Name: Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs des donneurs humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez le système autonome translaminaire pour moduler la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs humains. Cette méthode permet d'étudier le glaucome et les neuropathies optiques.

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Ce projet a été financé par des fonds discrétionnaires de la Dre Colleen M. McDowell. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, Inc. au département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de l’UW Madison. Nous remercions les Drs Abbot F. Clark et Weiming Mao pour leur assistance technique avec le modèle de culture d’organes de perfusion. Nous remercions le Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) d’avoir fourni les yeux de donneurs humains.

Les yeux ont été obtenus conformément aux dispositions de la Déclaration d’Helsinki pour la recherche sur les tissus humains.
REMARQUE : Des yeux provenant de banques d’yeux réputées (p. ex., Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) ont été prélevés dans les 6 à 12 heures suivant le décès et le sérum du donneur a été testé pour l’hépatite B, l’hépatite C et les virus d’immunodéficience humaine 1 et 2. Une fois reçus, les yeux ont été disséqués et installés dans le modèle TAS dans les 24 heures. Les critères d’exclusion incluaient toute pathologie oculaire. Les yeux n’ont pas été exclus en fonction de l’âge, de la race ou du sexe. Pour assurer la viabilité de la rétine dès réception, des explantes rétiniennes ont été prélevées sur les donneurs de tissus et cultivées pendant 7 et 14 jours (figure supplémentaire 1). Ces rétines ont également été dissociées et ont développé des CGR sains en culture pendant 7 jours avec une coloration positive pour le marqueur RGC, une protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), ainsi qu’une coloration positive de la chaîne légère des neurofilaments (NEFL) dans leurs neurofilaments (figure supplémentaire 2). .
1. Préparation et stérilisation de l’équipement et des fournitures
<ol><li>Reportez-vous à la Table des matériaux pour obtenir la liste complète des fournitures requises ainsi que les numéros de fournisseur et de catalogue.</li>
	<li>Avant utilisation, stériliser tout l’équipement et les instruments en autoclavant ou en utilisant des ampoules d’oxyde d’éthylène.</li>
</ol>2. Préparation du milieu de perfusion
<ol><li>Ajouter 1 % de streptomycine de pénicilline (10 000 U/mL de pénicilline, 10 000 μg/mL de streptomycine dans 0,85 % de NaCl) et 1 % de L-glutamine (200 mM) à 1 000 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à 1 000 mL de glucose élevé.</li>
	<li>Stériliser le milieu de perfusion en passant à travers un filtre de 0,22 μm.</li>
</ol>3. Configuration du système autonome translaminaire (TAS)
<ol><li>Mettre en place des seringues d’entrée (réservoirs IOP et ICP).<ol>
<li>Ajouter 30 mL du milieu de perfusion (rubrique 2) à une seringue de 30 mL. Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à la seringue de 30 mL. Fixez un filtre hydrophile de 0,22 μm au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez un adaptateur de stub Luer 15 G au filtre hydrophile de 0,22 μm.</li>
		<li>Retirez les bulles d’air de la configuration de la seringue. Fixez le tube à l’adaptateur de tige 15 G Luer. Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt à l’aide d’un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations.</li>
		<li>Étiqueter une seringue comme pression intracrânienne du canal 1 (CH1 ICP) et l’autre seringue comme pression intraoculaire du canal 2 (CH2 IOP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettre en place des seringues de sortie (réservoirs IOP et ICP).<ol>
<li>Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à une seringue de 30 mL. Fixez un adaptateur de stub Luer 15 G au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez le tube à l’adaptateur de tige 15 G Luer.</li>
		<li>Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt à l’aide d’un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations. Étiquetez une seringue comme CH1 ICP et l’autre seringue comme CH2 IOP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Préparation du globe oculaire entier humain
REMARQUE: Si des yeux entiers sont reçus, suivez la procédure ci-dessous pour séparer le segment antérieur du segment postérieur de l’œil. Si les yeux sont coupés en deux, commencez à l’étape 4.4.
<ol><li>Placer un œil entier dans une solution de povidone-iode pendant 2 min.</li>
	<li>Rincez l’œil dans une solution tamponnée stérile au phosphate (PBS) pour rincer la povidone-iode. Répétez 2 fois.</li>
	<li>Retirez l’annexée de tout le globe oculaire à l’aide d’une pince et de ciseaux. Coupez l’œil en deux à l’équateur pour séparer les segments antérieur et postérieur de l’œil.</li>
	<li>Retirez la gaine du nerf optique. Retirez l’humeur vitrée du segment postérieur.</li>
