Name: Caractérisation des structures amyloïdes dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de l’imagerie à vie de fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez l'imagerie à vie de fluorescence FLIM pour étudier l'agrégation protéique chez C. elegans. Cette méthode non invasive permet de distinguer les structures amyloïdes des protéines solubles dans le contexte du vieillissement.

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La souche muscle-Q40-MRFP fournie par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440). Le neuronal-Q40-CFP était un bon cadeau du Morimoto Lab. Nous reconnaissons le DFG (KI-1988/5-1 à JK, neuroCure PhD fellowship par le Groupe d’excellence NeuroCure à MLP), EMBO (bourse à court terme à MLP) et la Société des biologistes (subventions de voyage à CG et MLP) pour le financement. Nous reconnaissons également l’installation d’imagerie par microscopie lumineuse avancée du Centre max Delbrack de médecine moléculaire de Berlin pour avoir fourni la configuration pour l’image des constructions YFP.

1. Synchronisation de C. elegans
<ol><li>Synchroniser C. elegans soit par traitement de solution d’hypochlorite alcaline ou via la ponte simple pour 4 h à 20 oC8.</li>
	<li>Cultivez et maintenez les nématodes à 20 oC sur les plaques moyennes de croissance des nématodes (NGM) ensemencées avec OP50 E. coli selon les procédures standard9. Vieillissez les nématodes jusqu’au stade ou au jour du développement désiré. REMARQUE : Dans ce protocole, les jeunes adultes sont photographiés le jour 4 et les vieux nématodes sont photographiés le jour 8 de la vie.</li>
</ol>2. RNAi-négocié knockdown de machines chaperon via l’alimentation
REMARQUE : Effectuez le knockdown de la protéine de choc thermique 1 (hsp-1) chaperon en alimentant le vecteur RNAi correspondant aux nématodes10. Le plasmide hsp-1 RNAi a été obtenu de la bibliothèque Ahringer (id clone: F26D10.3).
<ol><li>Cultivez le PLASMide HT115 (DE3) E. coli exprimant le plasmide RNAi hsp-1 pendant 6 h à la nuit dans le milieu Luria Bertani (LB) contenant 50 g/ampicilline de l’ampicilline.</li>
	<li>Préparer des plaques d’agar NGM fraîches contenant de l’isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) et de l’ampicilline (25 g/mL) et des graines avec les bactéries hsp-1 RNAi. Laisser sécher les plaques et induire à température ambiante pendant 1-3 jours.</li>
	<li>Déposer les œufs synchronisés sur une plaque de siRNA et laisser éclore, ou placer les nématodes gravidés et laisser pondre des œufs pendant 4 h à 20 oC avant de l’enlever. Cultivez les nématodes jusqu’à l’âge ou l’étape désirés. REMARQUE : La deuxième génération de nématodes pourrait présenter un phénotype plus fort du knockdown. Le protocole et les conditions de siRNA décrits ici sont généraux et adaptés à hsp1. L’interférence d’ARN via le siRNA d’un clone/gène spécifique doit être établie et optimisée par l’utilisateur final. Il est important de noter que tous les siRNA n’ont pas la même efficacité, et il est donc recommandé de tester l’efficacité de l’élimination par quantification par la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse de transcription (RT-qPCR) ou blot occidental.</li>
</ol>3. Préparation de diapositives de microscopie
<ol><li>Le jour de l’imagerie, commencez par préparer les diapositives d’imagerie. Faire fondre l’agarose dans ddH2O à une concentration de 3% (w/v) et laisser refroidir légèrement.</li>
	<li>Couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 mL et prendre environ 200 L d’agarose fondue. Pipette l’agarose sur un toboggan en verre propre et immédiatement placer un deuxième sur le dessus, en évitant la formation de toutes les bulles. Laisser sécher et retirer délicatement la glissière en verre supérieure. Le résultat est une glissière en verre avec une surface d’agarose égale où les nématodes seront positionnés. REMARQUE : Chaque diapositive sera utilisée pour l’image entre 5-10 nématodes. Les diapositives peuvent être préparées et entreposées pendant quelques heures dans une boîte humifiée pour empêcher l’agarose de se dessécher.</li>
</ol>4. Montage de nématodes sur des toboggans de microscopie
REMARQUE : La FLIM exige que les nématodes soient immobilisés. Effectuez cette étape une fois que la configuration d’imagerie (p. ex., microscopes, lasers, détecteurs) est prête à l’emploi.
