Name: Mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Découvrez le criblage de médicaments en temps réel sur des tranches tumorales organotypiques. Cette méthode permet d'évaluer la viabilité tissulaire avec un débit moyen-élevé pour accélérer le développement préclinique en oncologie.

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Ce travail a été soutenu par les NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] et Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Nous tenons à remercier la Dre Alana Welm (Université de l’Utah) d’avoir fourni la tumeur PDX du cancer du sein. Nous tenons également à remercier le personnel de la médecine comparée, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) pour l’entretien du modèle PDX et les membres du laboratoire Gujral pour des discussions utiles. N.N.A est appuyée par la JSPS Overseas Research Fellowship and Interdisciplinary Training Grant du FHCRC. A.J.B. est soutenu par la subvention de formation sur le métabolisme des chromosomes et le cancer du FHCRC.

Toutes les expériences sur les souris ont été réalisées conformément aux recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Animal Welfare Act et des National Institutes of Health Guidelines for the care and use of animals in biomedical research.
1. Préparation des tranches de tissu tumoral
<ol><li>Préparer la culture des tranches de tissu (TSC) milieu suivant la recette dans le tableau 1. Filtrer le milieu à l’appel d’une unité de filtre à vide de 0,45 m pour stériliser.</li>
	<li>Aliquot 250 'L de TSC moyen par puits pour une plaque de 24 puits, ou 1 ml de milieu par puits pour une plaque de 6 puits. Conserver la plaque dans un incubateur humidifié de 37 oC et 5 % de CO2 jusqu’à son utilisation. REMARQUE : Le médium et les suppléments peuvent être optimisés en fonction des types de tissus et des objectifs expérimentaux. La quantité de milieu doit être juste assez pour tremper la membrane poreuse d’un insert de culture. Ne dépassez pas le niveau de la membrane. Ajuster le volume moyen si le niveau moyen est trop bas ou trop élevé. Si les chercheurs testent des agents immunomodulateurs, nous recommandons la supplémentation du milieu avec IL-210.</li>
	<li>Si vous utilisez le tissu tumoral dérivé de souris, euthanasiez les souris avec une procédure recommandée, désinfectez la peau exposée des souris en pulvérisant 70% d’éthanol, et disséquent les tumeurs avec des techniques aseptiques. Conservez le tissu tumoral dans un tube contenant la solution de sel équilibré (HBSS) glacée de Hank.</li>
	<li>Si vous utilisez des tissus tumoraux patients frais, entreposez-les dans le HBSS glacé à court terme, ou la solution à froid glacé de l’Université Belzer du Wisconsin (UW) pour un stockage à plus long terme (jusqu’à 24 h) pour préserver la viabilité des tissus. REMARQUE : Des tranches d’un tissu PDX expédiés pendant la nuit dans une solution UW glacée ont été préparées avec succès.</li>
	<li>Transférer le tissu tumoral dans une plaque de culture de 10 cm contenant du HBSS glacé. Couper la tumeur en deux avec un scalpel alors qu’il est immergé dans le HBSS glacé. Façonner les tissus tumoraux en cylindres à l’aide d’un poinçon de biopsie de 6 mm de diamètre et couper un côté pour créer une surface plane. Conservez les tissus dans le HBSS glacé jusqu’à l’utilisation. REMARQUE: Évitez d’inclure la zone nécrotique du tissu, qui est généralement au centre et a un aspect opaque et fragile.</li>
	<li>Configurez le vibratome. Désinfecter tout l’équipement à l’aide de 70 % d’éthanol. Placer le plateau tampon vibratome recouvert d’un couvercle en verre acrylique au centre du bain de glace vibratome. Ajouter de la glace au bain de glace et remplir le plateau tampon de HBSS refroidi pour garder le tissu frais pendant le découpage. Attachez une lame de rasoir au porte-lames. REMARQUE : Bien que le maintien des vibratomes dans un environnement semi-stérile n’ait pas affecté les expériences antérieures, il est recommandé de stocker le vibratome sous une armoire de biosécurité si disponible.</li>
	<li>Soulevez soigneusement un tissu tumoral à poinçonnage de biopsie du HBSS à l’aide de forceps à dents et retirez l’excès de mémoire tampon en tamponnant le tissu avec un essuie-tout sans peluche.</li>
	<li>Placez une goutte de colle de cyanoacrylate de qualité médicale sur la plaque de spécimen et placez le tissu sur cette goutte. Séchez la colle à l’air pendant 2 à 3 minutes et placez la plaque dans le plateau tampon. Complétez avec un peu de HBSS jusqu’à ce que le tissu soit entièrement immergé dans le tampon. REMARQUE : Le montage des tissus dans une position verticale et stable est essentiel pour générer des tranches uniformément coupées. Si les tissus montés sont instables, soit ajouter plus de colle au tissu environnant pour conserver une position verticale ou décharger le tissu, aplatir le fond, et le coller à nouveau. Les tissus élastiques ont tendance à être poussés et pliés plus facilement pendant le tranchage, auquel cas des longueurs plus courtes (lt;5 mm) et plusieurs pistes peuvent être appropriées. Pour les tissus extrêmement fragiles, les essuie-tout peuvent détruire le tissu. Dans ce cas, le tissu peut être placé sur une surface en plastique pour évacuer certains excès de HBSS.</li>
	<li>Ajuster les réglages vibratome. Les réglages suivants sont utilisés : épaisseur de coupe de 250 m, amplitude de 3,00 mm, vitesse de tranchement de 0,01 à 0,25 mm/s, et angle de lame de 15 à 21 degrés. REMARQUE : Optimisez les réglages de découpe en fonction de la rigidité du tissu. Les tissus plus mous sont plus facilement coupés avec un angle plus profond de lame à une vitesse plus basse. Un angle de lame de 18 degrés, une vitesse de coupe comprise entre 0,10 et 0,18 mm/s, et une amplitude de 3,00 mm fonctionne bien pour les tumeurs 4T1 et PDX HCI010. Les tissus plus rigides peuvent être coupés avec une vitesse de lame plus rapide.</li>
	<li>Définissez les emplacements de départ et de fin de la lame et ajustez la hauteur de la scène. Exécuter l’instrument avec un mode continu pour couper les tranches pendant plusieurs cycles jusqu’à ce que les tissus sont coupés uniformément.</li>
