Name: Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez la méthode Acyl-RAC pour détecter la S-acylation protéique dans divers échantillons biologiques. Cette technique sensible permet l'analyse simultanée de multiples protéines avec une fiabilité optimale.

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Ces travaux ont été soutenus par les subventions des National Institutes of Health 5R01GM115446 et 1R01GM130840.

Les souris utilisées dans ce protocole ont été euthanasiées selon les lignes directrices des NIH. Le Comité du bien-être des animaux de l’Université du Texas Health Science Center à Houston a approuvé tous les travaux sur les animaux.
1. Préparation des lysates cellulaires
<ol><li>Préparer le tampon de lyse tel que décrit dans le tableau 1. À 10 ml de PBS, ajouter 0,1 g de détergent n-dodecyl -D-maltoside (DDM) et tourner pour se dissoudre. Ajouter 100 l de cocktail inhibiteur de phosphatase 2, ML211 (10 M), PMSF (10 mM) et cocktail inhibiteur de protéase (1x) et réfrigérer le tampon sur la glace avant utilisation.</li>
	<li>Transférer les supports nécessaires contenant des cellules de l’incubateur en tubes coniques de 15 ml ou 50 ml et cellules de rotation à 350 x g pendant 5 min et aspirer pour se débarrasser de tout débris cellulaire. REMARQUE : Nous avons utilisé 1 x 107 cellules pour chaque réaction d’acyl-RAC à effectuer.</li>
	<li>Laver la boulette en la ressumant en 5 ml de PBS et en tournant à 350 x g pendant 5 min. REMARQUE : Effectuez rapidement l’étape 1.3 pour éviter la lyse cellulaire due à une incubation prolongée dans PBS.</li>
	<li>Ajouter 600 L de tampon de lyse préparé à l’étape 1.1 à la granule et le lyse en secouant à 1500 tr/min dans un shaker thermique pendant 30 min à 4 oC.</li>
	<li>Effacer les lysates par centrifugation à 20 000 x g à 4 oC pendant 30 min pour les matériaux insolubles de détergent à granulés. Recueillir le lysate déblayé dans des tubes de microfuge de 1,5 mL pré refroidis et les garder sur la glace.</li>
	<li>Effectuez un essai Bradford/BCA pour estimer la concentration de protéines. Il est essentiel d’assurer la même quantité de protéines entre différents échantillons avant d’effectuer l’expérience. Nous vous recommandons d’utiliser au moins 500 g de protéines par réaction. REMARQUE : Dans les expériences décrites, nous avons employé des cellules cultivées (Jurkat) et des spénocytes primaires du tissu de souris. La méthode de lyse décrite ci-dessus peut être adoptée à d’autres types de cellules ainsi. La concentration moyenne de protéines obtenue pour les types de cellules susmentionnées est d’environ 500 g par 1 x 107 cellules. Les cellules de jurkat ont été maintenues dans le RPMI-1640 moyen modifié pour contenir 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate de sodium, 4.500 mg/L de glucose, et 1.500 mg/L bicarbonate de sodium complété avec 10% FBS à 37 oC avec 5% de CO2. Nous avons utilisé 1 x 107 cellules Jurkat par réaction. Les ratenocytes primaires ont été isolés du tissu de rate de souris tel que décrit26. En bref, le tissu de rate a été macéré sur la glace, suivi par la lyse des érythrocytes dans la solution hypotonique et la séparation des lymphocytes par centrifugation. Nous avons utilisé 1 x 107 cellules primaires par réaction.</li>
</ol>2. Acyl-RAC: Blocage des groupes de thiol libre
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes peuvent être effectuées à température ambiante (RT).
<ol><li>Transférer le lysate dans un tube de microfuge frais de 1,5 mL et effectuer des précipitations de chloroforme-méthanol (CM) comme décrit ci-dessous.<ol>