<ol><li>À l’aide d’une prise de fil de platine, placez les nématodes de l’âge désiré sur une plaque fraîche non ensegueded et laissez-les ramper pour enlever l’excès de bactéries OP50 de leur corps.</li>
	<li>Préparer le composé anesthésique (azide de sodium ou levamisole) pour immobiliser le nématode. Gardez un stock NaN3 de 500 mM dans l’obscurité à 4 oC et diluez-le en ddH2O frais à une concentration finale de 250 mM. Si vous utilisez du levamisole, diluer une solution de travail de 20 mM à 2 mM dans ddH2O. CAUTION: L’azide de sodium (NaN3) est très toxique. Utilisez des gants et des lunettes de protection et travaillez sous une capuche ventilée.</li>
	<li>Travailler sous un stéréomicroscope, placer une goutte de composé anesthésique de 10 L sur un tampon d’agarose et y transférer délicatement 5-10 nématodes. Utilisez une pointe de cils pour séparer les nématodes. Gardez-les proches mais ne touchez pas pour faciliter la localisation des nématodes lors de l’acquisition d’images.</li>
	<li>Superposer soigneusement les nématodes d’un coverlip. Prenez des mesures dans les 1 h après le montage. REMARQUE: Les deux anesthésiques finiront par tuer C. elegans. Les nématodes doivent être complètement immobiles pendant l’imagerie, car la carte de la durée de vie est enregistrée à partir de chaque pixel. Tout mouvement des paramètres x,y empêche la lecture de la durée de vie dans le même pixel excité.</li>
</ol>5. Acquisition de données FLIM
REMARQUE : Dans ce protocole, la durée de vie du fluorophore est acquise par la méthode TCSPC de domaine temporel. FLIM nécessite une impulsion de lumière pour être générée par le laser à un rythme de répétition fixe et constante. Le taux de répétition varie selon le type laser et doit être connu par l’utilisateur. Les mesures à vie sont effectuées par des détecteurs et des équipements électroniques installés à côté d’un microscope conventionnel. Dans ce protocole, des mesures sont effectuées sur trois microscopes confocals à balayage laser différents avec des détecteurs et des logiciels fournis par deux entreprises différentes(Tableau des matériaux) pour l’acquisition de vies mRFP, CFP et YFP, respectivement. Vérifiez que les filtres corrects d’émission/excitation sont en place et minimisez tout rétroéclairage ou moniteur avant de commencer. Avant de commencer toute expérience, établir la photostabilité du fluorophore choisi. Si le fluorophore blanchit dans un court laps de temps dans les tissus nématodes, il n’est pas adapté pour les mesures FLIM dans C. elegans.
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’acquisition FLIM. Le logiciel FLIM permet également le contrôle du microscope confocal. Localiser l’onglet/bouton pour permettre l’activation des sorties du détecteur et appuyez sur Activer les sorties.</li>
	<li>Acquérir la fonction de réponse aux instruments (IRF), qui décrit la précision de synchronisation de la configuration instrumentale. REMARQUE : Cette étape doit être effectuée de préférence avant de monter les nématodes.<ol>
<li>Si disponible, supprimez les filtres excitation/émission.</li>
		<li>Placez un allier vide au-dessus de l’objectif et trouvez sa surface. Enregistrez le signal de dispersion obtenu à partir du coverlip pour un minimum de 30 s. REMARQUE : Pour une durée de vie de plusieurs nanosecondes, le logiciel d’acquisition peut automatiquement estimer le changement iRF. L’acquisition d’un IRF est toujours recommandée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la glissière avec les C. elegans montés sur la scène. À l’aide d’une lentille de grossissement 10x en mode transmission et localisation de la position des nématodes sur la diapositive.</li>
	<li>Retirez la glissière, passez l’objectif à une lentille de grossissement 63x et appliquez le support d’immersion requis (p. ex., huile). Remplacez la diapositive sur la scène et localisez les nématodes.</li>
	<li>Localiser le gestionnaire de trou d’épingle sur le logiciel d’acquisition et l’ouvrir au Maximum. Commencez à numériser l’échantillon, sélectionnez une région d’intérêt (p. ex., tête, haut du corps) et concentrez-vous sur son plan de projection maximal.</li>