	<li>Coupez la sclérotique supplémentaire du segment postérieur, si nécessaire, pour assurer un bon ajustement sur le dôme rond de la chambre IOP (inférieure). À l’aide de pinces, assurez-vous que la rétine est répartie uniformément sur le postérieur du segment.</li>
	<li>Configuration de la chambre IOP (inférieure)<ol>
<li>Placez le segment postérieur humain dans la chambre IOP (inférieure) du TAS sur le dôme rond avec le nerf optique orienté vers le haut.</li>
		<li>Scellez le segment postérieur à l’aide du joint torique en résine époxy avec quatre vis, assurant une étanchéité étanche.</li>
		<li>Insérez le tuyau dans les orifices IN et OUT de la chambre IOP (inférieure). La seringue d’entrée IOP avec tube contenant un milieu est insérée dans le port IN et la seringue de sortie IOP vide avec tube est insérée dans le port OUT.</li>
		<li>Utilisez la méthode push/pull pour infuser lentement le milieu de perfusion dans l’orifice d’entrée pour remplir la coupe oculaire postérieure tout en tirant lentement le fluide de perfusion à travers la seringue d’écoulement pour éliminer les bulles d’air des lignes. Arrêtez d’infuser du milieu une fois que les tubes IN et OUT sont dépourvus de bulles d’air.</li>
		<li>Verrouillez les robinets d’arrêt en position off. Retirez la seringue de 30 mL de l’ensemble de filtre à orifice IOP IN et remplissez-la avec un total de 30 mL de milieu. Remplacez la seringue de 30 mL sur l’ensemble filtrant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuration de la chambre ICP (en haut)
	<ol>
<li>Placez la chambre/le couvercle ICP (en haut) sur l’arrière du segment postérieur. Assurez-vous que le nerf optique se trouve dans la chambre supérieure. Scellez la chambre supérieure avec quatre vis.</li>
		<li>Insérez le tuyau dans les orifices IN et OUT de la chambre ICP (supérieure). La seringue d’entrée ICP avec tube contenant un milieu est insérée dans le port IN et la seringue de sortie ICP vide avec tube est insérée dans le port OUT.</li>
		<li>Infuser doucement et lentement le fluide dans le port IN pour remplir la chambre ICP et éliminer les bulles d’air des lignes à l’aide de la méthode push/pull. Arrêtez d’infuser le milieu une fois que la chambre ICP ainsi que les tubes IN et OUT sont dépourvus de bulles d’air.</li>
		<li>Verrouillez les robinets d’arrêt en position off. Retirez la seringue de 30 mL de l’ICP dans l’ensemble du filtre à orifice et remplissez-la avec un total de 30 mL de milieu. Remplacez la seringue de 30 mL sur l’ensemble filtrant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Configuration du système d’enregistrement de données
REMARQUE: Le système d’enregistrement de données est composé d’une source d’alimentation à 8 canaux, d’un amplificateur de pont multicanal, de transducteurs de pression hydrostatiques et d’un ordinateur avec un logiciel d’acquisition de données (voir tableau des matériaux). Ce qui suit décrit comment configurer et calibrer le système.
<ol><li>Connectez le cordon d’alimentation à l’arrière de la source d’alimentation à 8 canaux et branchez-le sur un périphérique de secours de batterie.</li>
	<li>Connectez le câble USB de la source d’alimentation à 8 canaux à l’arrière de l’ordinateur.</li>
	<li>Connectez la source d’alimentation à 8 canaux à l’amplificateur de pont multicanal à l’aide du cordon I2C fourni.</li>
	<li>Connectez les câbles BNC (Bayonet Neill-Concelman) aux entrées de canal devant la source d’alimentation à 8 canaux et l’extrémité des câbles aux canaux correspondants à l’arrière de l’amplificateur multicanal.</li>
	<li>Connectez les câbles du transducteur à l’avant de l’amplificateur multicanal.</li>
	<li>Installez le logiciel d’acquisition de données sur l’ordinateur.<ol>
<li>Exécutez le programme d’installation du logiciel d’acquisition de données à partir du CD du logiciel fourni.</li>
		<li>Suivez les instructions à l’écran de l’ordinateur.</li>
		<li>Une fois l’installation terminée, sélectionnez Terminer.</li>
	</ol></li>
	<li>Allumez la source d’alimentation à 8 canaux.</li>
	<li>Allumez l’ordinateur et lancez le logiciel d’acquisition de données.<ol>
<li>Sélectionnez | de fichier Nouveau.
</li>
		<li>Sélectionnez | d’installation Paramètres de la chaîne. Sélectionnez trois canaux (en bas à gauche de l’écran). Dans la colonne Titre du canal, renommez les canaux comme suit : CH1 ICP ; CH2 PIO; CH3 TLPG (IOP-ICP).</li>
		<li>Sélectionnez 2 mV pour la portée sur tous les canaux. Dans la colonne Calcul, sélectionnez Aucun calcul pour les canaux 1 et 2.</li>
		<li>Dans la colonne Calcul, sélectionnez Arithmétique pour le canal 3. Dans la section Formule : Sélectionnez les canaux/CH2 ; Sélectionnez l’arithmétique « -« ; Sélectionnez les canaux/CH1. Dans la section Sortie, sélectionnez mmHg. Sélectionnez OK. Sélectionnez à nouveau OK .</li>
	</ol></li>
	<li>Installez et calibrez les transducteurs de pression hydrostatiques. REMARQUE: Les transducteurs de pression hydrostatiques doivent être étalonnés avant les expériences en utilisant la méthode suivante.<ol>
<li>Connectez les transducteurs de pression hydrostatiques aux lignes de transducteur attachées à l’amplificateur de pont multicanal.</li>
