Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Notre protocole permet l’identification et l’analyse détaillées des monocytes et macrophages et des lymphocytes T et de leurs sous-ensembles pertinents dans les neurones et l’ovium et divers autres tissus du système immunitaire. Notre technique facilite la récolte fiable des cellules immunitaires de la vie à partir du synovium et d’autres tissus pertinents pour une caractérisation complète de la réponse immunitaire arthrose. Pour l’isolement des tissus d’intérêt d’une souris modèle d’arthrose, avec la souris dans une position supine, essuyer la poitrine, l’abdomen et les jambes avec 70% d’éthanol.

Utilisez des ciseaux pour ouvrir soigneusement la peau le long de la ligne médiane de l’abdomen tout en laissant la cavité abdominale intacte. Et tirez doucement la peau sur le côté droit de l’animal loin du muscle sous-jacent, laissant le tissu adipeux sous-cutané attaché à la peau. Placez la souris sous un microscope disséquant et utilisez deux forceps fins incurvés pour taquiner doucement le tissu adipeux situé à la cuisse.

Après avoir identifié les trois vaisseaux croisés, utilisez de fines forceps disséquants pour enlever le ganglion lymphatique inguinal situé à l’intersection des vaisseaux, en prenant soin de ne pas rompre la capsule. Utilisez les forceps pour enlever le reste de la graisse de la surface du ganglion lymphatique et ouvrir la cavité abdominale. Si aucune graisse restante ne peut être vue, placez immédiatement le ganglion lymphatique dans une plaque de six puits préalablement préparée et étiquetée remplie de 0,5 millilitres de média RPMI.

Par la suite, ouvrez la cavité abdominale. Utilisez des ciseaux fins pour exciser la rate et extraire doucement les intestins pour exposer l’aorte et sa bifurcation. Par la suite, placez la rate immédiatement dans un six précédemment préparé et étiqueté rempli de 0,5 millilitres de médias RPMI.

Enlever le ganglion lymphatique iliaque situé au segment terminal de l’aorte abdominale et l’origine de l’artère iliaque commune et retirer soigneusement la peau des deux membres postérieurs. Placez immédiatement le ganglion lymphatique dans une construction de six plaques de puits préparées et étiquetées précédemment avec 0,5 millilitres de média RPMI mettant en commun tous les ganglions lymphatiques de deux animaux. À l’aide de ciseaux fins ou d’un scalpel nettoyer le fémur gauche du tissu musculaire attaché et soigneusement déconnecté à la fois l’étouffement et l’articulation de la hanche, laissant l’os entier intact tout en enlevant le fémur.

Puis placé le fémur dans une plaque de six puits préalablement préparé et étiqueté rempli de 0,5 millilitres de médias RPMI. Identifier le tendon rotulien de l’articulation droite étouffer et utiliser des ciseaux fins pour enlever le tissu musculaire adjacent proximal à l’articulation jusqu’à environ cinq millilitres de tendon quadriceps proximal à la rotule sont exposés. Couper à travers le tendon quadriceps environ trois à quatre millimètres proximal à la rotule pour former une poignée et utiliser des forceps fins pour tirer doucement la tension loin de l’articulation pour exposer les bords de la fixation de la capsule articulaire.

En commençant par le fémur et en se déplaçant vers le tibia, utilisez un scalpel pour couper soigneusement le long des bords de la capsule articulaire des deux côtés tout en maintenant une traction douce sur le tendon du quadriceps. Lorsque le bloc de tissu synovial n’est fixé qu’au tibia, la garniture de graisse intraarticulaire doit être clairement visible distal à la rotule et peut être doucement détachée de l’aspect articulaire et antérieur du Minsky. Ensuite, coupez le long de la partie restante de la capsule articulaire pour enlever le bloc de tissu synovial et placez-le immédiatement dans une plaque de six puits préalablement préparée et étiquetée remplie de 1,5 millilitres de rpmi media.

Lorsque tous les tissus ont été recueillis, placez deux rates en commun par condition sur une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 15 millilitres et utilisez un piston stérile de seringue de trois millilitres pour évaluer doucement les tissus à travers le filtre à mailles rinçant fréquemment la passoire avec un total de six millilitres de RPMI 1640 moyen complété par 10% FBS. Sédimenter les cellules par centrifugation, et re-suspendre la pastille en cinq millilitres de puffer de lyse globule rouge. Après cinq minutes, arrêter la réaction avec 10 millilitres de PBS et centrifuger les cellules.

Lorsqu’on n’observe plus de globules rouges, suspendez la pastille en un millilitre de PBS frais pour le comptage. Pour le traitement des ganglions lymphatiques placer les quatre ganglions lymphatiques sur une passoire à cellules de 70 micromètres dans un nouveau tube de 15 millilitres et utiliser un nouveau piston stérile de trois millilitres pour taquiner doucement les ganglions lymphatiques à travers le maillage dans une suspension à cellule unique, puis centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes, jeter le supernatant et re-suspendre la pastille dans 500 microlitres de PBS pour le comptage. Pour isoler la moelle osseuse, utilisez un pouce en tissu forceps pour saisir soigneusement le fémur intact et utiliser des ciseaux pointus pour couper l’extrémité même du fémur proximal.

