Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette
21 mai 2020
Un goulot d’étranglement dans le cycle de «conception-construction-test» de l’ingénierie microbienne est la vitesse à laquelle nous pouvons effectuer des écrans fonctionnels de souches. Nous décrivons une méthode à haut débit pour le criblage des souches appliquée à des centaines à des milliers de cellules de levure par expérience qui utilise le séquençage à base d’ARN à base de gouttelettes.
ICO, ou ICO-seq est la première adaptation du séquençage de l’ARN à haut débit aux microbes. Cette méthode a évalué la fonction microbienne à l’échelle du génome. Pour les microbes d’ingénierie, cette méthode peut élucider comment les changements au génome microbien peuvent perturbant ses fonctions.
Obtenir de la levure à partir d’une culture de suspension, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Suspendre à nouveau les cellules de PBS à une concentration d’environ 750 000 cellules par millilitre. Ensuite, mélanger le point de fusion ultra-bas agarose en PBS, et chauffer le mélange à 90 degrés Celsius, jusqu’à ce que l’agarose fonde.
Charger le mélange d’agarose dans une seringue, avec un filtre attaché de 0,22 micron. Placez une pompe à seringues devant un chauffe-espace réglé à 80 degrés Celsius et placez la seringue dans la pompe. Remplir une deuxième seringue avec la suspension de levure, et remplir une troisième seringue avec de l’huile fluorée, avec 2% de fluorosurfactant ionique.
Chargez les deux seringues dans les pompes à seringues. Connectez le tube des seringues à l’appareil A.Placez un tube conique de 15 millilitres dans un seau à glace et guidez le tube de sortie dans le tube conique. Réglez le débit de chaque seringue et recueillez environ un millilitre d’émulsion dans le tube conique de 15 millilitres.
Après avoir attendu cinq minutes que l’agarose dans le tube se fixe, ajouter un volume égal de 20% perfluoro-octanol dans l’huile fluorée à l’émulsion. Mélanger l’émulsion et le perfluoro-octanol en inversant le tube conique à quelques reprises. Centrifugeuse l’émulsion cassée à 2000 fois G pendant deux minutes.
Assurez-vous que les hydrogels ont granulé au-dessus des phases d’huile et de PFO. Retirer les phases d’huile et de PFO. Ajouter deux millilitres de tampon tet(W) pour suspendre à nouveau les hydrogels.
Transférer la suspension dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube à nouveau à 2000 fois G pendant deux minutes. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les hydrogels dans le tet(W).
Après avoir fait tourner les hydrogels à 2000 fois G pendant deux minutes, suspendez les hydrogels en deux millilitres de milieu de culture de levure. Incuber le tube pendant la nuit à 30 degrés Celsius, avec des secousses. Chaque souche pousse à des rythmes différents.
Le choix d’un média approprié et le temps d’incubation est essentiel pour s’assurer que la levure se développent dans l’hydrogel, mais ne pas dépasser, conduisant à des cellules s’échappant dans les médias. Tout d’abord, transférer les hydrogels dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 2000 fois G pendant deux minutes.
Laver les hydrogels deux fois avec PBS, puis une fois dans le tampon sphéroplasting. Effectuer une dilution 40x de l’enzyme sphéroplasting dans le tampon sphéroplasting. Ensuite, ajouter un millilitre de l’enzyme diluée aux hydrogels.
Incuber le tube d’hydrogels à 37 degrés Celsius pendant une heure. La levure traitée aura l’air plus transparente. Du tube contenant la suspension hydrogel, retirez 0,8 millilitres de la suspension du fond du tube et transférez-la à une seringue non plafonnée d’un millilitre.
Placez la seringue dans le porte-seringue imprimé en 3D. Centrifugeuse de la seringue et du support à 2000 fois G pendant deux minutes. Avant de procéder, assurez-vous que les hydrogels sont bien emballés au fond de la seringue.
Placer 240 000 perles de goutte-seq dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 1000 fois G pendant une minute. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les perles en deux millilitres de tampon de lyse de levure de 0,9 x, avec du chlorure de sodium de 500 millimlaires.
Insérez une barre de remue-remuer et transférez la suspension de la perle sur une seringue de trois millilitres. Préparer une autre seringue contenant plusieurs millilitres de surfactant PFPE-PEG dans de l’huile fluorée. Obtenez la seringue précédemment préparée des hydrogels emballés de clone de levure.