<li>Ajouter le méthanol (MeOH) et le chloroforme (CHCl3) au lysate à un rapport final de lysate: MeOH: CHCl3 de 2:2:1 et secouer vigoureusement pour créer une suspension homogène.</li>
		<li>Tourner à 10 000 x g pendant 5 minutes pour former une boulette (« crêpe ») à l’interphase entre les phases aqueuses et organiques.</li>
		<li>Incliner le tube et aspirer autant de solvant que possible à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe de chargement de gel.</li>
		<li>Aérez le granule de protéines pendant quelques minutes et lavez-le doucement en ajoutant 600 l’un de MeOH et en mélangeant doucement pour éviter de briser la pastille</li>
		<li>Retirez soigneusement le reste du MeOH et séchez la boulette de protéines sur un banc pendant environ 5 minutes.</li>
		<li>(Facultatif) Effectuez une étape de centrifugation supplémentaire pour faire tourner n’importe quelle granule cassée après le lavage MeOH pour éviter la perte d’échantillon. REMARQUE : L’expérience peut être arrêtée après l’étape de précipitations CM. Une fois la boulette obtenue, elle peut être stockée dans 500 L de MeOH en -20 oC jusqu’à une semaine.<ol>
<li>Dissoudre la boulette de protéines en 200 L de tampon de 2SHB en vortexing à 42 oC/1500 tr/min dans un shaker thermique jusqu’à ce que la pastille soit dissoute.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Facultatif) Incuber pendant 5 à 10 minutes supplémentaires dans un bain d’eau sonore pour dissoudre la boulette. REMARQUE : La durée de la sonication varie en fonction de la solubilité du matériau. Cependant, une sonication prolongée peut causer une dégradation des protéines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 0,2 % de méthane méthylethiosulfonate (MMTS) (v/v) en 2SHB en ajoutant 2 L de MMTS à 998 L de tampon de 2SHB. REMARQUE : Utilisez des MMTS fraîchement préparés de 0,2 % pour chaque expérience.</li>
	<li>Ajouter 200 L de MMTS de 0,2 % dans 2SHB à chaque tube à une concentration finale de 0,1 % de MMTS. Incuber pendant 15 min à 42 oC avec secousses à 1500 tr/min dans un shaker thermique.</li>
</ol>3. Acyl-RAC : clivage hydroxylamine (HAM) et capture de protéines S-acylés
<ol><li>Répétez les précipitations cm 3-4x comme décrit ci-dessus pour enlever MMTS. L’élimination du MMTS peut être estimée par le manque d’odeur distincte de MMTS. Après chaque précipitation, dissoudre la granule dans 100 L de tampon de 2SHB en vortexing à 42 oC/1500 tr/min dans un shaker thermique jusqu’à ce que la pastille se dissout, puis diluer avec 300 lil de tampon A.</li>
	<li>Après les précipitations finales, dissoudre les échantillons dans 200 L de tampon de 2SHB tel que décrit ci-dessus et diluer avec 240 lil de tampon A.</li>
	<li>En cas de comparaison des changements dans la S-acylation en réponse à plusieurs conditions de traitement, mesurer la concentration de protéines à nouveau et procéder avec une quantité égale de protéines pour chaque condition.</li>
	<li>Conserver 40 ll de chaque échantillon comme contrôle des intrants.</li>
	<li>Diviser les échantillons en deux parties égales de 200 L et marquer les tubes comme « HAM » et « HAM ». Ajoutez 50 L de HAM neutre fraîchement préparé de 2 M HAM (pH 7,0-7,5) à une concentration finale de 400 mM à l’un des tubes (HAM) et de 50 l de neutre 2 M NaCl au deuxième tube (- HAM), qui sera utilisé comme un contrôle négatif. Procéder à l’ajout de perles thiopropyl-Sepharose (TS). REMARQUE : L’expérience peut être arrêtée après l’une des étapes de précipitations DE CM. Une fois la boulette obtenue, elle peut être stockée dans 500 L de MeOH en -20 oC jusqu’à une semaine. Le pH neutre de 2 M HAM assure sa sélectivité pour le lien thioester acyl-cystéine et doit être soigneusement ajusté. Il faut faire attention lors de la manipulation d’échantillons dans un tampon de 2SHB afin d’éviter la perte d’échantillon en raison d’une mousse excessive. Toutes les étapes suivantes sont identiques pour - échantillons HAM et HAM.</li>