Insérez une aiguille de calibre 23 au milieu de l’encoche intercondylle du fémur et faites pivoter l’aiguille tout en appliquant une pression douce pour percer un trou dans l’encoche. En changeant l’aiguille au besoin, rincer le contenu osseux avec six millilitres de RPMI complété par 10% FBS sur une passoire à cellules de 70 micromètres sur un nouveau tube de 15 millilitres et utiliser un nouveau piston à seringues de trois millilitres pour appuyer doucement sur la moelle osseuse à travers le maillage. Par la suite, effectuez l’étape RBC comme démontré pour la rate.

Lorsqu’on n’observe plus de globules rouges, suspendez la pastille en un millilitre de PBS frais pour le comptage. Pour le traitement du tissu synovial utiliser de fines ciseaux chirurgicaux pour couper les deux blocs de tissu synovial en petits morceaux et transférer les échantillons dans un nouveau tube de 15 millilitres. Rincer le récipient de collecte avec 500 microlitres de milieu pour recueillir les cellules restantes et les tissus synoviaux et tirer le lavage dans le tube de collecte de l’échantillon.

Ensuite, ajoutez un volume suffisant d’enzymes à atteindre dans une unité par concentration finale millilitre et digérer l’échantillon de tissu synovial à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant deux heures d’un rotateur. Assurer un mouvement suffisant lorsque vous placez les tubes dans le rotateur. À la fin de l’incubation, arrêter la digestion avec huit millilitres de RPMI complété par 10%FBS et filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Rincez l’ancien tube de 15 millilitres avec cinq millilitres de milieu et utilisez-le pour laver le filtre. Ensuite, sédimenter les cellules par centrifugation et réutiliser la pastille dans 500 microlitres de PBS pour le comptage. Pour effectuer la coloration de viabilité des cellules immunitaires isolées, ajouter cinq fois 10 aux cinq cellules de chaque suspension cellulaire aux puits appropriés de deux différentes plaques de 96 puits U-fond et de recueillir les cellules au fond de chaque puits.

Incluez toujours suffisamment de cellules non tachées de chaque type de tissu comme témoins négatifs. Laver les cellules avec 200 microlitres de PBS et re-suspendre les granulés dans 100 microlitres de cellules dans le colorant réactif à l’amine perméante par puits pendant une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius protégés de la lumière. À la fin de l’incubation laver les cellules deux fois dans 200 microlitres de tampon FACS par lavage et re-suspendre chaque granulé dans 100 microlitres de l’anticorps approprié d’intérêt ou de contrôle cocktail.

Si la coloration intra et extracellulaire est effectuée dans le même effectuer l’étape de coloration extracellulaire maintenant. Après 30 minutes d’incubation à quatre degrés Celsius protégés de la lumière laver les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon FACS par puits et de suspendre à nouveau les cellules et la plaque de panneau sous-ensemble monocyte dans 250 microlitres de tampon FACS complété par un millimolaire EDTA. Effectuez cette étape seulement si aucune coloration intracellulaire n’est prévue, passez autrement à l’aspect de coloration intracellulaire du protocole.

Ensuite, transférez chaque échantillon de sous-ensemble de monocytes dans le tube FACS correspondant approprié sur la glace protégée de la lumière. Pour la coloration intercellulaire des cellules du panneau de sous-ensemble des cellules T, suspendez à nouveau les granulés dans 200 microlitres de tampon de fixation à partir d’une trousse appropriée de fixation et de perméabilisation pour une incubation de 40 minutes à quatre degrés Celsius protégée de la lumière. À la fin de l’incubation laver les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation et de suspendre à nouveau les granulés dans 100 microlitres de l’anticorps approprié d’intérêt ou cocktail de contrôle pour une incubation de 40 minutes à quatre degrés Celsius protégé de la lumière.

Ensuite, lavez les cellules deux fois en 200 microlitres de tampon de lavage de permeabilisation par lavage. Et re-suspendre les cellules dans 250 microlitres de FACS plus tampon EDTA avant de transférer les échantillons dans les tubes FACS correspondants appropriés sur la glace protégée de la lumière. Ici, la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau de sous-ensemble de monocyte sur des cellules immunisées rassemblées à partir de la moelle des animaux traités de DMM peut être observée.

Les trolls non tachés peuvent être utilisés pour déterminer les vrais négatifs pour la tache vivante morte et les portes peuvent être ajustées chaque fois que l’expérience est menée au besoin. Dans cette analyse représentative, les cellules immunitaires ont été isolées des tissus synovial et tachées avec des marqueurs extracellulaires de surface, six semaines après la chirurgie de contrôle de DMM ou de feinte. Un pourcentage plus élevé de macrophages MHC2 positifs Ly-SC et M2 sont observés chez les animaux traités par DMM par rapport aux populations cellulaires observées chez les souris de chirurgie simulée.

Ici, la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau extra et intracellulaire de T-cellule sur des cellules immunisées isolées de la rate des animaux traités de DMM peut être observée. Un pourcentage plus élevé de cellules TH1 sont observées dans les ganglions lymphatiques et les tissus synoviaux des animaux atteints de DMM, ainsi qu’un plus grand nombre de lymphocytes T et de cellules TH17. Pour assurer l’acquisition d’échantillons de haute qualité, les tissus doivent être récoltés d’une manière rapide, méticuleuse et cohérente.

Une fois que les cellules immunitaires ont été isolées, d’autres analyses en aval peuvent être menées telles que le RTPCR, la culture cellulaire et se reposer sur le sang pour éclairer les processus moléculaires d’intérêt.