	<li>Surveillez le pouls laser et les trois autres valeurs présentes sur l’interface du logiciel : The Constant Fraction Discriminator (CFD), le Time-to-Amplitude (TAC) et le convertisseur analogique-numérique (ADC). REMARQUE : Le laser doit avoir une porte maximale de 1 x 108 nombres de photon simples. Ce nombre représente le nombre maximum de photons fournis par le laser. Le CFD fournit des informations sur la réception de l’impulsion de photon unique en référence à l’impulsion laser par le détecteur. Cette valeur devrait être d’environ 1 x 105. Le TAC établit une distinction entre le moment où un photon a été détecté et l’impulsion laser suivante. Enfin, l’ADC convertit la tension TAC en un signal de mémoirestorable 11. La CFD, le TAC et l’ADC devraient toutes avoir des valeurs similaires pour s’assurer que les photons émis par le fluorophore ne sont pas perdus. Une évaluation correcte de ces paramètres garantit que suffisamment de photons sont collectés pour créer une carte précise à vie.</li>
	<li>Sur l’interface du logiciel FLIM, prévisualisez le nombre de photons détectés : la valeur ADC doit se situer entre 1 x 104 et 1 x 105. Si nécessaire, déplacez l’accent sur un autre plan ou augmentez la puissance laser pour recueillir plus de photons. REMARQUE : En général, le nombre de photons enregistrés par seconde ne doit pas dépasser 1 % du taux de répétition du laser.</li>
	<li>Dans la barre de menu, sélectionnez l’onglet pour définir les paramètres d’acquisition. Sélectionnez la synchronisation d’analyse pour permettre la détection de photon unique.</li>
	<li>Définissez l’acquisition à un temps fixe ou à un nombre fixe de photons. Par exemple, acquérir une courbe de désintégration à vie pendant 2 minutes ou jusqu’à ce qu’un seul pixel atteigne un nombre de photon de 2 000 événements uniques. Appuyez sur Commencer à acquérir. REMARQUE : Différents fluorophores nécessiteront différents lasers et filtres d’excitation et d’émission. Selon la luminosité de l’échantillon, la puissance laser peut également être ajustée, ce qui n’interfère pas avec la durée de vie. Ces protocoles utilisent les paramètres d’excitation/émission suivants : YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Un laser à deux photon pulsé a été utilisé pour des mesures de CFP utilisant ex800/em440 nm. Le temps et le nombre de photon requis pour l’acquisition d’une carte FLIM devront être établi empiriquement pour chaque configuration et chaque but expérimental.</li>
</ol>6. Analyse des données FLIM à l’aide du logiciel FLIMfit
REMARQUE : Effectuez l’analyse des données à l’aide de l’outil logiciel FLIMfit développé à l’Imperial College De Londres12 (voir la figure 1).
<ol><li>Ouvrez le logiciel et importz des fichiers de données FLIM via File . Chargez les données FLIM. Chargez tous les échantillons d’une seule condition, même s’ils sont obtenus en différentes sessions et à partir de différentes répétitions biologiques.</li>
	<li>Si nécessaire, segmentez un seul nématode à partir de n’importe quelle image FLIM via Segmentation . Gestionnaire de segmentation. Faites glisser l’outil de culture autour de la zone d’intérêt jusqu’à ce qu’il soit mis en évidence. Une fois terminé, appuyez sur OK. REMARQUE : La segmentation doit être faite pour toutes les images.</li>
	<li>Sélectionnez une petite région où apparaît l’image basée sur l’intensité d’un C. elegans (figure 1, Flèches 1). La courbe de décomposition de cette région apparaîtra dans la grande fenêtre de désintégration du côté droit de l’interface(figure 1, Flèche 2). REMARQUE : La pourriture peut être affichée linéairement ou logarithmiquement.</li>
	<li>Définissez les paramètres corrects pour extrapoler la durée de vie via l’algorithme du logiciel tel que décrit dans les étapes 6.5-6.8.</li>
	<li>Sur l’onglet Données (figure 1, Flèche 3) :<ol>
<li>Définissez une valeur minimale intégrée arbitraire pour exclure tous les pixels trop faibles pour produire un bon ajustement. Selon l’échantillon C. elegans, cette valeur varie de 40 à 300. Entrez différentes valeurs jusqu’à ce qu’un aperçu satisfaisant soit atteint.</li>
		<li>Sélectionnez un Time Min et un numéro Time Max pour limiter le signal FLIM à ces valeurs. Tous les événements qui apparaissent avant et après ce seuil seront exclus. REMARQUE: Par exemple, pour l’analyse de mRFP, les événements avant 800 ps et après 4.000 ps ont été exclus. Ces valeurs dépendent de la durée de vie du fluorophore et doivent être déterminées par l’utilisateur final.</li>
		<li>Ne modifiez pas les comptes/Photon prédéfinis de 1.</li>
		<li>Entrez le taux de répétition, dans MHz, du laser utilisé lors de l’acquisition. REMARQUE : Pour le protocole actuel, différents lasers ont été utilisés avec différents taux de répétition. Les deux lasers photon utilisés pour l’acquisition de durées de vie CFP possède un taux de répétition de 80 MHz, pour YFP le laser se répète à 40 MHz, et pour mRFP la valeur est de 78,01 MHz. Ces valeurs ont été intégrées à FLIMfit selon l’échantillon analysé.</li>