	<li>Continuez à trancher le tissu. Transférer les tranches avec une petite quantité de tampon HBSS sur l’insert de culture cellulaire avec moyen avec une pipette de transfert à large pointe, en utilisant l’aspiration pour soulever la tranche entière. Déposer une tranche par insert sur une assiette de 24 puits. Un insert pour 6 assiettes de puits peut accueillir jusqu’à quatre tranches pour un essai de reproduction. REMARQUE : Si le dernier bord de la tranche de tissu est toujours attaché au tissu non coupé, arrêtez le vibratome et séparez la tranche de tissu avec deux paires de forceps fins de pointe sans toucher ou piquer les tranches de tissu. Une lame de rasoir séparée peut être utile pour enlever le tissu suspendu.</li>
	<li>Retirez tout tampon excédentaire avec une pipette de transfert de pointe fine.</li>
	<li>Lorsque la lame atteint près des tissus collés, arrêtez l’instrument, abaissez le stade, retirez le tissu raidi avec une lame séparée et montez un nouveau tissu. Continuer à trancher jusqu’à ce que suffisamment de tranches aient été recueillies.</li>
	<li>Culture les plaques dans un incubateur humidifié fixé à 37 oC, 5% de CO2. Les tranches de tissu sont cultivées à l’interphase air-liquide sur l’insert de culture cellulaire. Les tranches de tissu sont prêtes pour des expériences 24-48 h après la préparation initiale de la tranche. Pour la culture à long terme, échangez le milieu tous les 2-3 jours.</li>
</ol>2. Mesure de viabilité
<ol><li>Pour la mesure de viabilité de la tranche tissulaire, échangez le milieu avec un réactif de mesure de viabilité basé sur la luminescence contenant à la fois la luciferase et le prosubstrate à 1:1,000 dilution dans le milieu TSC suivant les instructions du fabricant. Le réactif mesure l’activité de réduction des cellules vivantes du prosubstrate métabolisé à la luciferine11. Transférer 50 L de mélange d’enzymes-substrates sur chaque tranche de tissu.</li>
	<li>Incubate avec une agitation douce sur un shaker orbital situé à l’intérieur d’un incubateur humidifié fixé à 37 oC avec 5% de CO2 pendant la nuit.</li>
	<li>Les signaux luminescents peuvent être mesurés à l’aide d’un lecteur de microplaque ou d’un instrument d’imagerie in vivo pour les tissus cultivés dans une plaque de 24 puits. Pour mesurer la viabilité individuelle de plusieurs tissus sur une plaque de 6 puits, un système d’imagerie in vivo devrait être utilisé.<ol>
<li>Lorsque vous utilisez un lecteur de microplaque, réglez la microplaque sans couvercle. Tout type de lecteur de microplaque capable de mesurer l’intensité luminescente devrait convenir à l’expérience. Nous avons utilisé les paramètres suivants : le temps de lecture 1 s, la mesure par le haut, le gain de 200. REMARQUE : Pour une plus grande précision, utilisez une microplaque à paroi blanche pour configurer l’expérience. Des plaques de puits à parois blanches et à fond clair de 24 ont été testées et, dans la plupart des cas, les plaques de puits claires ne compromettent pas les résultats.</li>
		<li>Lors de l’utilisation d’un système d’imagerie in vivo pour mesurer la viabilité, placez la plaque au centre de la scène et retirez le couvercle. Acquérir des images photographiques normales suivies d’images luminescentes avec un champ de mise en scène à C, temps d’exposition automatique, f-stop 1, réglage objectif comme microplaque avec hauteur du sujet - 0,0 cm.</li>
		<li>Quantifiez l’intensité luminescente à l’aide du logiciel d’imagerie accompagné du système d’imagerie in vivo. Dessinez des régions d’intérêt cohérentes (ROI) autour de chaque tranche de tissu. Ce protocole utilise un cercle de 1 cm de diamètre comme retour sur investissement (voir la figure 1). Mesurer le flux total (p/s) de la zone.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Évaluation de l’effet médicamenteux sur les tranches de tissu
<ol><li>Mesurer la viabilité de base avant le traitement à l’aide du réactif de mesure de la viabilité fondé sur la luminescence, comme l’explique la section 2. REMARQUE : Si plusieurs tissus ont une viabilité significativement plus faible par rapport à d’autres, omettez les tissus de l’essai.</li>
	<li>Dissoudre les médicaments dans le sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour faire des solutions de stock. Préparer une solution de médicament 10x avec TSC ou autre milieu de culture (25 L/puits pour une plaque de puits de 24 contenant 250 L de milieu) aux concentrations désirées. Pour le contrôle du véhicule, préparer un support contenant un volume équivalent de DMSO.</li>
	<li>Complétez la solution de drogue 10x au milieu de culture au bas du puits. Mélanger par tuyauterie et transférer 50 l’un du milieu sur le dessus des tissus. REMARQUE : Si plusieurs tranches de tissu sont disponibles, testez des doublons ou des triplicates pour chaque condition.</li>
	<li>Incuber toute la nuit avec des secousses douces sur un shaker orbital dans un 37 'C, 5% de CO2, incubateur humidifié.</li>
	<li>Retirer la plaque du shaker et incuber statiquement dans le 37 oC, 5% de CO2, incubateur humidifié.</li>
	<li>Aux points de temps souhaités, mesurez l’intensité luminescente des tissus à l’aide d’un lecteur de microplaque ou d’un système d’imagerie in vivo. Habituellement, les effets de drogue deviennent détectables après 1-6 jours de traitement. REMARQUE : Le réactif de viabilité basé sur la luminescence est stable pendant au moins 3 jours dans des conditions culturelles. Cependant, le substrat peut être épuisé pendant l’essai en fonction de l’activité métabolique du tissu. Si une baisse significative du signal est observée dans les tissus avec des signaux précédemment élevés, complétez le substrat dans tous les puits.</li>
	<li>Calculer la viabilité restante des tissus tumoraux traités à l’aide de l’équation suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> La viabilité du tissu traité est normalisée par sa viabilité de base et le déplacement de viabilité des tissus de tumeur de contrôle.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous démontrons une plate-forme pour des études quantitatives, et en temps réel d’efficacité de drogue sur des tranches organotypic de tissu de tumeur. Le système de culture de tranche de tissu fournit des avantages distincts au-dessus des méthodes in vitro cellulaires traditionnelles en capturant l’hétérogénéité de cellules et les caractéristiques physiologiques du microenvironnement indigène de tumeur. Cette plate-forme permet également un débit plus élevé pour les tests d’efficacité des médicaments,...