		<li>Fixez une seringue de 30 mL remplie d’air à l’orifice latéral du transducteur de pression CH1 (ICP). Fixez le sphygmomanomètre au bas du transducteur de pression CH1 (ICP).</li>
		<li>Sur le graphique, affichez la page du logiciel d’acquisition de données, définissez la vitesse d’échantillonnage en cliquant avec le bouton gauche de la flèche à côté du temps d’échantillonnage et sélectionnez 100. Cliquez ensuite avec le bouton droit de la souris dans la zone CH1 (ICP) de la page.</li>
		<li>Sélectionnez Bridge Amp. Sélectionnez Filtre secteur. Sélectionnez Zéro et attendez que le système soit à zéro, en prenant soin de ne pas déplacer le transducteur de pression.</li>
		<li>Pincez les languettes blanches du transducteur de pression et poussez l’air à travers le transducteur jusqu’à ce que 40 mmHg soient obtenus sur le sphygmomanomètre. Relâchez les languettes blanches et retirez la seringue et le sphygmomanomètre.</li>
		<li>Sur la page Conversion d’unités , sélectionnez le signe 'moins (-)'. Mettez en surbrillance le plateau le plus élevé pour indiquer 40 mmHg. Cliquez sur la flèche du point 1 et entrez 40.</li>
		<li>Mettez en surbrillance le plateau le plus bas pour indiquer 0 mmHg. Cliquez sur la flèche du point 2 et entrez 0. Sélectionnez mmHg pour les unités. Sélectionnez OK.</li>
		<li>Sélectionnez OK (page Bridge Amp). Répétez les étapes 9.1 à 9.7 pour le CH2 (IOP) en utilisant 100 mmHg pour le plateau le plus élevé et 0 pour le plateau le plus bas.</li>
	</ol></li>
	<li>Connectez l’unité TAS/segment postérieur au système d’acquisition de données.<ol>
<li>Placer l’unité TAS/segment postérieur dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2). Fixez le tube ICP de l’orifice OUT au transducteur de pression CH1 (ICP).</li>
		<li>Fixez le tube IOP de l’orifice OUT au transducteur de pression CH2 (IOP).</li>
		<li>Fixez les configurations de seringue (ICP et IOP) avec un support entre les ports IN et le support annulaire.</li>
		<li>Dans la page Vue graphique, sélectionnez Démarrer l’échantillonnage. Réglez la vitesse d’échantillonnage en cliquant avec le bouton gauche de la flèche à côté du temps d’échantillonnage et sélectionnez Lent et 1 min.</li>
		<li>Ajustez les seringues sur l’anneau vers le haut ou vers le bas pour réguler les pressions ICP et IOP aux exigences du protocole.</li>
		<li>Effectuez un réapprovisionnement systémique du milieu dans le système toutes les 48 à 72 heures grâce à la méthode push and pull.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Récupération et analyse des données
<ol><li>Ouvrez le fichier de données dans le logiciel d’acquisition de données.</li>
	<li>Dans la section Data Pad , cliquez sur l’icône Multiple Add to Data Pad . Une nouvelle fenêtre apparaîtra.<ol>
<li>Dans la section Rechercher à l’aide , sélectionnez Heure dans le menu déroulant.</li>
		<li>Dans la section Sélectionner , sélectionnez 1 heure toutes les 1 heure dans les menus déroulants.</li>
		<li>Dans la section Étape par étape, sélectionnez Fichier entier , puis cliquez sur Ajouter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dans la section Data Pad , cliquez sur l’icône Data Pad View . Mettez en surbrillance toutes les données et copiez/collez-les dans une feuille de calcul.</li>
	<li>Calculez les écarts-types et moyens pour IOP, ICP et TLPG toutes les 24 heures. Rassemblez les données à l’aide de l’option de tableau croisé dynamique dans un tableur et un graphique.</li>
</ol>7. Immunohistochimie et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des segments postérieurs
<ol><li>Retirez les segments postérieurs de l’œil suivant divers points temporels du modèle TAS et fixez-les dans le formol avant la paraffinisation.</li>
	<li>Sectionner les yeux pour produire des plans de tissu sagittal.</li>
	<li>Déparaffinez les segments incorporés à la paraffine avec une solution 100% xylène, 95% éthanol, 50% éthanol.</li>
	<li>Lavez les lames avec PBS pendant 10 min et bloquez avec un tampon de blocage à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Sections d’étiquetage avec anticorps primaires : anti-collagène IV (marqueur de matrice extracellulaire (ECM), NB120-6586, 1:100) et anti-laminine (marqueur ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marqueur RGC), GTX118619, 1:50).</li>
	<li>Détecter les anticorps primaires à l’aide des anticorps secondaires Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin, A11008, 1:500).</li>
	<li>Contre-tache les noyaux cellulaires à l’aide d’une solution anti-décoloration DAPI.</li>
	<li>Capturez des images des sections colorées et des images de phase avec des lentilles d’objectif 4x et 10x à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), traiter les sections dans un système de coloration automatisé (voir tableau des matériaux) pour la déparaffinisation à l’aide d’une solution d’éthanol à 100%, de xylène à 95%, d’éthanol à 50% et de coloration avec H & E.</li>
	<li>Capturez des images avec les objectifs 4x et 10x à l’aide d’un microscope avec une source de lumière à champ lumineux.</li>
</ol>