	<li>Ajouter 30 L de perle-lis à chaque tube et faire pivoter les tubes pendant 1-2 h à RT.</li>
	<li>Laver les perles TS 4x avec 1% SDS dans tampon A pour enlever HAM résiduel.<ol>
<li>Faire tourner doucement tous les échantillons de perles à l’aide d’une microfuge pendant 1 min et aspirer soigneusement le supernatant.</li>
		<li>Resuspendez les perles en 500 L de 1% SDS dans le tampon A.</li>
		<li>Étape répétitive 3.7.1-3.7.2 trois fois. REMARQUE : Le thiopropyl-Sepharose activé (TS) est fourni lyophilisé en présence d’additifs qui doivent être emportés au pH neutre avant le couplage. L’eau distillée est recommandée pour l’enflure et le lavage. Pesez 0,1 g de perles et de résuspendance dans 1 ml d’eau distillée et laissez-la gonfler tout en tournant pendant 30 min-1 h à RT. Laver les perles 1x avec tampon A et préparer une boue avec tampon A, dans un rapport de 50% réglé moyen à 50% tampon. Le TS gonflé peut être stocké au pH neutre en présence de 20 % d’éthanol à 4 oC jusqu’à une semaine. N’utilisez pas l’azide de sodium comme agent bactériostatique puisque les ions d’azide réagissent avec les groupes de disulfide de 2-pyridyl. Pour une plus grande efficacité, préparez des perles fraîches. Pendant la manipulation des perles, la pointe d’une pointe de pipette P200 peut être coupée légèrement afin d’éviter tout dommage. REMARQUE : L’expérience peut être arrêtée à n’importe quel stade après les précipitations de CM. Le granulé peut être entreposé dans 500 L de MeOH en -20 oC jusqu’à une semaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elution et détection des protéines S-acylés
<ol><li>Après le dernier lavage, tournez doucement vers le bas les perles comme décrit ci-dessus et aspirent autant de supernatant que possible sans déranger les perles.</li>
	<li>Récupérez les protéines des perles avec un tampon d’échantillon SDS 4x avec de la TNT.<ol>
<li>Ajouter 50 L de tampon d’échantillon SDS de 4x aux perles et incuber à 80 oC, 1500 tr/min pendant 15 min dans un shaker thermique. Laissez les tubes refroidir.</li>
		<li>Centrifuge les perles à 5.000 x g pendant 3 minutes pour pelleter complètement les perles et transférer les protéines elfées à un tube frais de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de chargement de gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez SDS-PAGE et analysez la S-acylation de la protéine (s) d’intérêt par le ballonnement occidental.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
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<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
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<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
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<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Ici, nous avons utilisé avec succès l’essai acyl-RAC pour détecter l’acylation S de certaines protéines dans les cellules humaines cultivées et les cellules primaires dérivées du tissu de souris. Cette méthode est simple, sensible, et peut être facilement effectuée avec des exigences minimales d’équipement en utilisant des techniques de biochimie standard. Il a été démontré que cette méthode identifie avec succès de nouvelles protéines S-acylated telles que le sous-unité du système de translocation des protéines (Sec61b)...

