Name: Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Apprenez l'hybridation in situ pour détecter l'expression du gène dmrt1 dans le liquide cœlomique de Sipunculus nudus, une ressource halieutique importante. Cette méthode permet de visualiser les ARN messagers spécifiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par le Young Scientists Fund de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), la Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J011161), les Fonds de recherche scientifique de l’Université Huaqiao (15BS306) et le Fonds novateur de post-études en recherche scientifique de l’Université Huaqiao.

La procédure animale a été approuvée par le Comité de soins et de bien-être des animaux de l’Université huaqiao.
1. Préparation de Riboprobe
<ol><li>Conception d’apprêt<ol>
<li>Ouvrez le programme Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiez la séquence dmrt1 (GenBank : MK182259) dans la fenêtre de séquence.</li>
		<li>Définir la longueur de l’apprêt (23-25 bp), la température de fonte (55-60 oC) et le contenu G/C (40-60%). Cliquez sur Pick Primers. REMARQUE : La taille minimale requise pour la sonde ARN est d’environ 500 bp. Les sondes plus longues ont normalement une spécificité plus élevée.</li>
		<li>Ajoutez la séquence de promoteur de polymérase T7 RNA (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) à l’une des amorces sélectionnées. Les séquences d’amorce dmrt1 pour ISH sont indiquées dans le tableau 1. REMARQUE : Pour les sondes sens, le promoteur de polymérase à ARN T7 est situé à l’extrémité 5' des amorces avant. Pour les sondes antisense, le promoteur de polymérase T7 ARN est situé à l’extrémité 5'-extrémité des amorces inversées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplification PCR<ol>
<li>Placez les tubes de microfuge sur la glace et préparez le mélange de réaction suivant (pour une réaction de 50 L) : 1x mélange de polymérase à l’ADN Taq, 1 g d’ADN (qui est préparé à partir de 100 l de liquide coélomique), 1 m d’apprêt avant, 1 m d’apprêt inversé et eau sans nucléase.</li>
		<li>Mélanger brièvement la réaction PCR par tuyauterie et centrifugeuse.</li>
		<li>Placez le tube de réaction dans un cycle thermique, et exécutez le PCR en utilisant les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 oC pendant 2 min suivie de 36 cycles de dénurescence à 95 oC pour 30 s, annealing à 55-60 oC pour 30 s, extension à 72 oC pour 30 s et une extension finale à 72 oC pour 7 min. REMARQUE : La température d’annealing doit être optimisée selon les amorces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purification et vérification des produits PCR<ol>
<li>Chargez le mélange de 50 L de PCR directement sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 150-180 V pendant 10 min en 0.5x TBE. Isolez les fragments d’ADN spécifiques du gel d’agarose de 1 %. REMARQUE : L’ADN doit apparaître comme une seule bande et non comme un frottis.</li>
		<li>Purifier les fragments d’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon le protocole du fabricant. Quantifier les produits purifiés par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 260 nm.</li>
		<li>Vérifier l’authenticité des produits PCR par séquençage. REMARQUE : (Point de pause) Les produits PCR purifiés peuvent être stockés à -20 oC pendant plusieurs mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthèse Riboprobe<ol>
<li>Placez les tubes de microfuge sans RNase sur la glace et ajoutez ce qui suit au tube de microfuge (pour une réaction de 10 L) : 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x tampon de transcription, 0,5 L d’inhibiteurs de RNase, 1 L de polymérasés de l’ARN T7, 1 g de produit PCR et de l’eau sans RNase. Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse. Incuber pendant 2 h à 37 oC.</li>
		<li>Ajouter 2 L de DNase I. sans RNase. Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse. Incuber pendant 15 min à 37 oC.</li>
		<li>Ajouter 2 L 0,2 M EDTA (pH 8.0). Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse.</li>
		<li>Ajouter 2,5 l de 4 M LiCl et 75 l’éthanol préchilled à la réaction ci-dessus. Bien mélanger. Laisser reposer 30 min à -70 oC.</li>
		<li>Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Décant l’éthanol. Ajouter 1 ml d’éthanol précpiné à 70 % (v/v) et laver les précipitations en mélangeant doucement.</li>
		<li>Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 oC. Décanter l’éthanol de 70 % et sécher brièvement les précipitations près d’une lampe à alcool. Dissoudre les précipitations en ajoutant 30 L d’eau sans RNase et mélanger délicatement.</li>