Les auteurs du manuscrit n’ont aucun conflit d’intérêts potentiel à divulguer.

Les tissus post-mortem humains sont une ressource particulièrement précieuse pour l’étude des maladies neurodégénératives humaines, car l’identification des médicaments potentiels développés dans des modèles animaux doit pouvoir être transposable aux humains47. Les effets de l’élévation de la PIO chez l’homme sont bien établis, mais peu de recherches ont été effectuées sur les changements anormaux de pression translaminaire de l’ONH. Même s’il existe plusieurs modèles animaux et une modélisation f...

Les estimations mondiales de sondages récents suggèrent que 285 millions de personnes vivent avec une déficience visuelle, dont 39 millions sont aveugles1. En 2010, l’Organisation mondiale de la santé a documenté que trois des neuf principales causes de cécité répertoriées se produisent dans le segment postérieur de l’œil1. Les maladies oculaires du segment postérieur impliquent la rétine, la choroïde et le nerf optique2. La rétine et le nerf optique sont des extensions du système nerveux central (SNC) du cerveau. Les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) sont vulnérables aux dommages parce qu’ils sortent de l’œil par la tête du nerf optique (ONH) pour former le nerf optique3. L’ONH reste le point le plus vulnérable pour les axones RGC en raison du maillage 3D de faisceaux de tissu conjonctif appelé lamina cribrosa (LC)4. L’ONH est le site initial d’insulte aux axones RGC dans le glaucome5,6,7, et les changements d’expression génique au sein de l’ONH ont été étudiés dans des modèles d’hypertension oculaire et de glaucome8,9,10. Les axones RGC sont sensibles à l’ONH en raison des différences de pression entre le compartiment intraoculaire, appelé pression intraoculaire (PIO), et dans l’espace sous-arachnoïdien périoptique externe, appelé pression intracrânienne (ICP)11. La région LC sépare les deux zones, maintenant des différentiels de pression normaux, avec une PIO allant de 10 à 21 mmHg et une ICP de 5 à 15 mmHg12. La différence de pression à travers la lame entre les deux chambres est appelée gradient de pression translaminaire (TLPG)13. Un facteur de risque majeur de glaucome est la PIO14 élevée.
L’augmentation de la PIO augmente la tension à l’intérieur et à travers la région laminaire6,15,16. Des observations expérimentales chez l’homme et des modèles animaux présentent l’ONH comme étant le site initial de lésions axonales17,18. Le paradigme biomécanique du stress et de la souche liés à la PIO causant des dommages glaucomateux à l’ONH influence également la physiopathologie du glaucome19,20,21. Même si chez l’homme, les changements induits par la pression endommagent mécaniquement les axones RGC22, les rongeurs dépourvus de plaques collagènes dans la lame peuvent également développer un glaucome7,23. En outre, une PIO élevée reste le facteur de risque le plus important chez les patients atteints de glaucome primaire à angle ouvert, tandis que les patients atteints de glaucome de tension normale développent une neuropathie optique glaucomateuse même sans PIO élevée. En outre, il existe également un sous-ensemble de patients hypertendus oculaires qui ne présentent aucune lésion du nerf optique. Il a également été suggéré que la pression du liquide céphalo-rachidien (CSFp) pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse du glaucome. Les preuves indiquent que la PCI est abaissée à environ 5 mmHg chez les patients atteints de glaucome par rapport aux individus normaux, provoquant ainsi une augmentation de la pression translaminaire et jouant un rôle crucial dans la maladie24,25. Auparavant, il a été démontré dans un modèle canin qu’en contrôlant les changements IOP et CSFp, il peut y avoir de grands déplacements du disque optique26. L’élévation du CSFp dans les yeux porcins a également montré une augmentation de la souche principale dans la région LC et le tissu neural rétrolaminaire. Une pression accrue sur les CGR et la région LC contribue au blocage du transport axonal et à la perte de CGR27. La dégénérescence progressive des CGR a été associée à la perte du soutien trophique28,29, à la stimulation des processus inflammatoires/ régulation immunitaire30,31 et aux effecteurs apoptotiques29,32,33,34,35. De plus, une lésion axonale (figure 3) provoque des effets néfastes sur les CGR, déclenchant une défaillance de la régénération36,37,38,39. Même si les effets de la PIO ont été bien étudiés, peu de recherches ont été effectuées sur les changements anormaux de pression translaminaire. La plupart des traitements du glaucome se concentrent sur la stabilisation de la PIO. Cependant, même si l’abaissement de la PIO ralentit la progression de la maladie, il n’inverse pas la perte de champ visuel et n’empêche pas la perte complète des CGR. Comprendre les changements neurodégénératifs liés à la pression dans le glaucome sera crucial pour prévenir la mort du RGC.
Les preuves actuelles indiquent que les modulations de pression translaminaire dues à divers changements mécaniques, biologiques ou physiologiques chez les patients souffrant de déficiences visuelles traumatiques ou neurodégénératives peuvent entraîner une perte de vision importante. À l’heure actuelle, il n’existe aucun véritable modèle préclinique de segment postérieur humain qui puisse permettre l’étude des dommages biomécaniques glaucomateux au sein de l’ONH humain ex vivo. L’observation et le traitement du segment postérieur de l’œil est un énorme défi en ophtalmologie27. Il existe des barrières physiques et biologiques pour cibler l’œil postérieur, notamment des taux d’élimination élevés, une barrière hémato-rétinienne et des réponses immunologiques potentielles40. La plupart des tests d’efficacité et d’innocuité pour les nouvelles cibles médicamenteuses sont réalisés à l’aide de modèles cellulaires in vitro et de modèles animaux in vivo41. L’anatomie oculaire est complexe et les études in vitro n’imitent pas avec précision les barrières anatomiques et physiologiques présentées par les systèmes de modèles tissulaires. Même si les modèles animaux sont une nécessité pour les études pharmacocinétiques, la physiologie oculaire de l’œil postérieur humain peut varier entre diverses espèces animales, y compris l’anatomie cellulaire de la rétine, le système vasculaire et l’ONH41,42.
L’utilisation d’animaux vivants nécessite des réglementations éthiques intensives et détaillées, un engagement financier élevé et une reproductibilité efficace43. Récemment, de nombreuses autres lignes directrices ont été suivies pour l’utilisation éthique des animaux dans la recherche expérimentale44,45,46. Une alternative à l’expérimentation animale est l’utilisation de modèles oculaires humains ex vivo pour étudier la pathogenèse de la maladie et l’analyse potentielle de médicaments pour protéger les dommages causés par les ONH. Le tissu post-mortem humain est une ressource précieuse pour étudier les paradigmes des maladies humaines, en particulier dans le cas des maladies neurodégénératives humaines, car l’identification des médicaments potentiels développés dans des modèles animaux nécessite la nécessité d’être traduisible à l’homme47. Le tissu de donneur humain ex vivo a été largement utilisé pour l’étude des troubles humains47,48,49, et les systèmes de culture d’organes de perfusion du segment antérieur humain ont déjà fourni un modèle ex vivo unique pour étudier la physiopathologie de la PIO50,51,52 élevée.
Pour étudier la pression translaminaire liée à la PIO et à la PCI dans les yeux humains, nous avons conçu et développé avec succès un système autonome translaminaire (TAS) à deux chambres qui peut réguler indépendamment la PIO et la PCI en utilisant les segments postérieurs des yeux de donneurs humains. Il s’agit du premier modèle humain ex vivo à étudier la pression translaminaire et à exploiter les effets biomécaniques du TLPG sur l’ONH.
Ce modèle TAS humain ex vivo peut être utilisé pour découvrir et classer les modifications cellulaires et fonctionnelles qui se produisent en raison d’une élévation chronique de la PIO ou de la PCI. Dans ce rapport, nous détaillons le protocole étape par étape de dissection, de configuration et de surveillance du modèle de segment postérieur humain TAS. Le protocole permettra à d’autres chercheurs de reproduire efficacement ce nouveau modèle de segment postérieur humain sous pression ex vivo pour étudier la pathogenèse des maladies biomécaniques.

