Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus
18 mai 2020
Nous présentons un essai RT-LAMP pour la détection de TiLV chez le poisson tilapia à l’aide d’instruments simples sur une période de temps relativement courte par rapport aux techniques RT-PCR conventionnelles. Ce protocole peut aider à contrôler la propagation épidémique de TiLVD, en particulier dans les pays en développement.
Le virus du lac Tilapia est un virus émergent et des agents pathogènes contagieux, qui causent une mortalité élevée chez le tilapia et ses espèces hybrides. Comme le tilapia est une source principale de protéines pour de nombreux pays en développement, la nouvelle infection virale a un grand impact sur l’aquaculture du tilapia, et menace également la sécurité alimentaire mondiale. Le développement d’une méthode rapide, précise et sensible pour détecter le virus dans les tissus des poissons, aidera à la lutte contre la maladie, et de réduire l’impact du virus.
Dans cette vidéo, nous montrerons l’amplification isothermale en boucle de transcription inverse, ou essai de RT-LAMP, pour la détection rapide du virus de lac de tilapia dans des échantillons de poissons. Deuxième partie, extraction de l’ARN. Tout d’abord, ajouter 3250 milligrammes de tissu hépatique dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitres, contenant 600 à 1000 microlitres acide guanidinium-phénol réagencé, et hacher jusqu’à homogénéité.
Centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes, et transférer le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal de 95 % d’éthanol au tube et bien mélanger. Transférer la solution dans une colonne de spin, placée dans un tube de collecte, puis centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes.
Jetez le flux et transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte. Ajouter 400 microlitres d’ARN PreWash dans la colonne, et centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes. Jetez le flow-through, et répétez cette étape.
Ajouter un tampon de lavage d’ARN de 700 microlitres dans la colonne, et une centrifugeuse à 10 000 RCF pendant deux minutes. Ensuite, transférez la colonne dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Enfin, allongez l’ARN dans la matrice de colonne avec un 100 microlitres, de l’eau sans nucléase et une centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes.
Troisième partie, conception d’amorce. Le PrimerExplorer Version 4 est l’outil bioinformatique le plus courant pour concevoir des amorces LAMP, ou RT-LAMP efficaces, dans lesquelles de bons manuels pour le logiciel sont disponibles sur leur site Web. Ici, quatre amorces spécifiques, composées de deux amorces internes et de deux amorces externes, ont été conçues pour reconnaître six régions distinctes dans le segment 3 de TiLV, originaires de Thaïlande.
Après avoir entré sur le site Web, où le lien est affiché dans la vidéo, cliquez sur PrimerExplorer V4. Choisissez le fichier contenant la séquence du segment 3 de TiLV, en format FASTA, récupéré à partir du numéro accès GenBank, KX631923, ou tilapia lake virus TV1 segment 3, puis cliquez sur le bouton Primer Design. Une fois que vous cliquez sur le bouton Générer, le logiciel se traitera, et les résultats s’afficheront. Après avoir optimiser les séquences pour l’amplification lamp, au total, une paire d’amorces externes, et deux paires d’amorces internes, ont été sélectionnés pour cette étude, pour détecter l’infection tilv.
Cet ensemble des amorces sont montrés ici. Quatrième partie, démonstration de RT-LAMP. Le mélange principal pour RT-LAMP spécifique pour le virus du lac tilapia, comprend les produits chimiques suivants.
Préparer un mélange maître à l’aide des produits chimiques indiqués dans la table. Distribuez 22 microlitres de mélange principal dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez trois microlitres de modèle d’ARN dans le tube de réaction.
Pour le contrôle négatif, utilisez de l’eau distillée au lieu de matériaux ARN, et bien mélanger. Incuber les réactions à 65 degrés Celsius pendant 60 minutes, suivies de 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation pendant 30 minutes, les changements calorimétriques sont observés visuellement à l’œil nu.
Le cas échéant, nous pouvons confirmer les résultats de l’analyse RT-LAMP, en effectuant l’électrophorèse gel sur 1,5% gel agarose, en cours d’exécution avec une constante de 100 Volts, pendant 40 minutes, par lequel une échelle d’ADN de taille moléculaire d’un kilobase-paire est chargé le long comme un marqueur pour déterminer la taille du fragment. Cinquième partie, résultats représentatifs et interprétation. Après l’incubation pendant 30 minutes, la réaction de fluorescence de grain suggérant l’amplification positive de TiLV dans les tissus de poissons, ont été évidemment observées dans les échantillons infectés sous la lumière UV à une longueur d’onde de 365 nanomètres, alors que ceux du contrôle négatif ont eu une solution claire et légèrement incolore.
En conséquence, l’amplification des produits RT-LAMP a été confirmée sur l’électrophoresis de gel d’agarose, montrant différentes tailles des amplifications multiples des répétitions inversées d’ADN, formant des structures de tige-boucle sous la lampe UV dans les échantillons TiLV-infectés, alors qu’aucune bandes n’a été montrée dans les puits du contrôle négatif, où les résultats étaient conformément à ceux de l’essai de RT-LAMP. Ainsi, pour réduire la propagation du virus du lac tilapia, un dépistage immédiat de ces poissons infectés, en utilisant une méthode de diagnostic efficace, est l’une des clés importantes. Ainsi, le nouvel essai RT-LAMP devrait offrir un outil de diagnostic rapide et sensible à appliquer dans le processus de mesure de biosécurité.
L’essai pourrait être utilisé soit dans le laboratoire, soit sur place. Nous espérons que la méthode sera mise en œuvre pour dépister la population de poissons infectés qui pourrait conduire à la réduction de la propagation du virus du lac tilapia.