Évacuez la tête d’acquiescement et capuchonez la seringue. Insérez les trois seringues, les hydrogels, la suspension de perle et l’huile dans les pompes à seringues. Connectez les seringues par tube à l’appareil B, le dispositif d’encapsulation.
Placer l’extrémité du tube de sortie dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Réglez le débit de chaque seringue. Recueillir environ 1000 millilitres d’émulsion, ou faire fonctionner l’appareil jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’hydrogels.
Suivez ensuite le protocole drop-seq pour la synthèse cDNA, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. À l’aide d’un dispositif microfluidique, les cellules de levure ont été encapsulées dans des gouttelettes de 160 micromètres. Un séparateur de huit fois a divisé ces gouttelettes en huit gouttelettes de 60 micromètres.
L’incubation pendant la nuit a entraîné la croissance de colonies de levure isogéniques dans certains hydrogels. Avant de charger les hydrogels de levure dans le deuxième dispositif microfluidique, ils ont été lavés et immergés dans une solution pour digérer les parois cellulaires. La digestion appropriée a été vérifiée par microscopie, avec les cellules traitées de levure ayant une morphologie plus réfléchissante.
Un flux de perles de capture de l’ARNm dans le tampon de lyse a été mélangé avec un flux d’hydrogels de levure à emballage rapproché avant la jonction de drop-making du deuxième dispositif microfluidique. Dans l’émulsion qui en a résulté, environ 10 % des gouttelettes recueillies contenaient une perle avec une colonie lysée. Ce flux de travail isogénique de séquençage de colonie a été employé pour analyser la réponse opaque blanche de commutation de C.albicans.
Le composant principal, le PC, l’analyse et une réduction de la dimensionnalité tSNE ont indiqué une concordance générale entre l’ensemble de données de l’échantillon et un ensemble de données de référence. L’analyse de TSNE a indiqué trois faisceaux de cellules. Alors que le deuxième groupe était principalement composé de cellules de l’ensemble de données de l’échantillon, les grappes zéro et une étaient composées de cellules provenant des deux échantillons.
La superposition de l’expression WH11 sur le tSNE indiquait que le groupe un contenait probablement des colonies blanches. L’expression STF2 a augmenté dans le premier groupe, ce qui correspond aux données précédemment obtenues. Dans les grappes zéro et deux, WH11 et STF2 ont été considérablement moins réglementés que le premier groupe.
Les microbes androgènes ont un potentiel sans cesse croissant pour produire en masse des produits biologiques pour le traitement d’une grande variété de maladies. Après cette procédure, on peut appliquer une variété d’outils bioinformatiques pour analyser plus en détail les données de séquençage.
Aperçu
Cette étude présente une méthode à haut débit pour le criblage de souches en ingénierie microbienne, utilisant spécifiquement le séquençage de l'ARN basé sur des gouttelettes pour analyser les cellules de levure. La méthode permet des évaluations fonctionnelles de micro-organismes modifiés à l'échelle du génome entier.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Ingénierie microbienne
- Screening à haut débit
- Séquençage ARN
Contexte général
- Le criblage fonctionnel des souches microbiennes est souvent lent et peu efficace.
- Les méthodes à haut débit peuvent considérablement accélérer ces évaluations.
- Le séquençage de l'ARN basé sur des gouttelettes offre une approche novatrice pour évaluer les fonctions microbiennes.
- La compréhension des perturbations du génome peut orienter les stratégies d'ingénierie microbienne.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de criblage rapide des souches de levures utilisant le séquençage de l'ARN.
- Élucider les impacts fonctionnels des modifications génomiques chez les micro-organismes conçus.
- Améliorer l'efficacité du cycle conception-réalisation-test en ingénierie microbienne.
Méthodes utilisées
- Les cellules de levure ont été cultivées et préparées à une concentration spécifique.
- La microfluidique à base de gouttelettes a été utilisée pour encapsuler les cellules de levure.
- Un séquençage ARN a été effectué sur les cellules encapsulées afin d'évaluer l'expression génique.
- Des outils bioinformatiques ont été appliqués pour analyser les données de séquençage.
Résultats principaux
- La méthode a permis d'encapsuler avec succès des cellules de levure dans des gouttelettes pour une analyse à haut débit.
- Des colonies isogéniques ont été générées et analysées pour leurs profils d'expression génique.
- L'analyse en composantes principales a révélé des groupes distincts d'expression génique.
- Les résultats ont indiqué des différences significatives d'expression génique liées à la morphologie des colonies.