		<li>Entrez une valeur Gate Max pour exclure tous les pixels saturés. REMARQUE : Pour les mesures à vie dans C. elegans,cette valeur est réglée à n’importe quel grand nombre (par exemple, 1 x 108).</li>
	</ol></li>
	<li>Sur l’onglet Lifetime, sélectionnez un raccord global à utiliser (p. ex., un ajustement pixel-sage). Voir la figure 1, Flèche 4. REMARQUE : Un raccord Pixel-sage produira une décomposition ajustée à chaque pixel individuel. Un montage image-sage produira un ajustement global de chaque image individuelle et affichera une valeur à vie unique par image. Un montage global-sage produira un seul montage sur l’ensemble des données. Une valeur à vie unique est fournie pour toutes les images.</li>
	<li>Ne modifiez aucun autre paramètre, sauf le No. Sélection d’exp si l’on sait que la carie de fluorescence choisie est multiexponentielle et montre plus d’une seule vie. REMARQUE : Dans le protocole actuel, cette fonction a été employée pour calculer les durées de vie du fluorophore biexponential de CFP.</li>
	<li>Téléchargez l’IRF via le menu IRF : IRF (fr) Charge IRF. Pour estimer le quart de travail de l’IRF, sélectionnez iRF Estimation IRF Shift. Un ensemble de valeurs apparaîtra automatiquement sur l’onglet IRF. Une fois cela établi, ne modifiez aucun autre paramètre de cet onglet.</li>
	<li>Une fois que tous les paramètres sont définis, appuyez sur Fit Dataset (figure 1, Flèche 5). L’algorithme produira un ajustement pour la courbe de décomposition et établira une valeur à vie pour chaque image. REMARQUE : L’ajustement qui en résulte, mis en évidence à la ligne bleue, devrait se chevaucher avec tous les événements. Un bon ajustement est obtenu lorsque tous les événements sont alignés le long de l’ajustement.</li>
	<li>Cliquez sur l’onglet Paramètres (figure 1, Flèche 6), situé dans les menus en haut à droite de l’interface du logiciel, et sélectionnez Statistique: w_mean (moyenne pondérée) et vérifiez que la valeur chi2 est aussi proche que possible de 1. REMARQUE : Un chi2 proche de l’un d’eux assure la précision de l’ajustement. La valeur à vie de l’image sélectionnée est ainsi révélée comme tau_1.</li>
	<li>Exporter toute information d’intérêt : Fichier Images d’intensité d’exportation/Table/Images/Histogrammes. Enregistrer les paramètres de données utilisés pour calculer la durée de vie : Fichier Enregistrer les paramètres de données. REMARQUE : Les paramètres utilisés seront enregistrés pour une analyse future des échantillons sélectionnés.</li>
</ol>7. Représentations graphiques des données FLIM
REMARQUE : Les durées de vie prélevées à partir de différents échantillons peuvent être représentées visuellement de diverses façons. Sélectionnez pour indiquer les valeurs à vie en nanosecondes ou en picosecondes.
<ol><li>Montrez la qualité de l’ajustement et la précision de la courbe en exportant la courbe de décomposition directement à partir de FLIMfit.</li>
	<li>Représenter la distribution des photons en traçant la fréquence du nombre de photons par rapport à la valeur à vie dans un histogramme.</li>
	<li>Enfin, pour la comparaison statistique, si vous comparez deux échantillons ou plus, placez des valeurs à vie plus l’écart standard de la moyenne dans un graphique à barres de parcelle de dispersion. Effectuez toute analyse statistique souhaitée.</li>
</ol>

<ol><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58(2016).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. New York, NY. (2006).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li>
<li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li>
<li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li>
<li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687(2013).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-nanoimaging%3A+Protein+Misfolding+and+Aggregation%22%5BJournal%5D)">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+%CE%B1-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li>
<li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells%3A+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li>
<li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes%3A+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li>
<li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici décrit une technique à base de microscopie pour identifier les espèces agrégées dans le système modèle C. elegans. FLIM peut caractériser avec précision la présence d’espèces agrégées et solubles fusionnées à un fluorophore par mesure de leurs caries de fluorescence à vie. Lorsqu’une protéine de fusion commence à agréger sa durée de vie moyenne enregistrée passera d’une valeur plus élevée à une valeur inférieurede 16. La propension de l’agrégation peut alors être...