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Aperçu
Cet article présente un test RT-LAMP rapide pour la détection du virus du lac du tilapia (TiLV) chez le poisson tilapia, offrant une alternative plus rapide aux méthodes conventionnelles de RT-PCR. Le protocole vise à aider à contrôler la propagation du TiLV, en particulier dans les pays en développement où le tilapia constitue une source de protéines essentielle.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Aquaculture
- Détection des agents pathogènes
Contexte
- Le virus du lac Tilapia est un agent pathogène contagieux provoquant une forte mortalité chez le tilapia.
- Le virus représente une menace importante pour l'aquaculture du tilapia et la sécurité alimentaire mondiale.
- Les méthodes de détection actuelles sont souvent longues et complexes.
- Une méthode de détection rapide est essentielle pour une maîtrise efficace de la maladie.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rapide et sensible pour détecter le TiLV dans les tissus de poisson.
- Réduire l'impact du TiLV sur l'aquaculture du tilapia.
- Proposer une solution pratique pour la gestion des maladies dans les pays en développement.
Méthodes utilisées
- Essai d'amplification isototherme par transcription inverse en boucle (RT-LAMP).
- Extraction d'ARN à partir de tissu hépatique de tilapia.
- Utilisation d'instruments simples pour des tests rapides.
- Comparaison avec les techniques conventionnelles de RT-PCR.
Résultats principaux
- Le test RT-LAMP permet une détection rapide et précise du TiLV.
- Cette méthode est plus simple et plus rapide que la RT-PCR traditionnelle.
- Elle peut être mise en œuvre dans des environnements à ressources limitées.
- Le protocole pourrait contribuer à limiter la propagation du TiLV au sein des populations de tilapia.
Conclusions
- Le test RT-LAMP est un outil prometteur pour la détection du TiLV.
- Il soutient les efforts de contrôle des maladies en aquaculture.
- Des études supplémentaires pourraient améliorer son application dans divers contextes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection rapide et spécifique des agents pathogènes viraux émergents, tels que le virus du lac du tilapia (TiLV), est essentielle pour protéger la production aquacole et la sécurité alimentaire mondiale. Le test RT-LAMP permet une identification rapide de l'infection par le TiLV dans les tissus des poissons, facilitant ainsi une intervention précoce et des mesures de biosécurité. Cette approche réduit la dépendance aux méthodes moléculaires exigeant beaucoup de main-d'œuvre et permet une analyse en grand volume dans des contextes aux ressources limitées.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet la détection spécifique de l'ARN du TiLV, soutenant la confirmation de la cible virale dans les tissus hôtes infectés.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode d'amplification rapide, isotherme, qui ne nécessite pas d'équipement de cyclage thermique.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Génère des résultats visuels ou fluorométriques en moins de 60 minutes, permettant une évaluation rapide de la présence virale.
- Valeur opérationnelle : Nécessite un équipement minimal et peut être utilisé sur le terrain ou en laboratoire pour des criblages à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre l'applicabilité à des types d'échantillons non létaux tels que le mucus, permettant une surveillance longitudinale de la charge virale.
- Valeur opérationnelle : Permet des études longitudinales dans des modèles animaux sans sacrifice des sujets, améliorant la conception expérimentale et réduisant la variabilité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test RT-LAMP s'inscrit dans la continuité de la découverte en fournissant un outil de détection utilisable après la génération d'hypothèses et avant les études d'intervention thérapeutique ou prophylactique.
- Biologie de la découverte : Permet de valider la présence du virus dans des échantillons biologiques, soutenant ainsi les études mécanistiques de la pathogenèse du TiLV.
- Dépistage : Permet une évaluation rapide du statut infectieux au sein de cohortes d'échantillons, améliorant la préparation des tests pour l'évaluation de composés antiviraux.
- Analytique : Fournit des résultats quantitatifs ou semi-quantitatifs par détection visuelle de la turbidité, de la fluorescence ou par électrophorèse sur gel, facilitant l'analyse comparative.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité allant de la détection initiale à l'évaluation préclinique de stratégies d'intervention dans des modèles de maladie pertinents.
- Réutilisation en milieu professionnel : Constitue une plateforme modulaire de détection des acides nucléiques adaptable à d'autres pathogènes émergents dans les systèmes aquacoles ou d'élevage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la validation des cibles grâce à une détection spécifique et sensible de l'ARN viral.
- Valeur opérationnelle : Offre une compatibilité sans équipement, en conditions de soins primaires, avec des résultats lisibles à l'œil nu ou à l’aide d’un transilluminateur simple.
- Valeur stratégique : Réduit le délai d’obtention des résultats pour le dépistage des infections, permettant des décisions plus rapides d’avancement ou d’arrêt dans la progression des études.
- Impact sur le portefeuille : Améliore l’évaluation des risques dans les programmes précliniques en fournissant des données fiables sur le statut infectieux, réduisant ainsi les variables de confusion.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie moléculaire et en conception d'amorces pour les tests basés sur la LAMP.
- Requiert un accès à des kits d'extraction d'ARN, à un bain-marie ou à un bloc chauffant, ainsi qu'à des outils de visualisation (par exemple, lumière UV ou électrophorèse sur gel).
- Exige une standardisation des protocoles de préparation des échantillons selon les types de tissus (par exemple, foie, mucus) afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique la validation de la spécificité du test vis-à-vis de pathogènes apparentés afin d'éviter les faux positifs.
- Est limité par la nécessité d'ensembles d'amorces optimisés et par l'inhibition potentielle due à des matrices biologiques complexes.