		<li>Chargez 2 L d’ARN synthétisé sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 180 V pendant 5-10 min en 0.5x TBE. Mesurer la concentration de l’ARN étiqueté à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 260 nm.<ol>
<li>Utilisez des microfuges sans RNase et des conseils de filtre pour éviter la contamination par les RNase. REMARQUE : (point de pause) Les sondes étiquetées digoxygenine peuvent être stockées à -70 oC pendant plusieurs mois.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Collecte de fluides coélomiciques
<ol><li>Fixer les nudus S. sur la table de dissection avec des épingles. Ouvrez le corps des S. nudus avec de petits ciseaux autoclaved. Isoler le liquide coélomique avec une pipette.</li>
	<li>Recueillir et transférer 1 mL de liquide coélomique à l’égard d’une pipette sur des lames de microscope traitées en polyD-lysine. Appliquer le liquide coélomique uniformément à l’égard d’une pointe de pipette. Sécher les lames à l’air pendant 1 h à 37 oC.</li>
</ol>3. Hybridation in situ
<ol><li>Jour 1<ol>
<li>Réhydrabiliser les lames dans un bocal à coloration de la glissière contenant 100 ml de pyrocarbonate de diéthyle 1x traité de phosphate salin tamponné (DEPC-PBS). Réhydra 3 fois avec 1x DEPC-PBS, 5 min par lavage avec une agitation douce.</li>
		<li>Perméabiliser le frottis de liquide coélomique par digestion avec 10 g/mL proteinase K à température ambiante pendant 5 min. Incuber les glissières dans 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 minutes pour arrêter la digestion. Laver les diapositives en 1x DEPC-PBS avec une agitation douce pendant 5 min 3 fois.</li>
		<li>Ajouter 50 L de mélange d’hybridation (HM) contenant le sens/ riboprobe antisense sur les diapositives et ajouter un slip de couverture.</li>
		<li>Ajouter le tampon de boîte humide dans la boîte humide. Mettez les diapositives dans la boîte humide et scellez bien avec le film de paraffine. Hybrider la nuit (au moins 16 h) à 60 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 2<ol>
<li>Préchauffer le tampon de lavage à 65 oC. Immerger la glissière dans le pot de coloration de la diapositive contenant le tampon de lavage et laisser reposer jusqu’à ce que le coverlip glisse automatiquement. Il faut environ 5 min.</li>
		<li>Laver 2 fois avec un tampon de lavage à 65 oC, 30 min par lavage avec une agitation douce. Laver 2 fois avec un citrate salin-sodium (SSC) de 0,2x à 65 oC, 30 min par lavage avec une douce agitation. Laver 2 fois avec tampon d’acide mâle contenant Tween 20 (MABT) à température ambiante, 30 min par lavage avec une agitation douce.</li>
		<li>Incuber les toboggans à température ambiante pendant 3 à 4 h dans le tampon de blocage. Incuber les diapositives dans 1 mL anti-digoxigenin-AP Fab fragments solution diluée à 1/5000 avec le tampon de blocage à 4 oC pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 3<ol>
<li>Retirez la solution d’anticorps et lavez brièvement les diapositives dans LE MABT. Laver 4 fois avec LE MABT à température ambiante, 25 min par lavage avec une agitation douce.</li>
		<li>Incuber les lames avec tampon alcalin de phosphatase à température ambiante 3 fois, 5 min par lavage. Retirez le tampon alcalin phosphatase et ajoutez 1 ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)/nitro bleu tétrazolium (NBT) solution de colorant. Gardez les diapositives dans l’obscurité.</li>
		<li>Observez la réaction de couleur périodiquement sous un microscope optique. Lorsque la couleur est entièrement développée (temps de réaction dans la gamme de 1-4 h), laver les diapositives 2 fois avec MABT à température ambiante, 5 min par lavage avec une agitation douce.</li>
		<li>Laver 2 fois avec la solution d’arrêt à température ambiante, 15 min par lavage avec l’agitation douce. Incuber les lames dans le méthanol pour enlever l’excès de tache, à température ambiante pendant 30 min. Selon la couleur de fond, le lavage de méthanol peut être fait 2 ou 3 fois et le temps de décoloration peut être prolongé.</li>
		<li>Laver 2 fois avec MABT à température ambiante, 5 min par lavage avec une agitation douce. Transférer les diapositives sur un papier filtre frais. Ajouter 50 L de glycérol. Ajouter les coverlips et observer microscopiquement. REMARQUE : La composition de la solution est présentée dans le tableau 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des études antérieures ont montré que l’ISH est adapté pour détecter plusieurs ARN cibles16,17,18. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode ISH haute résolution pour détecter l’ARNm dans le fluide coélomique et mettre l’accent sur les conditions d’hybridation optimisées dans sipunculus nudus. Les signaux évidents de dmrt1 que nous avons observés ont démontré l’application réussie de ce protocole dans la...