Conclusions
- Cette méthode à haut débit améliore la capacité de cribler efficacement des souches microbiennes.
- Les connaissances acquises peuvent guider l'ingénierie future de micro-organismes pour des applications biotechnologiques.
- L'approche est applicable à diverses espèces microbiennes autres que la levure.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le criblage à haut débit des souches reste un goulot d'étranglement en ingénierie microbienne malgré les progrès réalisés en matière d'édition du génome. Cette méthode de séquençage de l'ARN basée sur des gouttelettes permet une évaluation fonctionnelle à l'échelle du génome des souches de levure modifiées, répondant directement au compromis entre le rendement d'information et le débit. En permettant une inférence phénotypique à partir de profils transcriptomiques, elle renforce la confiance prédictive dans le choix des souches et accélère le cycle conception-construction-test pour la production de produits biologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en associant des modifications génomiques à des phénotypes fonctionnels via des lectures à l'échelle du transcriptome.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection des risques biologiques grâce à un profilage quantitatif de l'expression génique qui précise les impacts au niveau des voies métaboliques des éditions génétiques.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en identifiant les souches présentant des signatures d'expression souhaitées liées aux voies cibles, réduisant ainsi la dépendance aux tests à faible débit.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des colonies de levures isogéniques standardisées, encapsulées dans des gouttelettes, adaptées à un criblage phénotypique reproductible basé sur la séquençage de l’ARN (RNA-seq).
- Évolutivité : Permet de traiter des milliers de souches génétiquement distinctes en parallèle, dépassant ainsi les limites des méthodes traditionnelles de sélection de colonies et des approches basées sur des réseaux.
- Qualité des données : Fournit des mesures quantitatives et multiplexées de l’expression génique, permettant des comparaisons fiables entre différentes bibliothèques de souches.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Appliqué au basculement blanc-opaque de Candida albicans, un phénotype lié à la virulence, démontrant son utilité dans la caractérisation de souches pathogènes.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les modifications génétiques et les conséquences phénotypiques au moyen de biomarqueurs d'expression (par exemple, WH11, STF2), soutenant ainsi la sélection de souches alignée sur les biomarqueurs.
- Réduction précoce des risques précliniques : Permet l'identification précoce de souches non fonctionnelles ou anormales, réduisant ainsi le risque d'échec lors des étapes ultérieures du développement.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail d'ingénierie des souches microbiennes, de la construction de la bibliothèque à la validation fonctionnelle, permettant une priorisation des souches dirigée par le transcriptome avant l'identification du candidat principal.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en révélant comment les perturbations génomiques affectent l'expression génique globale dans des lignées isogéniques.
- Écrans : Fournit des systèmes microbiens standardisés, prêts à l'emploi, avec des profils transcriptionnels reproductibles pour tester la réponse à des composés ou à des conditions expérimentales.
- Analytique : Propose des regroupements d'expression dérivés de l'ACP (analyse en composantes principales) et du t-SNE, ainsi que des superpositions de gènes marqueurs permettant la classification phénotypique et la comparaison de souches.
- Recherche translationnelle : Relie les génotypes des souches aux états phénotypiques à l'aide de marqueurs conservés, assurant une continuité entre la découverte et la validation préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'analyse de bibliothèques de souches de levure et d'autres micro-organismes dans divers projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les relations souche-fonction en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à des données d'expression à l'échelle du génome.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité et la standardisation par l'encapsulation microfluidique et la croissance contrôlée de colonies dans des hydrogels.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité des décisions d'avancement ou d'abandon et l'allocation du capital en permettant une évaluation rapide des souches selon plusieurs paramètres.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en identifiant précocement les souches dont les profils moléculaires indiquent des phénotypes souhaités.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microfluidique, en génétique des levures et en préparation de bibliothèques pour le séquençage ARN unicellulaire.
- Dépend de l'accès à des dispositifs de génération de gouttelettes, à des huiles fluorées, à des agents tensioactifs, ainsi qu'à une infrastructure en aval pour le séquençage et la bioinformatique.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des hydrogels, de sphéroplastification et de couplage aux billes afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique l'optimisation du temps d'incubation et du milieu afin d'éviter une surcroissance de l'hydrogel et l'échappement cellulaire, phénomènes dépendants de la souche.
- Est limité par la nécessité de biomarqueurs transcriptionnels associés à des phénotypes connus, afin de permettre une inférence phénotypique précise à partir des données de séquençage ARN.