Les interactions des cellules cancéreuses avec les propriétés physiques et biochimiques du tissu stromal environnant forment le TME. TME peut stimuler la croissance de tumeur, la métastase, et moduler la réponse de tumeur à la thérapie1. Dans le développement de médicaments précliniques conventionnels, les candidats médicamenteux sont généralement d’abord examinés à l’aide de lignées de cellules cancéreuses cultivées, une plate-forme d’essai qui manque de façon critique le TME2. Ce manque de TME physiologique dans les stades de présélection à base de cellules peut limiter la découverte d’agents efficaces dans les modèles animaux porteurs de tumeurs et peut contribuer au taux élevé d’attrition de nombreux médicaments prometteurs en oncologie dans les derniers stades cliniques de développement3.
Malgré l’importance du TME dans la modulation des réponses de médicaments tumoraux, les contraintes expérimentales limitent l’application de systèmes plus physiologiquement pertinents pendant les premiers stades de la découverte et du développement de médicaments. Il n’est pas pratique de dépister des centaines d’agents thérapeutiques sur les tumeurs à partir de modèles animaux ou de spécimens de tumeurs patientes. En effet, les spécimens chirurgicaux sont des ressources limitées avec des antécédents génétiques variés et le dépistage de milliers de molécules candidates dans des modèles animaux n’est pas faisable en raison de l’échelle expérimentale, le coût et le bien-être animal.
La culture de tranche de tissu de tumeur, où précisément couper, les sections minces de tumeur sont ex vivo cultivées, peuvent aborder la limitation du TME physiologique dans les essais de dépistage de drogue. Historiquement, le domaine des neurosciences a été lancé et a fait des optimisations étendues de la culture des tranches pour les tissus cérébraux4. Récemment, beaucoup d’études ont démontré la préparation des tranches de divers types de tissu de tumeur comprenant des tumeurs de lignée-dérivée de cellules, des modèles spontanés de tumeur, des xénogreffes patient-dérivées (PDX), et des tumeurs patientes primaires. La culture des tranches de tissu ex vivo intègre les avantages de la culture in vivo et in vitro5. Les tranches de tissu tumoral conservent l’architecture intacte de tissu et la composition de cellules panacées, permettant l’étude des cellules cancéreuses dans le contexte de TME.
Ce protocole introduit un système organotypic de culture de tranche de tissu de tumeur combiné avec un essai de viabilité en temps réel, fortement sensible pour évaluer des réponses de drogue. Les tests d’efficacité des médicaments sur les tranches de tissu tumoral organotypiques dans les protocoles précédemment introduits reposent sur la mesure des changements dans la viabilité cellulaire par l’incorporation fluorescente de teinture, l’immunohistochemistry (IHC), ou MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) ass6,7,8,9. Cependant, toutes ces méthodes sont des essais de point final et souffrent d’une faible sensibilité, d’un long temps de traitement, d’analyses de données complexes, d’une plage de signaux étroite et d’erreurs expérimentales élevées. Notre réactif compatible avec les cellules vivantes à base de luminescence améliore ces essais en fournissant une large gamme de signaux et une mesure instantanée (5 min) sans traitement préalable et un traitement post minimal. Ce réactif est très sensible et peut coexister dans les médias de culture cellulaire, permettant une mesure continue et temporelle de la viabilité cellulaire. Ce système d’essai s’applique au dépistage à haut débit des candidats aux médicaments sur les tranches de tissus dans le développement de médicaments précliniques.