L’agrégation protéique se produit à la fois dans le vieillissement et la maladie. Les voies qui mènent à la formation et au dépôt de grands amyloïdes ou d’inclusions amorphes sont difficiles à suivre et leur cinétique est tout aussi difficile à démêler. Les protéines peuvent se tromper en raison de mutations intrinsèques dans leurs séquences de codage, comme dans le cas des maladies génétiques. Les protéines se déplient également parce que le réseau de protéostasie (PN) qui les maintient solubles et correctement pliés est altéré, comme cela arrive pendant le vieillissement. Le PN comprend les chaperons moléculaires et les machines de dégradation et est responsable de la biogenèse, le pliage, le trafic et la dégradation des protéines1.
C. elegans est apparu comme un modèle pour étudier le vieillissement et la maladie en raison de sa courte durée de vie, la nature isogénique, et la facilité de manipulation génétique. Plusieurs souches transgéniques C. elegans qui expriment des protéines pathogènes humaines dans les tissus vulnérables ont été créées. Fait important, bon nombre des souches contenant des protéines sujettes à l’agrégation récapitulent la marque des troubles amyloïdes, la formation de grandes inclusions. Grâce au corps transparent de C. elegans, ces agrégats peuvent être visualisés in vivo, non invasivement et nontructivement2. Générer n’importe quelle protéine d’intérêt (POI) dans la fusion avec un fluorophore permet d’étudier ses emplacements, le trafic, le réseau d’interaction, et le destin général.
Nous présentons un protocole pour surveiller l’agrégation des protéines pathogènes dans la microscopie imageuse vivante et vieillissante de C. eleganpar l’intermédiaire de la microscopie imageuse à vie de fluorescence (FLIM). FLIM est une technique puissante basée sur la durée de vie d’un fluorophore, plutôt que sur ses spectres d’émission. La durée de vie (tau,) est définie comme le temps moyen requis par un photon pour se décomposer de son état excité de retour à son état au sol. La durée de vie d’une molécule donnée est calculée avec la technique de domaine temporel du comptage du photon unique en corrélation temporelle (TCSPC). Dans TCSPC-FLIM, la fonction de désintégration fluorescente est obtenue en excitant le fluorophore avec des impulsions laser courtes et à haute fréquence et en mesurant les heures d’arrivée du photon émis à un détecteur en ce qui concerne les impulsions. Lors de la numérisation d’un échantillon, un tableau de données tridimensionnel est créé pour chaque pixel : le tableau comprend des informations sur la distribution des photons dans leurs coordonnées spatiales x,y et leur courbe de désintégration temporelle. Un échantillon donné devient donc une carte des vies révélant des informations sur la structure de la protéine, la liaison et l’environnement3,4. Chaque protéine fluorescente possède une durée de vie intrinsèque et précisément définie, généralement de quelques nanosecondes (ns), dépendante de ses propriétés physiochimiques. Fait important, la durée de vie d’un fluorophore est indépendante de sa concentration, de son intensité fluorescente et de la méthodologie d’imagerie. Cependant, au sein d’un système biologique, il peut être affecté par des facteurs environnementaux tels que le pH, la température, les concentrations d’ions, la saturation en oxygène et ses partenaires d’interaction. Les durées de vie sont également sensibles aux changements structurels internes et à l’orientation. Le fusion d’un fluorophore à un POI entraîne un changement dans sa vie et, par conséquent, des informations sur le comportement de la protéine fusionnée. Lorsqu’un fluorophore est entouré ou encapsulé dans un environnement étroitement lié, comme les feuilles bêta antiparallel d’une structure amyloïde, il perd de l’énergie de façon non radiative, un processus connu sous le nom d’étanchéité5. L’étanchéité du fluorophore entraîne un raccourcissement de sa durée de vie apparente. Lorsqu’elle est soluble, la durée de vie d’une protéine restera plus proche de sa valeur d’origine et plus élevée. En revanche, quand une protéine commence à s’agréger, sa durée de vie passera inévitablement à une valeur inférieure6,7. Par conséquent, il devient possible de surveiller la propension à l’agrégation de toute protéine amyloïde-formant à différents âges dans la vie C. elegans.
