Mesurer RAN Peptide Toxicity à C. elegans

Les peptides RAN sont une caractéristique des troubles neurodégénératifs à expansion répétée tels que la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale. Ces protocoles fournissent une approche normalisée importante pour quantifier la toxicité du peptide RAN dans le système modèle C.elegans. Les techniques décrites sont simples à apprendre et peu coûteuses, peuvent être exécutées rapidement, et tirer parti des caractéristiques reproductibles du système C.elegans telles que le mouvement et la reproduction.

Lorsque vous essayez ce protocole, le principal défi est d’obtenir une toxicité et une expression cohérentes du peptide RAN. Les principaux facteurs à contrôler comprennent la température des médicaments, le moment des changements de température et la préparation des plaques d’analyse. Il est important pour les expérimentateurs de classer systématiquement les phénotypes des animaux dans cet essai de processus dépendant de l’âge.

La démonstration visuelle de cette technique montre leurs critères de classification. Commencez par verser le milieu de croissance standard des nématodes avec un millimolaire IPTG et 25 microgrammes par carbenicilline millilitre dans des plaques de 24 puits. Stries RNAi clones d’alimentation dans les bactéries HT115 sur l’agar de carbenicilline LB et les cultiver à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, choisissez une seule colonie en un millilitre de liquide de carbenicilline LB et cultivez la bactérie pendant 18 heures à 37 degrés Celsius tout en secouant à 250 rpm. Repérait quatre puits individuels de la plaque ngm RNAi 24 puits avec 20 microlitres de cultures bactériennes nocturnes tel que décrit dans le manuscrit du texte et permettre aux bactéries RNAi d’induire la production d’ARN à double brin pendant la nuit. Utilisez la méthode standard d’hypochlorite pour isoler les œufs du premier jour de C.elegans adulte exprimant le transgène peptidique RAN intégré.

Ensuite, ensemencer environ 30 œufs dans chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber la plaque à 20 degrés Celsius pendant sept jours. Pour effectuer l’analyse de vitesse vidéo, acquérir deux vidéos à partir de deux puits distincts pour chaque condition RNAi à l’aide d’un microscope à disséquer stéréo équipé d’une caméra monochrome. Assurez-vous d’utiliser des paramètres d’acquisition cohérents entre les puits.

Pour chaque vidéo, réglez la durée pendant 10 secondes et l’intervalle de temps à 76 millisecondes. Réglez le temps d’exposition à l’image à quatre millisecondes et utilisez le paramètre de zoom de 1,49. Sélectionnez ensuite deux par deux binning.

Vérifiez que la résolution est de 800 x 600 pixels et commencez à enregistrer. Après l’acquisition, étiquetez chaque vidéo immédiatement avec la souche, l’état RNAi et le numéro de puits. Ensuite, mesurez la distance parcourue et la longueur de chaque animal pour 20 animaux différents par vidéo, en examinant un total d’environ 40 vers pour chaque condition RNAi.

Dans le logiciel, sélectionnez le bouton outils d’annotation. Ensuite, l’outil de texte de tirage. Cliquez sur un point au centre du ver mesuré dans la première image de la vidéo et marquez-le avec un numéro.

Avancez la vidéo jusqu’à la fin tout en suivant visuellement le ver. Cliquez ensuite dessus et marquez-le avec le numéro correspondant suivant. Utilisez l’outil de barre d’échelle de tirage pour tracer une ligne du premier numéro au deuxième numéro et enregistrer la distance parcourue dans une feuille de calcul.

Répétez cette mesure pour 19 autres vers dans la vidéo tout en préservant chaque mesure individuelle dans la fenêtre d’analyse. Une fois les mesures terminées, prenez un instantané du cadre vidéo final illustrant toutes les lignes de mesure afin que les données puissent être retracées jusqu’à l’animal d’où elles proviennent. Ensuite, analyser les données à l’aide d’une feuille de calcul à quatre colonnes où la colonne 1 est l’identificateur de ver et la colonne deux est la vitesse.

L’heure de chaque vidéo peut être trouvée en cliquant à droite sur la vidéo sous l’expérience et en allant aux propriétés. Pour normaliser la mesure de la vitesse, trouvez la longueur de chaque animal. Utilisez l’outil de polylin de tirage pour tracer librement le C.elegans de la pointe de la tête jusqu’à l’extrémité de la queue.

Ensuite, prenez un instantané du cadre vidéo final illustrant toutes les polylines. La longueur des lignes sera consignée dans les statistiques. Ajouter deux colonnes à la feuille de calcul, une pour la longueur de l’animal et une pour une vitesse normalisée.

