsulées dans un hydrogel à base d’acide hyaluronique. Ce processus favorise les interactions cellule-cellule, formant un modèle structuré et tridimensionnel de glioblastome.

Un hydrogel à base d’acide hyaluronique pour la culture en 3 dimensions de cellules de glioblastome

Source : Guyon, J., et al. Un modèle sphéroïde 3D pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo démontre la génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Les sphéroïdes sont formés à partir de cellules tumorales du cerveau humain et intégrés dans une matrice de collagène. Les cellules tumorales à la périphérie des sphéroïdes adoptent un phénotype invasif, sécrétant des protéases pour dégrader le collagène et progressant pour envahir la matrice...

Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Ici, nous décrivons un modèle murin orthotopique préclinique pour le GBM, établi par injection intracrânienne de cellules dérivées de tumeurs modèles de souris génétiquement modifiées. Ce modèle présente les caractéristiques de la maladie du GBM humain. Pour les études translationnelles, la tumeur cérébrale de souris est suivie par IRM in vivo et histopathologie.

Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Les embryons de poussins sont utilisés pour étudier les tumeurs cérébrales du glioblastome humain (GBM) en co-cultures ovo et ex vivo de tranches cérébrales. Le comportement des cellules GBM peut être enregistré par microscopie time-lapse dans des co-cultures ex vivo , et les deux préparations peuvent être analysées au point final expérimental par une analyse confocale 3D détaillée.

Utilisation du cerveau de l’embryon de poussin comme modèle pour les analyses in vivo et ex vivo du comportement des cellules de glioblastome humain

Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .

Fabrication et encapsulation de sphéroïdes tumoraux dans des hydrogels de polyéthylène glycol pour étudier les interactions sphéroïde-matrice

Nous présentons une méthode de réplication du microenvironnement tumoral du gliome sur le front invasif qui intègre le flux de liquide interstitiel. Ce modèle est un hydrogel hyaluronane-collagène I dans un insert de culture tissulaire où une tête de pression de fluide peut être appliquée. L’invasion peut être quantifiée et les cellules peuvent être isolées ou lysées.

Un modèle photopolymérisable d’acide hyaluronique-collagène du microenvironnement invasif du gliome avec flux interstitiel

Ici, nous établissons une plateforme de profilage métabolique intégrant des sphéroïdes de gliome tridimensionnels (3D) et une normalisation basée sur l’imagerie via l’analyse des flux extracellulaires. Cette approche permet une évaluation plus précise des réponses métaboliques tumorales aux traitements médicamenteux et donne un aperçu des mécanismes potentiels de résistance.

Progrès dans le profilage métabolique des sphéroïdes de tumeurs cérébrales tridimensionnelles pour le criblage de médicaments

Nous présentons un modèle de migration 3D du glioblastome utilisant des gliomasphères magnétiques dérivées du patient générées à partir de tumeurs nouvellement diagnostiquées et récurrentes. Cette plateforme permet de visualiser la dynamique migratoire spécifique au patient et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Le test peut être multiplexé après migration afin d’évaluer la localisation et les schémas d’expression des protéines.

Essai de migration du glioblastome 3D reproductible avec localisation sphéroïde médiée par nanoparticules magnétiques dans des conditions hypoxiques

Découvrez un modèle sphéroïde 3D pour étudier l'invasion du glioblastome dans le tissu cérébral sain. Cette méthode permet de quantifier la migration et la prolifération cellulaire avec précision.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

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