Ici, nous décrivons un protocole pour analyser l’agrégation d’une protéine de fusion comprenant différentes étendues de polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44, et Q85). Nous physions comment la technique peut être appliquée également à différents fluorophores, tels que la protéine fluorescente cyane (PCP), la protéine fluorescente jaune (YFP) et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP); et dans tous les tissus de C. elegans, y compris les neurones, les muscles et l’intestin. En outre, dans le contexte de la protéostasie, la FLIM est un outil très utile pour observer les changements lors de l’épuisement des chaperons moléculaires. Abattre l’un des principaux chaperons moléculaires, protéine de choc thermique 1 (hsp-1), via l’interférence de l’ARN produit un mauvais pliage prématuré des protéines. L’augmentation de la charge d’agrégation en raison du vieillissement, de la maladie, ou des chaperons déficients, est alors mesurée comme une diminution de la durée de vie de fluorescence.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>Composant NGM</td></tr><tr><td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td><td>Source BioScience UK Limited</td><td>F26D10.3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.3</td><td>Antibiotique</td></tr><tr><td>B& H DCS-120 SPC-150</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Logiciel d’acquisition</td></tr><tr><td>B& H SPC830-SPC Image</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Logiciel d’acquisition</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>C. elegans iQ44-YFP</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OG412</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans iQ85-YFP</td><td></td><td></td><td>Cadeau de Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans mQ40-RFP</td><td></td><td></td><td>Cadeau aimable de Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans nQ40-CFP</td><td></td><td></td><td>Cadeau de Morimoto Lab</td></tr><tr><td>Deckgl&auml ; ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>Lamelles de protection</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2316.4</td><td></td></tr><tr><td>Leica M165 FC</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Montage Stéréomicroscope</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lévamisole</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>PicoQuant PicoHarp300</td><td>PicoQuant GmbH</td><td></td><td>FLIM Logiciel d’acquisition</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K305.1</td><td>Chlorure de sodium anesthésique</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>Composant</td></tr> <tr><td>NGMstandard-objekttr&auml ; ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>Lames de verre</td></tr><tr><td>Universal Agarose</td><td>Bio & Sell GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr></tbody></table>

caractérisation des structures amyloïdes dans le vieillissement c. elegans à l’aide de l’imagerie à vie de fluorescence

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Les fibrilles amyloïdes sont associées à un certain nombre de maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson ou la maladie d’Alzheimer. Ces fibrilles amyloïdes peuvent séquestrer des protéines métastables endogènes ainsi que des composants du réseau de protéostasie (PN) et exacerber ainsi les mauvais pliages de protéine dans la cellule. Il existe un nombre limité d’outils disponibles pour évaluer le processus d’agrégation des protéines amyloïdes chez un animal. Nous présentons un protocole pour la microscopie à vie de fluorescence (FLIM) qui permet la surveillance ainsi que la quantification de la fibrilisation amyloïde dans des cellules spécifiques, telles que les neurones, d’une manière non invasive et avec la progression du vieillissement et sur la perturbation de le PN. La FLIM est indépendante des niveaux d’expression du fluorophore et permet une analyse du processus d’agrégation sans autre coloration ni blanchiment. Les fluorophores sont étanchéités lorsqu’elles sont à proximité des structures amyloïdes, ce qui entraîne une diminution de la durée de vie de la fluorescence. L’étanchéité est directement corrélée avec l’agrégation de la protéine amyloïde. FLIM est une technique polyvalente qui peut être appliquée pour comparer le processus de fibrilisation de différentes protéines amyloïdes, stimuli environnementaux, ou des antécédents génétiques in vivo d’une manière non invasive.

Le protocole montre comment surveiller avec précision la formation d’espèces agrégées dans les C. elegansvivants, tant pendant son vieillissement naturel que lorsqu’elles sont soumises au stress. Nous avons sélectionné quatre souches différentes de nématodes transgéniques exprimant des protéines de polyglutamine de 40Q, 44Q, ou 85Q répétitions. Ces protéines sont synthétisées dans différents tissus et ont été fusionnées à différents fluorophores. Les souches C. elegans o...