<table><tbody><tr><td>#122, 1-1/8 » Intérieur x 1-5/16 » Diamètre extérieur, Joint torique Viton, 3/32 » d’épaisseur, 755 Duromètre Paquet de 50</td><td>Amazon</td><td>B07DRGPPZJ</td><td></td></tr><tr><td>114 Joint torique Buna-N, Duromètre 70A, Noir, 5/8 » ID, 13/16 » OD, 3/32 » Largeur (paquet de 100)</td><td>Amazon</td><td>B000FMYRHK</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 30 ml sans aiguille</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à 3 voies, 2 Luer Locks femelles, Luer Lock mâle pivotant, Capuchon ventilé</td><td>QOSINA</td><td>2C6201</td><td></td></tr><tr><td>4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & Tournevis cruciforme</td><td>Brikksen de taille appropriée Fixations en acier inoxydable</td><td>PPMSSSCH4C.5</td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>ANPROLENE 16 GRANDE AMPULE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9085343</td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>PUR1815001EACH</td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>Corning 100 x 20mm boîtes de culture traitées pour culture tissulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-100EA</td><<td>strong>&nbsp ; </td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Solution de L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 3033 Éponge de gaze Curity, 4 » x 4 », 12 plis, stérile, 1200/CS</td><td>Med Plus Medical Supply</td><td>COV-3033-CS</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pansement Délicate Courbée (dentelée)</td><td>Katena</td><td>K5-4010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pince fine</td><td>F.S.T.</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux pour les yeux Standard incurvé</td><td>Katena</td><td>K4-7410</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes</td><td>Capitol Scientific</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Conteneurs pour échantillons de 4 oz</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sachets de stérilisation à fermeture instantanée</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sachets de stérilisation à scellage instantané</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-55</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sachets de stérilisation à scellage instantané</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-58</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco’s Modified Eagles Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3024302</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Pénicilline Streptomycine 100X Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Filtre hydrophile avec entrée Luer Lock femelle, sortie Luer Slip mâle, bleu et transparent</td><td>Qosina</td><td>28217</td><td></td></tr><tr><td>Transducteurs de pression hydrostatique, DELTRAN &reg ; II, Catalogue # DPT-200 avec un débit de 3CC/HR</td><td>AD instruments</td><td>DPT-200</td><td></td></tr><tr><td>JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box</td><td>Jenson Global</td><td>JG15-0.5HPX 15</td><td></td></tr><tr><td>Keyence B2 ? Microscope X710</td><td>Keyence</td><td>B2-X710</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8</td><td>AD instruments</td><td>LabChart 8</td><td></td></tr><tr><td>Leica ST5020 Multi-colorant</td><td>Leica</td><td>ST5020</td><td></td></tr><tr><td>Non-Vented Universal Luer Lock Cap, blanc</td><td>QOSINA</td><td>65811</td><td></td></tr><tr><td>Octal Bridge Amp (Modèle # FE228)</td><td>AD instruments</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products ALCOOL ÉTHYLIQUE, 200 PREUVE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1675398</td><td></td></tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35 (Modèle # PL3508)</td><td>AD instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Raccord de tube Push-to-Connect pour l’air et l’eau&nbsp ; Adaptateur droit, tube 1/8" OD x 1/8 NPT mâle</td><td>McMAster-Carr</td><td>7880T113</td><td></td></tr><tr><td>Raccord de tube Push-to-Connect avec filetage universel&nbsp ; pour l’air et l’eau, Adaptateur, Tube 1/8" OD x 1/8 Tuyau</td><td>McMAster-Carr</td><td>51235K101</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Tuyau flexible 500 ft.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-268</td><td></td></tr><tr><td>Superblock T20</td> Fisher <td>Scientific</td><td>PI37536</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux - Sharp-Blunt</td><td>F.S.T.</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus Dents délicates 1x2 Courbées</td><td>Katena</td><td>K5-4110</td><td></td></tr><tr><td>Système autonome translaminaire (TAS)</td><td>University of North Texas Health Science Center</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>USA Taille 030 Joint torique Buna-N, B1000, 70 Duromètre, Noir, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)</td><td>Marco Rubber & Plastiques</td><td>B1000-030</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs des donneurs humains