S-acylation est une modification post-translationnelle réversible impliquant l’ajout d’une chaîne d’acyl gras à un résidu interne de cystéine sur une protéine cible via un lien de thioester labile1. Il a d’abord été rapporté comme une modification des protéines avec le palmitate, un acide gras saturé de 16-carbone2, et donc cette modification est souvent appelée S-palmitoylation. En plus du palmitate, les protéines peuvent être modifiées de façon réversible par une variété d’acides gras saturés plus longs et plus courts (myristate et stéarate), monoinsaturés (oleate) et polyinsaturés (arachidonate et eicosapentanoate)3,4,5,6,7. Dans les cellules eucaryotes, S-acylation est catalysée par une famille d’enzymes connues sous le nom d’acyltransferases de protéines DHHC et la réaction inverse de la déphalatation de la cystéine est catalysée par des thioesterases protéiques, dont la plupart restent énigmatiques8.
La labilité du lien thioester rend cette modification lipidique réversible, lui permettant de réguler dynamiquement le regroupement des protéines, la localisation de membrane plasmatique, le trafic intracellulaire, les interactions protéines-protéines et la stabilité protéique9,10. Par conséquent, la S-acylation a été liée à plusieurs troubles, y compris la maladie de Huntington, la maladie d’Alzheimer et plusieurs types de cancer (prostate, gastrique, vessie, poumon, colorectal), qui nécessite le développement de méthodes fiables pour détecter cette modification de protéine post-translationnelle11.
L’étiquetage métabolique avec le palmitate radioactif([3H], [14C] ou [125I]) a été l’une des premières approches développées pour assayer la protéine S-acylation12,13,14. Cependant, les méthodes radio-étiquetées présentent des problèmes de santé, ne sont pas très sensibles, prennent beaucoup de temps, et ne détectent la lipidation des protéines très abondantes15. Une alternative plus rapide et nonradioactive à la radiolabeling est l’étiquetage métabolique avec des sondes d’acides gras bioorthogonal, qui est utilisé régulièrement pour assayer la dynamique de la protéine S-acylation16. Dans cette méthode, un acide gras avec un journaliste chimique (alkyne ou groupe d’azide) est incorporé dans la protéine S-acylated par une ayltransferase de protéine. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (click chemistry) peut alors être utilisé pour attacher un groupe fonctionnalisé, comme un fluorophore ou une biotine, à l’acide gras intégré permettant la détection de la protéine S-acylé17,18,19.
L’échange d’acyl-biotine (ABE) est l’une des méthodes biochimiques largement utilisées pour la capture et l’identification des protéines sycylées qui contourne certaines des lacunes de l’étiquetage métabolique tels que l’inadapté pour les échantillons de tissus15. Cette méthode peut être appliquée pour l’analyse de l’acylation S dans une gamme variée d’échantillons biologiques, y compris les tissus et les échantillons de cellules congelées20,21. Cette méthode est basée sur le clivage sélectif du lien de thioester entre le groupe d’acyl et le résidu de cystéine par hydroxylamine neutre. Les groupes de thiol libérés sont ensuite capturés avec un dérivé de la biotine thiol-réactif. Les protéines biotinylated générées sont alors affinity-purified utilisant l’agarose de streptavidine et analysées par immunoblotting.
Une approche alternative appelée capture assistée acyl-résine (Acyl-RAC) a été plus tard introduite pour remplacer l’étape de biotinylation par la conjugaison directe des cystéines libres par une résine thiol-réactive22,23. Cette méthode a moins d’étapes par rapport à ABE et peut également être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans un large éventail d’échantillons1.
Acyl-RAC se compose de 4 étapes principales (figure 1), 1. Blocage des groupes de thiol libres; 2. Clivage sélectif du lien cystéine-acyl thioester avec l’hydroxylamine neutre (HAM) pour exposer les groupes de thiol de cystéine ; 3. Capturer les cystéines lipidées avec une résine thiol-réactive ; 4. Enrichissement sélectif des protéines S-acylated après l’elution avec la réduction du tampon.
Les protéines capturées peuvent ensuite être analysées par immunoblotting ou soumises à la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (SEP) pour évaluer le protéome S-acylé dans une gamme variée d’espèces et de tissus22,24,25. Les sites individuels d’acylation de S peuvent également être identifiés par la digestion de trypsine des protéines capturées et l’analyse des peptides résultants par LC-MS/MS22. Ici, nous démontrons comment l’acyl-RAC peut être employé pour la détection simultanée de S-acylation des protéines multiples dans une ligne cellulaire et un échantillon de tissu.

