Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay

Nous utilisons ce test pour évaluer si les aliments végétaux contiennent des phytostéroïdes, qui peuvent affecter les processus physiologiques chez les animaux, ainsi que le comportement et le succès reproducteur. Ce test fournit une méthode simple et fiable pour déterminer si les plantes produisent des composés œstrogéniques ayant une activité biologique. Cette méthode a été développée à l’origine pour cribler des médicaments ayant une activité xénoestrogénique pour des applications en médecine.

Par exemple, inhiber la prolifération cellulaire. Nous l’utilisons pour donner un aperçu de l’écologie et de l’évolution des primates. Il est important de s’entraîner à travailler avec la technique aseptique dans un environnement propre avant de tenter ce test, car elle est très sensible à la contamination.

Commencez par lyophiliser les plantes fraîches avec le lyophilisateur, puis broyez-les finement à l’aide d’un broyeur avec un tamis à mailles de 0,85 millimètre. Conservez les échantillons de sol dans des sacs à l’obscurité jusqu’à l’extraction. Pour extraire tout phytostéroïde potentiel dans les plantes, ajoutez l’échantillon séché dans un flacon de taille appropriée, puis du méthanol de qualité HPLC.

Recouvrez la solution de méthanol végétal d’une feuille d’aluminium et réglez-la pour qu’elle tourne à 100 tr/min pendant trois jours sur un agitateur orbital. Après trois jours, utilisez du papier filtre pour décanter le surin et le placer dans un système de filtration goutte à goutte. Séchez l’extrait de plante avec un évaporateur rotatif jusqu’à ce qu’il épaississe, mais versable dans une fiole à fond rond de 300 millilitres.

Versez l’échantillon dans une fiole de 50 millilitres et rincez la grande fiole avec une petite quantité de méthanol, puis continuez à sécher l’échantillon dans la petite fiole jusqu’à ce que le méthanol soit complètement évaporé. Une fois terminé, pesez le résidu de l’échantillon à l’aide d’une balance analytique et notez la masse. Dissoudre l’extrait de plante dans du DMSO à une concentration de 0,1 gramme d’extrait pour deux millilitres de DMSO et le mélanger jusqu’à homogénéisation.

Le DMSO n’est pas toxique en soi, mais c’est un véhicule qui permet à d’autres substances de traverser les membranes. Comme nous ne savons pas si nos plantes contiennent des produits chimiques toxiques, toutes sont traitées comme si elles étaient dangereuses. Ne laissez pas la solution toucher la peau, remplacez les gants s’ils sont contaminés et portez des chaussures épaisses à bout fermé et des blouses de laboratoire.

Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius dans des flacons en verre ambré jusqu’au moment de l’utiliser. Vortex les échantillons, puis ajoutez quatre microlitres de chaque échantillon à 496 microlitres de milieu de criblage composé pour obtenir une solution de DMSO à 0,8 %. Désinfectez la surface extérieure d’un tube de milieu de récupération de cellules préchauffé avec de l’éthanol à 70 % et transférez 10 millilitres de milieu dans un tube de cellules rapporteures congelées pour les décongeler.

Fermez le tube des cellules rapporteures et placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. Après avoir récupéré les cellules du bain-marie, retournez doucement le tube plusieurs fois pour briser les agrégats de cellules et produire une suspension homogène, puis nettoyez la surface du tube avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une pipette multicanaux, 100 microlitres de suspension de cellule rapporteure sont injectés dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, puis distribuent 100 microlitres d’échantillons en trois exemplaires dans les puits appropriés.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 22 à 24 heures. Juste avant la fin de l’incubation de la plaque, retirez le substrat de détection et le tampon de détection du réfrigérateur et placez-les dans un endroit peu éclairé jusqu’à ce qu’ils soient équilibrés à la température ambiante, puis retournez doucement chaque tube pour mélanger les solutions. Immédiatement avant la fin de l’incubation de la plaque, versez tout le contenu du tampon de détection dans le tube de substrat de détection pour créer un réactif de détection de luciférase.

Mélangez doucement le tube pour ne pas produire de mousse. Jetez le contenu de la plaque d’échantillon dans un récipient à déchets inapproprié et tapotez-le doucement sur une serviette en papier absorbante propre pour éliminer les dernières gouttelettes des puits. Ajoutez 100 microlitres de réactif de détection de luciférase dans chaque puits et laissez reposer la plaque de test à température ambiante pendant 15 minutes, puis quantifiez la luminescence à l’aide d’un luminomètre à lecture de plaque à 96 puits.

22 extraits de fruits et de légumes couramment trouvés dans l’alimentation humaine ont été testés pour la présence de composés œstrogéniques. L’activité œstrogénique est présentée de manière qualitative ordinale de l’activité élevée, moyenne, faible ou nulle. Le soja biologique et non biologique a enregistré des niveaux d’activité élevés, tandis que tous les autres fruits et légumes n’ont enregistré aucune activité.

La comparaison des résultats du soja à la courbe standard montre également qu’ils ont des niveaux d’activité œstrogénique élevés à cette concentration. L’extrait de soja, une source puissante connue d’isoflavones, de daidzéine et de génistéine, a ensuite été utilisé pour déterminer la dilution, produisant un signal de 50 % au maximum. Cet extrait nécessite 422 fois plus de dilution pour produire la moitié du signal de notre protocole de dilution standard.

Les échantillons identifiés avec une activité pourraient être envoyés pour analyse par spectrométrie de masse afin d’identifier les produits chimiques actifs. En utilisant une méthode antagoniste, nous pourrions également déterminer si l’aliment végétal contient des produits chimiques qui réduisent la liaison et l’activité des œstrogènes endogènes. Cette technique nous permet de mieux comprendre la prévalence des aliments œstrogéniques dans l’alimentation des primates, ainsi que la façon dont la consommation de phytoestrogènes affecte la physiologie et le comportement lorsque le test est combiné à des analyses d’hormones fécales et à des données de terrain.