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

Il existe actuellement un besoin non satisfait d’un nouveau modèle humain préclinique capable de cibler l’étiologie de la maladie ex vivo en utilisant la pression intracrânienne (PCI) et la pression intraoculaire (PIO) qui peuvent identifier divers paradigmes pathogènes liés à la pathogenèse du glaucome. Les modèles ex vivo de perfusion du segment antérieur humain ont déjà été utilisés et appliqués avec succès en tant que technologies efficaces pour la découverte de la pathogenèse du glaucome et l’essai de thérapies. Le dépistage préclinique des médicaments et la recherche effectuée sur les systèmes d’organes humains ex vivo peuvent être plus transposables à la recherche clinique. Cet article décrit en détail la génération et le fonctionnement d’un nouveau modèle de pression translaminaire humaine ex vivo appelé système autonome translaminaire (TAS). Le modèle TAS peut réguler indépendamment la PCI et la PIO à l’aide des segments postérieurs des donneurs humains. Le modèle permet d’étudier la pathogenèse de manière préclinique. Il peut réduire l’utilisation d’animaux vivants dans la recherche ophtalmique. Contrairement aux modèles expérimentaux in vitro, la structure, la complexité et l’intégrité des tissus de la tête du nerf optique (ONH) peuvent également être maintenues dans le modèle TAS ex vivo.

Conception et création du système autonome translaminaire La différence de pression translaminaire est un mécanisme clé potentiel dans la pathogenèse de diverses maladies, y compris le glaucome. Les utilisations du modèle décrit comprennent, sans toutefois s’y limiter, l’étude du glaucome (PIO élevée, peut-être diminution de la PCI), des lésions cérébrales traumatiques (PCI élevée) et de l’exposition à long terme à une déficience visuelle associée à la microgravité (PCI élevée, PIO élevée). Pour aider...

Nous décrivons et détaillons l’utilisation du système autonome translaminaire. Ce système utilise le segment postérieur humain pour réguler indépendamment la pression à l’intérieur du segment (intraoculaire) et entourant le nerf optique (intracrânien) afin de générer un gradient de pression translaminaire qui imite les caractéristiques de la neuropathie optique glaucomateuse.

Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs des donneurs humains

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

Ce nouveau système autonome translaminaire oculaire utilise le segment postérieur humain pour réguler indépendamment les pressions intraoculaires et intracrâniennes afin de générer un gradient de pression translaminaire. Le modèle TAS permet d’évaluer la pression intracrânienne humaine de manière préclinique ex vivo, ce qui n’était pas possible auparavant. Ce modèle pourrait potentiellement être utilisé pour étudier des maladies telles que le glaucome, les lésions cérébrales traumatiques, l’hypertension intracrânienne idiopathique et le syndrome neuro-oculaire associé aux vols spatiaux.Pour configurer les seringues d’entrée, chargez la seringue de 30 millilitres avec 30 millilitres du liquide de perfusion d’intérêt et fixez un robinet d’arrêt à trois voies à la seringue. Fixez un filtre hydrophile de 0,22 micromètre au robinet d’arrêt et fixez un adaptateur de talon Luer de calibre 15 au filtre hydrophile de 0,22 micromètre. Après avoir éliminé les bulles d’air de la configuration de la seringue, fixez le tube à l’adaptateur de talon Luer et fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt avec un capuchon de verrouillage universel non ventilé.Après avoir configuré une deuxième seringue d’entrée comme nous venons de le démontrer, étiquetez un canal de seringue ICP et étiquetez l’autre canal de seringue deux IOP. Installez ensuite les seringues de sortie comme nous venons de le voir, mais sans charger les seringues avec le fluide de perfusion. Pour préparer un échantillon de globe oculaire entier, retirez la gaine du nerf optique et retirez l’humeur vitrée du segment postérieur.Pour assurer un bon ajustement sur le dôme rond de la chambre de PIO, coupez la sclérotique supplémentaire du segment postérieur si nécessaire et utilisez des pinces pour vous assurer que la rétine est répartie uniformément sur la partie postérieure humaine du segment. Placez ensuite le segment dans la chambre IOP du TAS sur le dôme rond avec le nerf optique vers le haut, et utilisez un joint torique en résine époxy et quatre vis pour sceller le segment postérieur. Pour configurer la chambre IOP, insérez le tube dans les orifices d’entrée et de sortie de la chambre et insérez la seringue d’entrée IOP dans l’orifice d’entrée.Insérez la seringue de sortie de PIO vide dans l’orifice de sortie et utilisez la méthode push/pull pour infuser lentement le fluide de perfusion dans l’orifice d’entrée afin de remplir l’œilleton postérieur, tout en tirant lentement le fluide de perfusion à travers la seringue de sortie pour éliminer les bulles d’air des conduites. Une fois que les tubes d’entrée et de sortie sont vides de bulles d’air, arrêtez l’infusion et verrouillez les robinets d’arrêt en position d’arrêt. Retirez la seringue de l’ensemble de filtre IOP dans l’orifice et remplissez la seringue avec 30 millimètres supplémentaires de fluide, puis réinsérez la configuration de la seringue dans l’ensemble de filtre.Pour mettre en place la chambre ICP, placez la chambre à l’arrière du segment postérieur, en veillant à ce que le nerf optique se trouve à l’intérieur de la chambre supérieure, et scellez la chambre supérieure avec quatre vis, puis insérez le tube dans les orifices d’entrée et de sortie de la chambre ICP, la seringue d’entrée ICP dans l’orifice d’entrée, et la seringue de sortie ICP vide dans l’orifice de sortie pour rincer le système avec du fluide, comme cela vient d’être démontré. Pour configurer le système d’enregistrement des données, allumez la source d’alimentation à huit canaux et l’ordinateur, puis lancez le logiciel d’acquisition de données. Sélectionnez Fichier et Nouveau, puis Paramètres de configuration et de chaîne.Sélectionnez trois canaux et renommez-les comme indiqué. Sélectionnez deux millivolts pour la plage sur tous les canaux et dans la colonne Calcul, sélectionnez Aucun calcul pour les canaux un et deux. Sélectionnez Arithmétique pour le troisième canal Dans la fenêtre Formule, sous Canaux, sélectionnez Ch 2.Sous Fonction, sélectionnez Math et moins, et sous Canaux, sélectionnez Ch 1. Pour configurer et calibrer les transducteurs de pression hydrostatique, connectez les transducteurs de pression hydrostatique aux lignes de transducteurs fixées à l’amplificateur de pont multicanal, puis fixez une seringue vide de 30 millilitres à l’orifice latéral du transducteur de pression ICP du canal un. Fixez un tensiomètre au bas du transducteur de pression ICP du canal un et cliquez sur la flèche à côté du temps d’échantillonnage pour régler la vitesse d’échantillonnage sur 100.Sélectionnez Bridge Amp, Filtre secteur et Zéro, et attendez que le système se mette à zéro, en prenant soin de ne pas déplacer le transducteur de pression. Ensuite, pincez les languettes blanches du tensiomètre et poussez l’air à travers le transducteur jusqu’à ce que 40 millimètres de mercure soient obtenus sur le tensiomètre, puis relâchez les languettes blanches et retirez la seringue et le tensiomètre. Sur la page Conversion des unités, sélectionnez moins et mettez en surbrillance le plateau le plus élevé pour indiquer 40 millimètres de mercure.Cliquez sur la flèche 0,1, entrez 100 et mettez en surbrillance le plateau le plus bas pour indiquer zéro millimètre de mercure. Cliquez sur la flèche 0,2, entrez zéro, sélectionnez les millimètres de mercure pour les unités, puis cliquez sur OK. Dans la fenêtre Ampli de pont, cliquez sur OK et étalonnez les transducteurs de pression hydrostatique pour la deuxième voie IOP comme nous venons de le voir, en utilisant 100 millimètres de mercure pour le plateau le plus élevé et zéro pour le plateau le plus bas.Pour connecter l’unité de segment postérieur TAS au système d’acquisition de données, placez l’unité de segment postérieur TAS dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, et fixez le tube ICP à partir de l’orifice de sortie du transducteur de pression ICP du canal un. Fixez le tube IOP de l’orifice de sortie au transducteur de pression IOP du canal deux. Sur la page Vue graphique, sélectionnez Démarrer l’échantillonnage et définissez la vitesse d’échantillonnage sur Lente et une minute.Ajustez ensuite les seringues sur le support de l’anneau vers le haut ou vers le bas pour réguler les pressions ICP et IOP selon les exigences du protocole, ou placez-les sur des pompes à perfusion pour réguler la pression. Dans cette analyse représentative, le maintien des différentiels de pression normaux moyens dans les deux chambres a été testé à l’aide de divers paramètres des conditions IOP et ICP. Pour assurer la viabilité du tissu, le milieu dans le tissu a été remplacé toutes les 48 heures.Des augmentations minimes de pression se sont produites au moment de l’échange de milieu et n’ont pas affecté la viabilité ou la morphologie de la tête du nerf optique, comme observé par l’analyse immunohistochimique et l’expression du collagène IV aux jours 14 et 30 de l’expérience. L’augmentation ou la diminution de l’ICP sur différents points temporels permet de maintenir une plage de gradient de pression translaminaire élevé pendant sept jours. Après sept jours de gradient de pression translaminaire élevé, des ventouses et un épaississement ont été observés dans les segments postérieurs, et l’expression du collagène IV montre des faisceaux épaissis avec une expression accrue du signal au cours de la période expérimentale.L’imagerie de phase révèle des cellules ganglionnaires rétiniennes saines dans la couche de cellules ganglionnaires sans ventouses dans les segments de contrôle, tandis que les images provenant de cultures à gradient de pression translaminaire élevé présentent des ventouses étendues sans cellules ganglionnaires rétiniennes restantes dans la couche de fibres nerveuses rétiniennes, et un remodelage accru de la matrice extracellulaire. Cette technique permettra aux chercheurs d’étudier efficacement les paradigmes de maladies biomécaniques et de découvrir la pathogenèse moléculaire ciblant la pression translaminaire dans l’œil humain.