L’imagerie à vie de fluorescence surveille, quantifie et distingue les tendances d’agrégation des protéines dans les modèles vivants, vieillissants et stressés de la maladie de C. elegans.

Caractérisation des structures amyloïdes dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de l’imagerie à vie de fluorescence

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

La méthode nous permet de distinguer clairement les structures intégrées des protéines amyloïdes des homologues solubles et même accumulés. La technique est exécutée in vivo d’une manière non invasive avec peu ou pas d’effets secondaires toxiques. Comme il dépend des propriétés fluorescentes du fluorophore lui-même, il est très robuste et reproductible au fil du temps.FLIM a été utilisé dans le domaine du diagnostic du cancer. Cependant, nous l’employons pour étudier les mécanismes de base de l’agrégation des protéines qui sont en effet pertinents pour les maladies neurodégénératives. La méthodologie peut être utilisée dans le domaine de l’agrégation protéique.Tant que la protéine associée à la maladie est étiquetée avec une sonde fluorescente, elle peut être suivie et surveillée au fil du temps. Les composés et les stratégies qui favorisent ou empêchent l’agrégation peuvent être étudiés avec succès. Tout système biologique qui permet d’être visualisé par microscopie légère convient à la FLIM in vivo ou ex vivo, par exemple dans la culture cellulaire, dans les échantillons fixated ou permeabilized et dans n’importe quel milieu nécessaire.Assurez-vous de tester les propriétés de votre fluorophore sélectionné dans le nématode avant d’obtenir des données expérimentales et de tester que la configuration est entièrement fonctionnelle avant d’acquérir des mesures. Pour commencer, cultivez et maintenez les nématodes à 20 degrés Celsius sur les plaques NGM. Age les nématodes jusqu’au quatrième jour de la vie que les jeunes adultes et le huitième jour de la vie que les adultes âgés.Le jour de l’imagerie, commencez par préparer les diapositives d’imagerie. Placer l’agarose et l’eau distillée double à une concentration de 3% de poids en volume. Transférer dans un four à micro-ondes pour faire fondre, puis laisser refroidir légèrement.Couper la pointe d’une pointe de pipette d’un millilitre et prendre environ 200 microlitres de l’agarose fondue. Pipette l’agarose sur une glissière de verre propre et placez immédiatement une deuxième sur le dessus en évitant la formation de bulles. Laissez sécher les glissières et retirez délicatement la glissière supérieure en verre.Le résultat est une glissade en verre avec une surface même agarose où les nématodes seront positionnés. Une fois que la configuration d’imagerie est prête à l’emploi, travaillant sous un microscope stéréo, placez une goutte de 10 microlitres de composé anesthésique sur un tampon d’agarose et transférez doucement cinq à 10 nématodes dedans. Utilisez une pointe de cils pour séparer les nématodes.Gardez-les proches les uns des autres mais ne touchant pas pour permettre une localisation plus facile des nématodes lors de l’acquisition d’images. Superposer soigneusement les nématodes avec un coverslip. Moins d’une heure après le montage, prendre des mesures.Assurez-vous que les nématodes sont complètement immobiles. Ouvrez le logiciel d’acquisition FLIM. Localisez le bouton onglet et appuyez sur activer les sorties.Placez la glissière avec le C.elegans monté sur la scène et à l’aide d’un objectif de grossissement 10X en mode transmission, localisez la position des nématodes sur la diapositive. Retirez la glissière, passez l’objectif à un objectif de grossissement 63X et appliquez le milieu d’immersion requis. Placez la glissade sur la scène et localisez les nématodes.Commencez à numériser l’échantillon. Sélectionnez une région d’intérêt et concentrez-vous sur son plan de projection maximum. Sur l’interface du logiciel FLIM, prévisualisez le nombre de photons détectés.La valeur ADC doit être entre une fois 10 à la quatrième et une fois 10 à la cinquième. Si nécessaire, déplacez l’accent sur un plan différent ou augmentez la puissance laser pour recueillir plus de photons. Assurez-vous d’éviter le carambolage photon, mais de recueillir une quantité suffisante de photons pour créer un bon ajustement et la mesure à vie.Dans la barre de menu, sélectionnez l’onglet pour définir les paramètres d’acquisition. Sélectionnez la synchronisation d’analyse pour permettre la détection d’un seul photon. Définissez l’acquisition à un temps fixe ou