ISH, à l’aide d’une sonde d’acide nucléique étiquetée pour détecter la séquence spécifique d’ADN ou d’ARN d’intérêt, est une méthode utile pour décrire le modèle d’expression spatiale des gènes cibles dans les tissus morphologiquement conservés1,2,3. Normalement, la séquence cible est générée par la réaction en chaîne de polymérase (PCR), puis utilisée comme modèle pour synthétiser la sonde antisense/sens de l’ARN étiquetée avec de l’uridine-5'-triphosphate digoxigenin. Les échantillons sont fixes et perméabilisés avant l’incubation avec des riboprobe. Après avoir lavé l’excès de sonde, l’hybridation est visualisée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps anti-digoxygenine, qui est alcalin phosphatase-conjugué3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordre Sipunculida: Sipunculidae) est un ver marin non mécublé, coelomate et bilatéralement symétrique7,8. Sipunculus nudus est une espèce cosmopolite largement répandue dans les eaux côtières tropicales et tempérées. Il s’agit également d’une ressource importante de pêche marine dans le sud de la Chine en raison de ses valeurs nutritionnelles et médicinales élevées9,10. Cependant, Sipunculus nudus en biologie moléculaire n’en est qu’à ses balbutiements. Pour bien comprendre le rôle biologique des gènes, l’étude des modèles d’expression des gènes à une résolution cellulaire est d’un grand intérêt. Dans l’organisme non-modèle Sipunculus nudus, la méthode ISH, qui est une méthode idéale pour détecter les modèles d’expression des gènes, n’a pas encore été établie. Son liquide coélomique contient plusieurs types de cellules, y compris les granulocytes, les cellules urne, les cellules vésiculaires, les cellules germinales, les érythrocytes,etc. Le double sexe/mab-3 facteur de transcription connexe-1 (dmrt1), utilisé comme gène représentatif dans cette méthode, est un régulateur transcriptionnel fortement conservé de la détermination du sexe et de la différenciation chez la plupart des espèces allant des invertébrés aux mammifères12,13. Dans une gamme d’espèces (c.-à-d. porgy noir, etc.) 14, dmrt1 a été exprimé dans les cellules Sertoli, entourant les cellules germinales, dont la fonction est similaire aux cellules trophoblastiques de Sipunculus nudus. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que dmrt1 de Sipunculus nudus est exprimé dans les cellules trophoblastiques de spermatozeugmata, et le résultat de la méthode ISH a clairement confirmé l’hypothèse.
Ce protocole décrit pour la première fois ISH, avec des sondes anti-arna anti-ense/sens étiquetées digoxigenin, pour déterminer les modèles d’expression de l’ARNm dans son frottis de fluide coélomique. Les conditions de réaction optimales sont fournies, qui permettent une visualisation très sensible de l’expression de l’ARNm à haute résolution. La méthode ISH développée pourrait être potentiellement appliquée chez plus d’espèces de Sipunculida autres que sipunculus nudus.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigénine-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT phosphatase alcaline kit de développement de couleur</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique trisodique</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>4/3/6132</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>Formamide désionisé</td><td>Amresco</td><td>12/7/1975</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle, DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Substance nocive</td></tr><tr><td>Digoxigénine (DIG) Marquage de l’ARN Mélange Roche</td><td></td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I,</td><td>Invitrogen</td> sans <td>RNase 18047019</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Imagerie sur gel d’électrophorèse</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kits d’extraction de gel</td><td>Omega</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td><td>DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>01/08/9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>67-56-1</td><td>Substance nocive</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>1310-73-2</td> Film <td>de</td></tr><tr><td>paraffine</td> corrosif <td>Bemis Company, Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, PFA</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Substance nocive</td></tr><tr><td>PCR Instrument</td><td>Life Technology</td><td>Proflex</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>Deli</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>plus G</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope traitées à la poly-D-lysine</td><td>Liusheng</td><td>VER_A01</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>SRE0005</tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de mouton</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>Pot de coloration pour lames</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de rangement pour lames</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>Petits ciseaux autoclaves</td><td>Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètres</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARN polymérases T7</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymérase mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10109517001</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Zhengzhou Grande Muraille Scientifique Industriel</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

