Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs des donneurs humains

Ce nouveau système autonome translaminaire oculaire utilise le segment postérieur humain pour réguler indépendamment les pressions intraoculaires et intracrâniennes afin de générer un gradient de pression translaminaire. Le modèle TAS permet d’évaluer la pression intracrânienne humaine de manière préclinique ex vivo, ce qui n’était pas possible auparavant. Ce modèle pourrait potentiellement être utilisé pour étudier des maladies telles que le glaucome, les lésions cérébrales traumatiques, l’hypertension intracrânienne idiopathique et le syndrome neuro-oculaire associé aux vols spatiaux.

Pour configurer les seringues d’entrée, chargez la seringue de 30 millilitres avec 30 millilitres du liquide de perfusion d’intérêt et fixez un robinet d’arrêt à trois voies à la seringue. Fixez un filtre hydrophile de 0,22 micromètre au robinet d’arrêt et fixez un adaptateur de talon Luer de calibre 15 au filtre hydrophile de 0,22 micromètre. Après avoir éliminé les bulles d’air de la configuration de la seringue, fixez le tube à l’adaptateur de talon Luer et fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt avec un capuchon de verrouillage universel non ventilé.

Après avoir configuré une deuxième seringue d’entrée comme nous venons de le démontrer, étiquetez un canal de seringue ICP et étiquetez l’autre canal de seringue deux IOP. Installez ensuite les seringues de sortie comme nous venons de le voir, mais sans charger les seringues avec le fluide de perfusion. Pour préparer un échantillon de globe oculaire entier, retirez la gaine du nerf optique et retirez l’humeur vitrée du segment postérieur.

Pour assurer un bon ajustement sur le dôme rond de la chambre de PIO, coupez la sclérotique supplémentaire du segment postérieur si nécessaire et utilisez des pinces pour vous assurer que la rétine est répartie uniformément sur la partie postérieure humaine du segment. Placez ensuite le segment dans la chambre IOP du TAS sur le dôme rond avec le nerf optique vers le haut, et utilisez un joint torique en résine époxy et quatre vis pour sceller le segment postérieur. Pour configurer la chambre IOP, insérez le tube dans les orifices d’entrée et de sortie de la chambre et insérez la seringue d’entrée IOP dans l’orifice d’entrée.

Insérez la seringue de sortie de PIO vide dans l’orifice de sortie et utilisez la méthode push/pull pour infuser lentement le fluide de perfusion dans l’orifice d’entrée afin de remplir l’œilleton postérieur, tout en tirant lentement le fluide de perfusion à travers la seringue de sortie pour éliminer les bulles d’air des conduites. Une fois que les tubes d’entrée et de sortie sont vides de bulles d’air, arrêtez l’infusion et verrouillez les robinets d’arrêt en position d’arrêt. Retirez la seringue de l’ensemble de filtre IOP dans l’orifice et remplissez la seringue avec 30 millimètres supplémentaires de fluide, puis réinsérez la configuration de la seringue dans l’ensemble de filtre.

Pour mettre en place la chambre ICP, placez la chambre à l’arrière du segment postérieur, en veillant à ce que le nerf optique se trouve à l’intérieur de la chambre supérieure, et scellez la chambre supérieure avec quatre vis, puis insérez le tube dans les orifices d’entrée et de sortie de la chambre ICP, la seringue d’entrée ICP dans l’orifice d’entrée, et la seringue de sortie ICP vide dans l’orifice de sortie pour rincer le système avec du fluide, comme cela vient d’être démontré. Pour configurer le système d’enregistrement des données, allumez la source d’alimentation à huit canaux et l’ordinateur, puis lancez le logiciel d’acquisition de données. Sélectionnez Fichier et Nouveau, puis Paramètres de configuration et de chaîne.

Sélectionnez trois canaux et renommez-les comme indiqué. Sélectionnez deux millivolts pour la plage sur tous les canaux et dans la colonne Calcul, sélectionnez Aucun calcul pour les canaux un et deux. Sélectionnez Arithmétique pour le troisième canal Dans la fenêtre Formule, sous Canaux, sélectionnez Ch 2.