<table><tbody><tr><td>cOmplete Inhibiteur de protéase Cocktail comprimés</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotateur</td><td>de tube LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta ;-D-maltoside (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de la phosphatase 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasons Quantrex Sonicator</td><td>L &; L</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection de la protéine s-acylation à l’aide de capture assistée acyl-resin

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

La protéine S-acylation, également appelée S-palmitoylation, est une modification post-translationnelle réversible des résidus de cystéine avec des acides gras à longue chaîne par l’intermédiaire d’un lien de thioester labile. La s-acylation, qui apparaît comme un mécanisme de régulation répandu, peut moduler presque tous les aspects de l’activité biologique des protéines, de la formation complexe au trafic de protéines et à la stabilité des protéines. Les progrès récents dans la compréhension de la fonction biologique de la protéine S-acylation ont été réalisés en grande partie grâce au développement de nouveaux outils biochimiques permettant la détection robuste et sensible de la protéine S-acylation dans une variété d’échantillons biologiques. Ici, nous décrivons la capture assistée par la résine d’acyl (Acyl-RAC), une méthode récemment développée basée sur la capture sélective des protéines endogènes S-acylated par des perles de Sepharose thiol-réactives. Par rapport aux approches existantes, Acyl-RAC nécessite moins d’étapes et peut produire des résultats plus fiables lorsqu’il est couplé avec la spectrométrie de masse pour l’identification de nouvelles cibles D’acylation S. Une limitation majeure dans cette technique est le manque de capacité à discriminer entre les espèces d’acides gras attachés aux cystéines par le même lien de thioester.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons d’abord utilisé acyl-RAC pour détecter simultanément S-acylation de plusieurs protéines dans les cellules de Jurkat, une lignée immortalisée de lymphocytes T à l’origine dérivée du sang périphérique d’un patient de leucémie de cellule T27. Les protéines de cellules T réglementaires précédemment identifiées comme S-acylated9,28,29 ont été choisies pour démo...

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) est une méthode très sensible, fiable et facile à exécuter pour détecter la modification réversible des lipides des résidus de cystéine (S-acylation) dans une variété d’échantillons biologiques.

Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-résine assistée capture ou Acyl-RAC est une méthode sensible et fiable qui peut être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans une variété d’échantillons biologiques. Ce protocole contourne certaines des limitations de l’étiquetage métabolique et de l’étiquetage radio, et permet la détection simultanée de l’acylation S de protéines multiples. Non seulement les cellules vivantes, mais aussi les tissus primaires et les échantillons congelés.La s-acylation peut réguler une variété de processus cellulaires tels que le trafic de protéines, le ciblage de la membrane plasmatique, la transduction de signaux, le transport du fer et les interactions protéine-protéine. Il est important d’utiliser une solution d’hydroxylamine fraîchement préparée avec un pH soigneusement ajusté pour chaque expérience afin d’assurer un clivage efficace et spécifique de la liaison thioester. Avec une démonstration de cette méthode, il est essentiel pour des étapes comme le chloroforme, les précipitations de méthanol.La pastille en forme de crêpe obtenue au cours de cette étape doit être manipuler très soigneusement. Il peut s’agir d’une perte fragile et partielle de l’échantillon au cours de l’étape qui peut mener à une récupération inégale de l’échantillon. Savannah West, une étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure.Pour obtenir des lysates cellulaires, recueillir les cellules d’intérêt dans un tube de centrifugeuse conique. Et enlever tous les débris cellulaires par centrifugation. Laver la pastille en 5 millilitres de PBS.Et résuspendez immédiatement les cellules dans 600 microlitres de tampon de lyse fraîchement préparé. Agiter l’échantillon à 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Avant de déblayer les lysates, le détergent à granulés et les matières solubles par centrifugation.À la fin de la centrifugation, recueillir le lysate autorisé dans un tube de microcentrifugeuse pré-refroidi de 1,5 millilitre sur la glace. Et effectuer un essai d’acide bradford ou bicinchoninique pour estimer la concentration en protéines selon les protocoles standard. Ajouter le méthanol et le chloroforme pour lyser à un rapport de 2:1.Agiter rigoureusement pour créer une suspension homogène et centrifugeuse de l’échantillon pour recueillir une pastille protéique à l’interface entre les phases aqueuse et organique. Incliner le tube, utiliser une aiguille ou une pointe de chargement de gel pour aspirer autant de solvant que possible. Séchez à l’air la pastille protéinique pendant quelques minutes.Avant de mélanger doucement le contenu du tube avec 600 microlitres de méthanol, en prenant soin de ne pas casser la pastille. Après avoir soigneusement enlevé le lavage au méthanol, séchez la pastille protéique sur un dessus de banc pendant environ cinq minutes. Ensuite, réutilisez la pastille protéique dans 200 microlitres de tampon 2SHB.Et vortex à 42 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker. Lorsque la pastille est dissoute, ajouter 200 microlitres de 0,2 %MMTS en 2SHB à l’échantillon. Et incuber la protéine pendant 15 minutes à 42 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker.À la fin de l’incubation, effectuer 3:4 précipitations de chloroforme-méthanol comme démontré. Pour enlever le MMTS, dissoudre la pastille en 100 microlitres de tampon 2SHB frais avec vortex. Et diluer l’échantillon avec 300 microlitres de tampon A après chaque précipitation.Après les précipitations finales, dissoudre les échantillons dans 200 microlitres de tampon 2SHB et diluer avec 240 microlitres de tampon A.Mesurer la concentration de protéines à nouveau et mettre de côté un 40 microlitres de chaque échantillon que les contrôles d’entrée. Divisez les échantillons en deux volumes égaux de 200 microlitres. Et marquer les tubes comme plus l’hydroxylamine et moins l’hydroxylamine.Ajouter 50 microlitres d’hydroxylamine neutre fraîchement préparée à deux molaires à une concentration finale de 400 millimolaires au tube d’hydroxylamine plus. Et 50 microlitres de chlorure neutre de sodium deux molaires au contrôle négatif, un tube d’hydroxylamine moins. Ajouter ensuite 30 microlitres de boue de perles TS à chaque tube.Et faites pivoter les tubes pendant une à deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation laver les perles quatre fois avec 1%SDS dans le tampon A pour enlever toute hydroxylamine résiduelle. Après le dernier lavage, laver tous les échantillons de perles avec trois microcentrifugations douces d’une minute.Aspirer soigneusement les supernatants et resuspendre les perles dans 500 microlitres de 1%SDS dans le tampon A à chaque lavage. Après le dernier lavage, faites tourner doucement les perles comme démontré. Et aspirer autant de surnatant que possible sans déranger les perles.Pour récupérer les protéines des perles, ajouter 50 microlitres de tampon échantillon SDS de 4% à chaque tube et incuber les échantillons à 80 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute pendant 15 minutes dans un thermo-shaker. À la fin de l’incubation, laisser refroidir les échantillons avant de les centrifuger pour pelleter complètement les perles. Ensuite, utilisez une pointe de chargement de gel pour transférer les protéines élutées dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre.Et exécutez les échantillons sur un gel SDS-PAGE pour analyser l’acylation S des protéines d’intérêt par le ballonnement occidental. Tyrosine kinase Lck peut être détecté dans les lysates traités avec deux hydroxylamines molaire neutres. pour fendre le lien thioester entre les résidus de cystéine et la moiety d’acide gras.Le décapage et le reprobage avec des anticorps contre les protéines Fyn et LAT démontrent que l’essai assisté de capture d’acyl-résine peut être employé pour analyser s-acylation des protéines multiples en même temps. En outre, la s-acylation de Lck, Fyn, et LAT peut être facilement détectée dans les splenocytes primaires de souris. Indiquant que cette modification est conservée entre deux espèces.En plus de l’identification de nouvelles protéines acylated S, cette méthode peut également être utilisée pour évaluer les changements dans la protéine S-acylation dans différentes conditions biologiques. Le nombre de protéines s-acylated nouvellement identifiées a augmenté énormément après que le double-up ait signifié une technique rapide et fiable telle qu’Acyl-RAC. En plus de l’identification de nouvelles protéines acylated S, cette méthode peut également être utilisée pour évaluer les changements dans la protéine S-acylation dans différentes conditions biologiques.

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Composés de capture sont trifonctionnel petites molécules afin de réduire la complexité du protéome par fonctionnels réversibles petite molécule de protéine d'interaction suivie par la photo-réticulation et de purification. Ici, nous utilisons un composé de capture avec...

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Inductibles stables lignées cellulaires LAP marqués pour Enquêter la fonction des protéines, Spatiotemporal Localisation et Interaction Networks Protein

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L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

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Découvrez la méthode Acyl-RAC pour détecter la S-acylation protéique dans divers échantillons biologiques. Cette technique sensible permet l'analyse simultanée de multiples protéines avec une fiabilité optimale.

Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin

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