à un nombre fixe de photons.Appuyez sur commencer l’acquisition. Ouvrez le logiciel et importez des fichiers de données FLIM via le fichier, chargez les données FLIM. Chargez tous les échantillons à partir d’une seule condition, même s’ils sont obtenus dans différentes sessions et à partir de différentes répétitions biologiques.Si nécessaire, segment à signaler nématode pour de nombreuses images FLIM via segmentation, gestionnaire de segmentation. Faites glisser l’outil de culture autour de la zone d’intérêt jusqu’à ce qu’il soit mis en évidence. Une fois terminé, appuyez sur OK. Sélectionnez une petite région où apparaît l’image basée sur l’intensité d’un C.elegans.La courbe de décomposition de cette région apparaît dans la grande fenêtre de décomposition sur le côté droit de l’interface. Pour extrapoler la durée de vie, sur l’onglet données, définissez une valeur minimale intégrée arbitraire entre 40 et 300 pour exclure tous les pixels trop faibles pour produire un bon ajustement. Sélectionnez un minimum de temps et un nombre maximum de temps pour limiter le signal FLIM à ces valeurs.Ne modifiez pas le photon de dénombrement prédéfinis d’un. Entrez le taux de répétition dans le mégahertz du laser utilisé lors de l’acquisition. Entrez une valeur maximale de porte pour exclure tous les pixels saturés.Sur l’onglet durée de vie, sélectionnez un raccord global à utiliser. Ne modifiez aucun autre paramètre, sauf le nombre de sélection exponentielle s’il est connu que la désintégration de fluorescence choisie est multi-exponentielle et présente plus d’une seule durée de vie. Téléchargez l’IRF via le menu IRF.Pour estimer le décalage IRF, sélectionnez IRF, estimer le décalage IRF. Un ensemble de valeurs s’affiche automatiquement sur l’onglet IRF. Une fois que cela est établi, ne modifiez pas d’autres paramètres de cet onglet.Une fois que tous les paramètres sont définis, appuyez sur l’ensemble de données d’ajustement. L’ajustement résultant mis en évidence dans une ligne bleue devrait se chevaucher avec tous les événements. Un bon ajustement est obtenu lorsque tous les événements sont alignés le long de l’ajustement.Cliquez sur l’onglet paramètres situé dans les menus en haut à droite de l’interface du logiciel et sélectionnez statistique, moyenne pondérée, et vérifiez que la valeur carrée chi est aussi proche que possible d’un. La valeur à vie de l’image sélectionnée est ainsi révélée comme tau one. Exportez toute information d’intérêt par le biais de fichiers, d’images d’intensité d’exportation, d’une table de résultats adaptée, d’images, d’histogrammes.Des cartes représentatives de C.elegans exprimant la DP Q40 musclée le quatrième jour ou le huitième jour de la vie sont présentées ici. Le tronçon Q plus long de l’IQ85 était plus enclin à l’agrégation et a montré un décalage à vie de fluorescence dans l’histogramme déjà au quatrième jour de la vie. En fait, au quatrième jour, la formation de foyers a été observée pour IQ85 alors qu’il était encore absent dans IQ44.Sur le vieillissement, cependant, IQ44 a également montré la formation de foyers et donc une durée de vie réduite de fluorescence. Enfin, la formation de foyers n’a pas été détectée et n’a pas diminué la durée de vie de fluorescence dans la souche NQ40CFP. Pour cette souche, il n’y avait que des changements subtils non significatifs à la durée de vie moyenne de fluorescence au vieillissement.Une fois que le modèle nématode est établi, la quantité de photons recueillis est primordiale pour obtenir un bon ajustement à vie. La méthode peut être davantage conjointe avec différentes techniques telles que le transfert d’énergie de résonance de Forster, fret, récupération de fluorescence après photobleaching, FRAP, ou mesure. Toutes ces adaptations fournissent des informations supplémentaires sur les propriétés des études protéiques et sa forme agrégée.Dans le domaine de l’agrégation protéique et de l’homéostasie protéique, la technique a permis d’étudier toute perturbation imposée au système, la distribution de différentes espèces de protéines, et le trafic et en général la différence et l’importance des fractions de protéines solubles et insolubles au sein de l’organisme vivant. L’azide de sodium anesthésique est toxique et doit être manipulé avec des gants et des lunettes et dilué sous une hotte de fumée. Parce que la technique est basée sur la microscopie, il est important de suivre tous les avertissements liés au travail avec les lasers.

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