Utilisation de la cytométrie du débit pour détecter et quantifier la formation de sang altérée chez le poisson zèbre en développement

Ce protocole est significatif parce qu’il permet le renversement et la sur-expression des gènes chez un poisson en développement, et la quantitation de ces effets en aval sur les cellules sanguines. Ce protocole est rapide, facile à exécuter, économique et facile à automatiser avec accès à l’instrumentation appropriée. Kristen Rueb, chercheuse de premier cycle au laboratoire, démontrera cette procédure.

Commencez par transférer entre cinq et 200 embryons après fécondation de 48 heures dans une boîte de Pétri en plastique de 10 centimètres. Inclinez le plat pour que l’embryon descende vers le bord inférieur et retirez autant d’E3 moyen du plat que possible. Ajouter ensuite 500 microlitres de protéase de déchorionation aux embryons.

Après cinq minutes à température ambiante, inclinez tous les embryons vers le bord inférieur de la plaque à nouveau et appuyez doucement sur le côté du plat, permettant aux embryons de frotter doucement contre le fond de la plaque pour enlever complètement leurs chorions. À l’aide d’une bouteille pressée, ajouter environ 20 millilitres de milieu E3 pour diluer la protéase et permettre aux embryons de se déposer. Puis décanter le milieu, et rincer les embryons trois fois de plus avec un milieu frais comme juste démontré pour enlever toutes les traces de la protéase.

Pour préparer les embryons à la dissociation, utilisez une pipette P1000 pour transférer de cinq à dix embryons dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre et aspirez le milieu E3 transféré. Ajouter ensuite un millilitre de TNT de 10 millimolaires dans le milieu E3 au poisson zèbre embryonnaire, et placer le tube de microcentrifugeuse en position horizontale pendant 30 minutes à température ambiante pour enlever le revêtement du mucus. Pour la dissociation embryonnaire, laver les embryons traités par TNT trois fois avec un millilitre de DPBS complété par du calcium et du magnésium par lavage.

Avant d’ajouter 500 microlitres de DPBS complétés avec du calcium et du magnésium, et cinq microlitres de cinq milligrammes par millilitre, protéase de dissociation. Puis incuber les échantillons à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital horizontal à 185 révolutions par minute pendant 60 minutes. Assurez-vous de vérifier périodiquement les embryons, afin de ne pas trop les digérer.

Lorsqu’un échantillon pas complètement homogène avec un peu de tissu solide présent peut être observé, triturer les embryons avec une pipette P1000 jusqu’à ce que l’échantillon soit entièrement dissocié. Pour préparer les cellules embryonnaires dissociées du poisson zèbre à la cytométrie d’écoulement, transférez l’échantillon cellulaire entier sur le réservoir supérieur d’un tube de fond rond en polystyrène de cinq millilitres, avec un bouchon de passoire cellulaire de 35 micromètres. Rincer le bouchon avec quatre millilitres de PBS sans calcium ni magnésium, et pelleter les cellules par centrifugation.

Puis résuspendez les cellules en 500 microlitres de PBS sans calcium et magnésium par tube. Pour l’analyse cytométrique d’écoulement des cellules embryonnaires de zebrafish, vortex doucement les suspensions cellulaires avant d’ajouter une dilution d’un à mille de tache rouge de cellules mortes à chaque tube. Dans les 30 minutes qui ont après l’application de la tache de cellule morte, videz le réservoir de déchets, remplissez le réservoir de gaine avec la solution appropriée et démarrez le système fluidique du cytomètre d’écoulement.

Dans le logiciel d’analyse, dessiner cinq parcelles, et définir la première parcelle pour mesurer vers l’avant par rapport à la dispersion latérale. Réglez la dispersion vers l’avant en linéaire, et le côté se disperse en logarithmique. Réglez la deuxième parcelle pour mesurer la hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la largeur de dispersion avant, et la troisième parcelle pour mesurer la hauteur de dispersion par rapport à la largeur latérale de dispersion.

Réglez la quatrième parcelle pour mesurer la tache rouge de cellules mortes sur l’axe x, et la dispersion latérale sur l’axe y pour permettre la discrimination de vivre à partir de cellules mortes. La cinquième parcelle doit être réglée pour mesurer le fluorophore de choix. Lorsque toutes les parcelles ont été réglées, chargez l’échantillon sur le cytomètre et réduisez le débit afin que les cellules ne s’épuisent pas rapidement.

Ajustez les paramètres de dispersion avant et latéral de sorte que la majeure partie de la population cellulaire puisse être clairement observée, et dessinez une barrière autour de la population cellulaire. Étiquetez ces cellules de porte. Avec la deuxième parcelle de point fermée sur les cellules, porte sur la dispersion vers l’avant et les singlets de dispersion latérale pour exclure les doublets.

Dans la quatrième parcelle, ajuster les paramètres de tache de cellules mortes rouges de sorte qu’il y ait une population clairement négative. Dessinez une porte autour de ces cellules et étiquetez cette porte cellules vivantes. Dans la cinquième parcelle, portez les cellules vivantes et dessinez une porte autour des cellules positives, puis exécutez chaque échantillon recueillant au moins 25 000 événements cellulaires vivants.

Lorsque tous les échantillons ont été analysés, suivez la procédure d’arrêt pour éteindre les fluides, remplir le réservoir de gaine et vider le réservoir de déchets. Après avoir analysé le pourcentage de globules rouges positifs GFP de chaque échantillon embryonnaire de poisson zèbre, la moyenne de tout le groupe témoin peut être calculée. En règle générale, la moyenne est définie comme un seul et tous les pourcentages sont calculés à partir de ce point de référence.

Dans cette analyse représentative, il a été déterminé que la réduction de la transcription ISM1 avec un morpholino spécifique, réduire le nombre de globules rouges positifs GFP présents dans les 48 heures après la fécondation embryons. Sauver cette réduction des niveaux ISM1 morpholino avec l’ARNm exogène, retourner le nombre de globules rouges à la normale. Une bonne digestion sur les échantillons est essentielle.

Si vous sur-digérer ou sous-digérer, vous n’obtiendrez pas les bons résultats. Si un télécopieur est disponible, les chercheurs peuvent recueillir les cellules sanguines en triant pour la culture in vitro, le séquençage de l’ARN et le RT-PCR quantitatif.