hybridation in situ pour sipunculus nudus coelomic fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

L’hybridation in situ (ISH) est une technique très informative pour présenter des modèles de distribution cellulaire de gènes spécifiques (p. ex. l’ARNm et l’ARN) dans les tissus. Le ver sipunculide Sipunculus nudus est une ressource de pêche cruciale car il a des valeurs nutritionnelles et médicinales élevées. Actuellement, la recherche sur la biologie moléculaire de Sipunculus nudus n’en est encore qu’à ses balbutiements. Le but de cet article est de développer une méthode sensible pour localiser l’ARNm spécifique dans sipunculus nudus liquide coélomique. Le protocole comprend des étapes détaillées de l’ISH, y compris l’antisense étiqueté digoxigenin et la préparation des riboprobes sens, la collecte de liquide coélomique et la préparation de section, l’hybridation spécifique de riboprobe, l’incubation d’anticorps, la coloration et les traitements de post-coloration. Les résultats représentatifs obtenus à partir d’une expérience réussie utilisant cette méthode sont démontrés. Le protocole devrait également s’appliquer à d’autres espèces de Sipuncula.

Un résumé des étapes de l’ISH est illustré dans la figure 1. Les riboprobes de sens et correspondants pour dmrt1 ont été synthétisés des produits de PCR amplifiés des cDNA fluides coelomic. L’authenticité des produits PCR a été vérifiée par séquençage direct. Riboprobes ont été synthétisés à l’aide de polymérases T7 ARN selon les protocoles du fabricant et un rapport précédent4 avec quelques modifications mineures. Les signaux représentatifs de l’ISH sont ind...

Ce protocole décrit une approche efficace d’hybridation in situ pour détecter les niveaux d’expression de l’ARNm et les modèles spatiaux des gènes cibles dans le liquide coélomique sipunculus nudus.

Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

L’hybridation in situ est une technique très instructive pour présenter les modèles d’expression de l’ARNm et de l’ARN inc. de gènes spécifiques dans les tissus. Notre but dans cet article est de développer une méthode sensible pour détecter la localisation spécifique de l’ARNm dans le fluide coélomic de Sipunculus nudus, qui est une ressource de pêche cruciale. Nous avons présenté les résultats représentatifs obtenus de nos expériences réussies en utilisant cette méthode.Nous espérons que notre méthode s’appliquera à d’autres espèces de Sipuncula pour identifier les modèles d’expression de l’ARNm spécifique et de l’ARN incelomic dans le fluide coélomic. Fixer le Nudus Sipunculus sur la table de dissection. Ouvrez le corps du Nudus sipunculus avec de petits ciseaux autoclavés.Puis recueillir et transférer le fluide coélomic avec pipette à poly-D-lysine diapositives microscope traités, répartis légèrement. Séchez à l’air les toboggans pendant une heure à 37 degrés Celsius. Lavez les toboggans avec dePC-PBS pendant trois fois, cinq minutes par lavage avec une agitation douce.Égoutter le PBS, ajouter la solution proteinase K sur les glissières pendant cinq minutes à température ambiante. Égoutter la solution proteinase K. Ajouter la solution PFA sur les glissières pendant 20 minutes à température ambiante.Égoutter la solution PFA. Lavez les toboggans avec dePC-PBS pendant trois fois, cinq minutes par lavage avec une agitation douce. Égoutter le PBS.Ajouter 50 microlitres riboprobe. Ajouter un coverslip. Mettez les glissières dans la boîte humide et scellez bien avec du film de paraffine.Hybrider toute la nuit à 60 degrés Celsius. Immergez les glissières dans le tampon de lavage et laissez-les reposer jusqu’à ce que le coverslip glisse automatiquement. Lavez les toboggans avec le tampon de lavage préchauffé pendant deux fois à 65 degrés Celsius, 30 minutes par lavage avec une agitation douce.Lavez les glissières avec la solution SSC préchauffée pendant deux fois à 65 degrés Celsius, 30 minutes par lavage avec une légère agitation. Lavez les glissières avec la solution MABT deux fois à température ambiante. 30 minutes par lavage avec agitation douce.Égoutter le MABT. Ajouter le tampon de blocage. Incuber les toboggans à température ambiante pendant trois à quatre heures.Égoutter le tampon de blocage. Ajouter l’anticorps, incuber les glissières à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Égoutter la solution anticorps.Lavez les toboggans avec la solution MABT quatre fois, 25 minutes par lavage avec une agitation douce. Égoutter le MABT. Ajouter le tampon de phosphatase alcalin pendant trois fois, cinq minutes par incubation.Retirez le tampon de phosphatase alcaline. Ajoutez la solution de coloration BCIP-NBT. Gardez les diapositives dans le noir.Le temps de coloration varie de minutes en heures, même pendant la nuit, ce qui dépend de l’intensité du signal. L’état de coloration doit être vérifié plus fréquemment au début de la coloration. Par exemple, avec un intervalle de plusieurs minutes, et plusieurs heures au plus tard de la coloration.Le temps de vérification doit être aussi court qu’il peut l’être pour éviter d’introduire une signalisation de fond élevée en raison de l’exposition à la lumière. Les signaux représentatifs d’hybridation in situ sont affichés. L’hybridation in situ du liquide coelomic de Sipunculus nudus avec le riboprobe anti-sens qui cible dmrt1 indique la coloration pourpre concentrée dans les cellules trophoblastes du spermatozeugmata, de la figure 2A et du riboprobe de B.Sense pour dmrt1 n’a détecté aucun signal d’hybridation, figure 2C.Après avoir regardé cette vidéo, vous auriez une très bonne compréhension de la façon de visualiser les modèles d’expression de l’ARNm cible ou IncRNA dans le fluide coélomic de Sipunculus nudus.

in-situ-hybridization-for-sipunculus-nudus-coelomic-fluid

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ici, nous décrivons un débit à haute...

Un débit élevé In situ</emMéthode d&#39;hybridation> pour caractériser les modes d&#39;expression d&#39;ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

En combinant les méthodes de montage ARN...

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée...

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs un ensemble de méthodes pour la décapsulation à haut débit des embryons et des larves de Lymnaea stagnalis en préparation de l’hybridation in situ sur l’ensemble du mont, et pour les traitements ultérieurs de pré et post-hybridation.

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Nous présentons ici un protocole pour spatialement et temporellement évaluer la présence de la microflore viable dans les tripes de tique à l’aide d’une approche modifiée entier-Montez l’hybridation in situ.

Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ

L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.

In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Ce protocole permet la visualisation de l’expression génique dans embryonnaires agassizii Astyanax . Cette approche a été développée avec l’objectif de maximiser le signal d’expression de gène, tout en minimisant la coloration de fond non spécifique.

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.

In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros

Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.

Hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) pour visualiser la colonisation microbienne et l’infection dans les intestins de Caenorhabditis elegans

Les cellules T et ILC2 exprimant l’IL-9 sont induites au cours de l’infection à N. brasiliensis , mais leur caractérisation a été largement négligée dans l’intestin infecté en raison de leur faible fréquence et de leur cinétique différentielle. Ce protocole décrit l’isolement de ces cellules à partir de différents organes cibles et la confirmation de leur identité par cytométrie en flux à différents stades de l’infection.

Stratégie pour l’étude des cellules lymphoïdes productrices d’IL-9 dans le modèle d’infection à Nippostrongylus brasiliensis

Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche dans la méduse Cladonema. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier avec un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules souches, et le marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine permet l’identification des cellules proliférantes. Ensemble, des cellules souches proliférant activement peuvent être détectées.

Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum

Apprenez l'hybridation in situ pour détecter l'expression du gène dmrt1 dans le liquide cœlomique de Sipunculus nudus, une ressource halieutique importante. Cette méthode permet de visualiser les ARN messagers spécifiques.

Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Explorer plus de vidéos