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Source : Sharma, T. P., et al., Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs du donneur humain. J. Vis. Exp. (2020). Cette vidéo montre la procédure de préparation d’un œil humain pour étudier les effets de la pression translaminaire sur la signalisation des cellules ganglionnaires rétiniennes en simulant les pressions intraoculaires et intracrâniennes dans un système autonome translaminaire.

 Développement d’un modèle de pression translaminaire à l’aide d’un système autonome translaminaire

Le modèle expérimental d’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) par dérivation sanguine contrôlée par pression intracrânienne chez le lapin combine les procédures standard - canulation de l’artère sous-clavière et ponction transcutanée de la citerne magna, ce qui permet d’imiter étroitement les conditions physiopathologiques humaines après une HSA. Nous présentons des instructions étape par étape et discutons des points chirurgicaux clés pour une création expérimentale réussie de l’HSA.

Le lapin de sang-shunt modèle pour l&#39;étude de aiguë et les séquelles tardives de hémorragie méningée: Aspects techniques

Maillage (TM) la migration trabéculaire dans l'espace du canal de Schlemm peut être induite par élévation de la pression aiguë par Sphygmomanomètre oculaire, et observé par domaine spectral tomographie par cohérence optique. L'objectif de cette méthode est de quantifier la réponse morphométrique de la sortie voies vivant à l'élévation de la pression aiguë dans les tissus vivants in situ.

Trabéculum Réponse à élévation de la pression dans la vie Oeil humain

Hypertension oculaire chronique est induite en appliquant une suture de circumlimbal chez les rats et les souris, conduisant à une détérioration fonctionnelle et structurelle des cellules ganglionnaires rétiniennes conformes de glaucome.

Un modèle de glaucome induit par la Suture Circumlimbal chez le rat et la souris

Le primate non humain (PSN) est un modèle idéal pour étudier les thérapies cellulaires rétiniennes humaines en raison des similitudes anatomiques et génétiques. Ce manuscrit décrit une méthode de transplantation sous-maculaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dans l’œil NHP et des stratégies pour prévenir les complications peropératoires associées à la manipulation maculaire.

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Les blessures oculaires du globe ouvert peuvent ne pas être traitées pendant plusieurs jours dans des scénarios ruraux ou militaires, entraînant la cécité. Des thérapies sont nécessaires pour minimiser la perte de vision. Ici, nous détaillons un modèle de lésion du globe ouvert de culture d’organes. Avec ce modèle, les traitements potentiels pour stabiliser ces blessures peuvent être correctement évalués.

Plate-forme de culture d’organes du segment antérieur pour le suivi des blessures du globe ouvert et des performances thérapeutiques

L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.

Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Ce protocole présente une approche trans-sclérale guidée par la vision transpupillaire pour administrer en toute sécurité et avec précision des greffons cellulaires sous-rétiniens, avec un faible taux de complications chirurgicales, chez des souris receveuses avec ou sans dégénérescence rétinienne.

Transplantation transsclérale guidée par voie transpupillaire de greffons sous-rétiniens dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne

Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

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