Sous Fonction, sélectionnez Math et moins, et sous Canaux, sélectionnez Ch 1. Pour configurer et calibrer les transducteurs de pression hydrostatique, connectez les transducteurs de pression hydrostatique aux lignes de transducteurs fixées à l’amplificateur de pont multicanal, puis fixez une seringue vide de 30 millilitres à l’orifice latéral du transducteur de pression ICP du canal un. Fixez un tensiomètre au bas du transducteur de pression ICP du canal un et cliquez sur la flèche à côté du temps d’échantillonnage pour régler la vitesse d’échantillonnage sur 100.

Sélectionnez Bridge Amp, Filtre secteur et Zéro, et attendez que le système se mette à zéro, en prenant soin de ne pas déplacer le transducteur de pression. Ensuite, pincez les languettes blanches du tensiomètre et poussez l’air à travers le transducteur jusqu’à ce que 40 millimètres de mercure soient obtenus sur le tensiomètre, puis relâchez les languettes blanches et retirez la seringue et le tensiomètre. Sur la page Conversion des unités, sélectionnez moins et mettez en surbrillance le plateau le plus élevé pour indiquer 40 millimètres de mercure.

Cliquez sur la flèche 0,1, entrez 100 et mettez en surbrillance le plateau le plus bas pour indiquer zéro millimètre de mercure. Cliquez sur la flèche 0,2, entrez zéro, sélectionnez les millimètres de mercure pour les unités, puis cliquez sur OK. Dans la fenêtre Ampli de pont, cliquez sur OK et étalonnez les transducteurs de pression hydrostatique pour la deuxième voie IOP comme nous venons de le voir, en utilisant 100 millimètres de mercure pour le plateau le plus élevé et zéro pour le plateau le plus bas.

Pour connecter l’unité de segment postérieur TAS au système d’acquisition de données, placez l’unité de segment postérieur TAS dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, et fixez le tube ICP à partir de l’orifice de sortie du transducteur de pression ICP du canal un. Fixez le tube IOP de l’orifice de sortie au transducteur de pression IOP du canal deux. Sur la page Vue graphique, sélectionnez Démarrer l’échantillonnage et définissez la vitesse d’échantillonnage sur Lente et une minute.

Ajustez ensuite les seringues sur le support de l’anneau vers le haut ou vers le bas pour réguler les pressions ICP et IOP selon les exigences du protocole, ou placez-les sur des pompes à perfusion pour réguler la pression. Dans cette analyse représentative, le maintien des différentiels de pression normaux moyens dans les deux chambres a été testé à l’aide de divers paramètres des conditions IOP et ICP. Pour assurer la viabilité du tissu, le milieu dans le tissu a été remplacé toutes les 48 heures.

Des augmentations minimes de pression se sont produites au moment de l’échange de milieu et n’ont pas affecté la viabilité ou la morphologie de la tête du nerf optique, comme observé par l’analyse immunohistochimique et l’expression du collagène IV aux jours 14 et 30 de l’expérience. L’augmentation ou la diminution de l’ICP sur différents points temporels permet de maintenir une plage de gradient de pression translaminaire élevé pendant sept jours. Après sept jours de gradient de pression translaminaire élevé, des ventouses et un épaississement ont été observés dans les segments postérieurs, et l’expression du collagène IV montre des faisceaux épaissis avec une expression accrue du signal au cours de la période expérimentale.

L’imagerie de phase révèle des cellules ganglionnaires rétiniennes saines dans la couche de cellules ganglionnaires sans ventouses dans les segments de contrôle, tandis que les images provenant de cultures à gradient de pression translaminaire élevé présentent des ventouses étendues sans cellules ganglionnaires rétiniennes restantes dans la couche de fibres nerveuses rétiniennes, et un remodelage accru de la matrice extracellulaire. Cette technique permettra aux chercheurs d’étudier efficacement les paradigmes de maladies biomécaniques et de découvrir la pathogenèse moléculaire ciblant la pression translaminaire dans l’œil humain.