Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

L’évaluation des propriétés contractiles des myofibriles isolées du muscle strié peut être utilisée pour déterminer si le dysfonctionnement du sarcomere est une cause principale de faiblesse musculaire due à des mutations dans les protéines sarcomeriques. Cette technique peut être utilisée pour acquérir des données avec un rapport signal-bruit très élevé avec résolution nanonewton. Ce protocole est également approprié pour mesurer la contractilité dans les cardiomyocytes permeabilized.

Gardez à l’esprit que le transducteur de force est très fragile. Donc, lors de l’enlèvement de la colle de l’aiguille de montage ou lors du collage d’un myofibril, vous devez avoir une main ferme, beaucoup de pratique, et beaucoup de patience. Avant de monter le tissu, placez une tige homogénéisante dans le tube contenant le tissu musculaire.

En gardant le tube sur la glace, faites tourner le rotor pendant 15 secondes à la vitesse 5. À la fin de l’homogénéisation, transférer 50 microlitres de la suspension myofibrile résultante et 250 microlitres de solution relaxante sur une lame recouverte de poly-HEMA dans un bain de tissu. Couvrir le bain d’un couvercle pour protéger le mélange de la poussière et attendre 5 à 10 minutes pour permettre aux myofibriles de couler au fond de la goutte.

Pendant le naufrage des myofibriles, chauffer shellac une colle à l’éthanol à 65 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes avant d’ajouter environ six microlitres de colle sur une toboggan en verre non cintré. Tremper à plusieurs reprises la pointe de chaque aiguille montante dans la colle jusqu’à ce qu’une couche de colle soit visible. Ensuite, utilisez des micro-manipulateurs pour déplacer la sonde et piezo verticalement pour faire de la place pour le bain de tissu sur le stade du microscope et enlever la glissière en verre contenant la colle.

Après avoir monté les myofibriles, pour mesurer la longueur du sarcomere, déplacez le piezo et/ou la sonde de force pour régler la longueur initiale du sarcome du myofibril à 2,5 micromètres. À l’aide de la fonction de navire du logiciel de contrôleur système, mesurez la longueur et la largeur du myofibril. Utilisez l’étape du microscope pour positionner le myofibril au centre de l’image vidéo et étirer un rectangle d’un côté du myofibril à l’autre, en prenant soin d’inclure le bord sombre des gouttelettes de colle.

Pour commencer à enregistrer les données, cliquez sur démarrer. Après cinq secondes, cliquez sur pause. La longueur aura été enregistrée.

Pour mesurer la largeur, faites pivoter la caméra à 90 degrés pour voir le contraste du bord du myofibril lui-même. Ajustez le rectangle et cliquez sur démarrer pour commencer à enregistrer les données. Après cinq secondes, cliquez sur pause.

La largeur aura été enregistrée. Pour positionner le verre theta, utilisez l’oculaire et le manipulateur pour déplacer soigneusement le verre theta vers le myofibril. Alignez le canal supérieur du verre theta avec le myofibril et effectuez une étape rapide pour vérifier la position.

Allumez le flux relaxant de fond pour vérifier l’alignement du verre theta et utilisez un levier de valve Luer pour activer l’afflux de la chambre d’écoulement. Ensuite, pour commencer à vider la chambre d’écoulement et pour éviter le débordement de la chambre d’écoulement, réglez la soupape de pompe de sortie à la valve de bain deux, le mode micro-étape au micro, la cible de piston à 48.000, et la vitesse de piston à 38 à 40. Pour mesurer le taux de réaménagement des tensions, calculer le mouvement piezo nécessaire pour relâcher le myofibril de 15% et entrer cette valeur dans le générateur de signal.

Cliquez sur cv pour continuer à enregistrer les données et ouvrir les valves un et six pour commencer les flux de la solution relaxante et les différentes concentrations de calcium à travers le verre theta respectivement. Sélectionnez la plage de réinitialisation sur l’interféromètre pour réinitialiser la portée de l’interféromètre de sorte que la force de base est de zéro volts. Lorsque la trace de force est stable, effectuez l’étape rapide du verre theta avec une taille d’étape de 100 micromètres.

Lorsque le plateau de force est atteint, effectuer le raccourcissement re-étirer avec le piezo. Une trace de relaxation d’activation sera enregistrée. Cliquez sur pause.

Pour effectuer un étirement étape-sage, cliquez sur démarrer et réinitialiser la portée de l’interféromètre de sorte que la force de base est zéro volts. Effectuez un étirement étape-sage avec le générateur de signal. Lorsque l’étirement est terminé, utilisez le piezo pour raccourcir le myofibril à la longueur de mou.

Appuyez ensuite sur pause et arrêtez-vous et enregistrez les données. Ici, des traces de force d’une expérience de force active avec un myofibril isolé du muscle humain sain de quadriceps sont montrées. Le myofibril a été activé cinq fois avec des solutions avec des concentrations variables de calcium, avec une force maximale moyenne de tous les myofibrils d’environ 123 millinewtons par millimètre carré.

La construction d’une courbe de concentration de calcium de force à partir des forces du plateau atteinte lors de chaque activation dans chacune des cinq courbes de calcium permet de calcul de la concentration de calcium à 50% de la production de force maximale. Comme illustré dans cette analyse représentative, les myofibrils peuvent être traités avec des composés multiples dans une seule expérience pour répondre à des questions supplémentaires sur le type myofibril. La force active et la longueur du sarcome peuvent également être mesurées pour permettre le calcul des taux de réaménagement, d’activation et de relaxation.

La forte élévation indiquée dans la boîte rouge pointillée est causée à la fois par la viscosité et l’élasticité. Le plateau ne ressemble qu’à la composante élastique. Comme la viscosité résiste à la tension linéairement, la force a chuté après que la souche a été enlevée.

Lorsque vous positionnez le verre theta, assurez-vous de l’aligner correctement avec le myofibril. Dans le cas contraire, la solution d’activation pourrait se trouver entre la fibre optique et le porte-à-faux de la sonde de force, ce qui provoque des artefacts dans vos données. En outre, le myofibril peut ne pas s’activer correctement.

Cette méthode de perfusion est également appropriée pour déterminer le type de fibre musculaire du myofibril. Par exemple, vous pouvez d’abord parcourir le myofibril avec une solution normale de calcium suivie de la perfusion de cette même solution, puis ajouter un composé spécifique de type fibre musculaire améliorant la force.