Enfin, analyser les données de vitesse normalisées à l’aide d’un ANOVA uni-sens avec des tests post-hoc par rapport au vecteur vide RNAi. Placez quatre à six L4 C.elegans transgéniques exprimant le peptide RAN GFP sur une plaque RNAi GFP de six centimètres et cultivez-les à 20 degrés Celsius. Si l’expérience utilise rnai pour tester les effets génétiques sur la toxicité du peptide RAN, déplacer 10 adultes gravid transgéniques à chacun des deux vecteurs vides RNAi GFP RNAi ou des plaques RNAi spécifiques aux gènes.

Si des mutants sont utilisés pour analyser les effets génétiques sur la toxicité du peptide RAN, placez 10 animaux sauvages gravid ou mutants exprimant le même transgène RAN sur chacune des deux plaques RNAi vectorielles vides ou GFP RNAi. Cultivez-les à 20 degrés Celsius pendant 48 heures. Choisissez 10 ensembles de 10 L4 transgéniques dans les plaques RNAi et placez chaque ensemble sur une plaque RNAi de trois centimètres.

Assurez-vous que les vers sélectionnés pour l’analyse ont tous une motilité superficiellement normale. Placez les plaques dans un sac en plastique pour retenir l’humidité et les incuber à 25 degrés Celsius. Après 24 heures, analyser les animaux pour la mobilité en tapant les plaques sur le microscope disséquant et en vérifiant le mouvement.

Si un ver se déplace plus d’une longueur de corps, comptez-le comme mobile et transférez-le à une nouvelle plaque RNAi de trois centimètres. Utilisez une pioche en platine pour taper le reste des vers sur la tête et la queue. Si l’animal se déplace plus d’une longueur de corps, comptez l’animal comme mobile et transférez-le à une nouvelle plaque RNAi de trois centimètres.

Si une paralysie significative n’est pas observée dans la lutte antivectorielle vide au deuxième jour, terminez l’analyse et recommencez. Regroupez tous les vers non mobiles de sorte que le mouvement de plus d’une longueur corporelle puisse être facilement détecté. Comptez tous les vers paralysés, ensachés ou morts et jetez la plaque.

Continuer à marquer les animaux pour la paralysie tous les jours pendant cinq à sept jours. L’essai de croissance a été employé pour mesurer l’effet des inhibitions de gène sur la toxicité des dipeptides de RAN qui sont trouvés dans les patients de SLA présentant une expansion répétée de G4C2. L’expression du PR50 GFP seul a eu comme conséquence un arrêt complet de croissance, mais le renversement de plusieurs gènes a supprimé la toxicité développementale.

L’effet des renversements spécifiques de gène sur la motilité développementale des animaux exprimant pr50 a été mesuré utilisant la méthode d’analyse de vitesse vidéo. Comme prévu, l’inhibition de l’expression pr50 GFP a entraîné une forte augmentation de la motilité par rapport au vecteur vide RNAi. En outre, le RNAi contre la sous-unité protéasome RPN7 a entraîné l’augmentation significative de la motilité PR50.

Quand des phénotypes adultes ont été analysés avec l’essai de paralysie âge-dépendant, PR50 GFP a exhibé jusqu’à 80% paralysie par cinq jours d’âge. Cependant, RNAi dirigé vers le gène cul-6 paralysie significativement retardée suggérant que cul-6 est nécessaire pour la toxicité de PR50 GFP. Pour déterminer si les protéines RAN causent la neuropathologie lorsqu’elles sont exprimées dans les neurones de C.elegans, la toxicité neuronale spécifique a été examinée à l’aide de l’analyse de commissaire.

Dans le deuxième jour adultes, l’expression de PR50 GFP dans les neurones moteurs a mené à une augmentation significative du saignement de neurone moteur. Cette neuropathologie a été sensiblement supprimée par une mutation dans le gène de récepteur d’IGF d’insuline homolog DAF-2 qui retarde les propriétés toxiques de plusieurs protéines neurodegenerative. Pour l’analyse comportementale, il est important que les peptides RAN produisent un phénotype hautement pénétratif.

Ces gènes ou médicaments pourraient fournir de nouveaux biomarqueurs ou options thérapeutiques pour les maladies peptidiques RAN. En utilisant ces analyses, nous avons effectué un écran RNAi à l’échelle du génome pour les suppresseurs de la C9ORF72 associé RAN peptide proline-arginine. Les gènes identifiés dans cet écran comprennent de nombreux gènes nouveaux et conservés qui feront l’objet de futures études mécanistes.