<table><tbody><tr><td>Boîte de 10 cm</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à 24 puits</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 6 mm de diamètre</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>Pour TSC </td></tr><tr><td>moyen Belzer UW solcution d’entreposage frigorifique (solution UW)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Lames de coupe en acier inoxydable à double tranchant</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>Pour trancher la</td></tr><tr><td>doxorubicine (chlorhydrate)</td><td>Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pointe fine</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pointe fine</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>Pour TSC medium</td></tr><tr><td>HBSS sans calcium, magnésium ou rouge phénol</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, Université de l’Utah Cancer du</td><td>sein PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Pour TSC milieu</td></tr><tr><td>ITS + Prémix</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>Pour TSC</td></tr><tr><td>milieu IVIS Spectre</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Pour insert de culture cellulaire millicellulaire moyen TSC</td></tr><tr><td>, 12 mm, PTFE hydrophile, 0,4 & micro ; m</td> Insert <td></td> de culture <td>cellulaire Millipore</td> PICM01250 <td></td></tr><tr><td>Millicell, 30 mm, PTFE hydrophile, 0,4 & micro ; m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>Pour TSC medium</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Adhésif tissulaire</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>Colle</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140163</td><td>Pour TSC medium</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT Cell Viabilité Test</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Souris Recombinante EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>Pour TSC medium</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Industrial Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Pour enlever les tissus collés</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>Pour TSC medium</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW13115E</td><td>Pour TSC medium</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à</td> dents <td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Pointe large</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Pointe fine</td></tr><tr><td>Milieu William’s E, sans glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td>Pour milieu TSC</td></tr></tbody></table>

mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Les tissus tumoraux sont composés de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires infiltrées, de cellules endothéliales, de fibroblastes et de matrice extracellulaire. Ce milieu complexe constitue le microenvironnement de tumeur (TME) et peut moduler la réponse à la thérapie in vivo ou réponse de drogue ex vivo. Des écrans conventionnels de découverte de médicaments contre le cancer sont effectués sur des cellules cultivées dans un monolayer, un système qui manque cruellement de l’influence du TME. Ainsi, les systèmes expérimentaux qui intègrent des essais sensibles et à haut débit avec le TME physiologique renforceront le processus préclinique de découverte de médicaments. Here, we introduce ex vivo tumor tissue slice culture as a platform for medium-high-throughput drug screening. La culture organotypic de tranche de tissu constitue précisément-coupée, les sections minces de tumeur qui sont maintenues avec le soutien d’une membrane poreuse dans une interface liquide-air. Dans ce protocole, nous décrivons la préparation et l’entretien des tranches de tissu préparées à partir des tumeurs et des tumeurs de souris des modèles de xénogreffe patient-dérivés (PDX). Pour évaluer les changements dans la viabilité des tissus en réponse au traitement médicamenteux, nous avons mis à profit un essai biocompatible de viabilité à base de luminescence qui permet une mesure en temps réel, rapide et sensible des cellules viables dans le tissu. À l’aide de cette plate-forme, nous avons évalué les réponses dose-dépendantes des tranches de tissu à l’inhibiteur multi-kinase, staurosporine, et agent cytotoxique, doxorubicine. En outre, nous démontrons l’application des tranches de tissu pour la pharmacologie ex vivo en criblage 17 drogues cliniques et précliniques sur des tranches de tissu préparées à partir d’une tumeur simple de PDX. Notre plate-forme de dépistage ex vivo physiologiquement pertinente, hautement sensible et robuste renforcera considérablement la découverte et la prise de décisions en onclinical en oncologie.

Ici, nous démontrons un temps-cours, protocole d’évaluation d’efficacité de drogue multiple pour des tranches de tissu de tumeur préparées à partir des tissus de tumeur de sein de souris 4T1 et un modèle de PDX de cancer du sein, HCI01012. Nous avons réussi à préparer des tranches de tissu de plusieurs tumeurs dérivées de souris, PDX, et les tumeurs patientes fraîches10. Le flux de travail global de la préparation du tissu tumoral et le test d’efficacité de drogue est décri...

Nous introduisons un protocole pour mesurer la réponse de drogue en temps réel dans les tranches organotypic de tissu de tumeur. La stratégie expérimentale décrite ici fournit une plate-forme pour effectuer des écrans de drogue à débit moyen-élevé sur des tranches de tissu dérivées des tumeurs cliniques ou de souris dans des conditions ex vivo.

Mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Notre protocole est compatible avec d’autres méthodes d’analyse moléculaire et permet d’évaluer comment les médicaments affectent la viabilité des tranches de tissu en tact et la performance du criblage à débit moyen. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons mesurer la viabilité d’une tranche de tissu entier en temps réel avec très peu de pré-ou post-traitement. Cette technique accélère le développement de médicaments précliniques et l’oncologie en testant les candidats médicaments ou les tranches de tissus acquises directement à partir d’échantillons de tissus tumoraux patients.Notre méthode d’évaluation de la viabilité des tissus en temps réel est très polyvalente et peut être appliquée aux études de biologie du cancer, de neurosciences et de biologie du développement. La préparation de tranches de tissu viables en tact est la clé du succès de la procédure. Les réglages vibratomes en composition moyenne doivent être ajustés en fonction du type de tissu et de la fermeté.Le jour de l’acquisition de la tranche de tissu tumoral, aliquot 250 microlitres de tissu tranchent le milieu de culture par puits dans une plaque de puits 24 et placent un insert de culture ti

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Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Source : Ciraku, L., et. al. Un modèle ex vivo de tranche de cerveau pour étudier et cibler la croissance tumorale métastatique du cancer du sein. J. vis. exp. (2021). Cette vidéo démontre l’imagerie de cellules tumorales exprimant la luciférase dans une tranche de cerveau de souris organotypique. La luciférine est ajoutée au milieu et la plaque est placée à l’intérieur de la chambre du système d’imagerie in vivo. Les paramètres de capture d’image sont ajustés et la forme et la taille de la...

Imagerie par bioluminescence pour évaluer la croissance tumorale dans une tranche de cerveau de souris organotypique

La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d'invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses.

Système de co-culture avec un cerveau organotypique et 3D sphéroïde de cellules de carcinome

De nombreux types de tumeurs cérébrales humaines sont localisés dans des régions spécifiques du cerveau et sont difficiles à développer en culture. Ce protocole aborde le rôle du microenvironnement tumoral et étudie de nouveaux traitements médicamenteux en analysant des cellules tumorales cérébrales primaires fluorescentes se développant dans une tranche de cerveau de souris organotypique.

Une tumeur au cerveau / organotypiques Slice système de co-culture pour l&#39;étude des tumeurs Microenvironnement et ciblée Thérapies de drogue

Les modèles existants ex vivo de glioblastome (GBM) ne sont pas optimisés pour une étude physiologiquement pertinente de l'invasion de tumeur humaine. Ici, nous présentons un protocole pour la génération et la maintenance de cultures de tranches organotypiques à partir de tissu GBM humain frais. Une description de la microscopie temporelle et des techniques quantitatives d'analyse de la migration cellulaire est fournie.

Un modèle de culture de coupe organotypique du glioblastome humain pour l&#39;étude de la migration des cellules tumorales et des effets spécifiques des patients contre les médicaments anti-invasifs

Nous fournissons une méthode pour la génération, la culture et l’analyse systématique des tranches organotypique dérivées de tumeurs pulmonaires murine. Nous décrivons également comment optimiser pour l’épaisseur de la tranche et comment sélectionner des concentrations du médicament pour traiter les tranches de la tumeur.

Mise en place et l’analyse de la tumeur tranche Explants comme une condition préalable à des tests de Diagnostic

Ce protocole décrit la préparation de cultures en tranches organotypiques (OTSC). Cette technique facilite la culture ex vivo de tissus multicellulaires intacts. Les OTSC peuvent être utilisés immédiatement pour tester leur réponse respective aux médicaments dans un environnement multicellulaire.

Cultures de coupes organotypiques en tant que modèles précliniques du microenvironnement tumoral dans le cancer du pancréas primitif et les métastases

Ce protocole décrit une méthode semi-automatisée pour les criblages de médicaments organoïdes à débit moyen à élevé et un logiciel d’analyse d’images automatisé indépendant du microscope pour quantifier et visualiser les réponses multiparamétriques et mono-organoïdes aux médicaments afin de capturer l’hétérogénéité intratumorale.

Criblage multiparamétrique de médicaments organoïdes tumoraux à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes à grand champ pour l’analyse en vrac et mono-organoïde

Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients sont un système modèle sophistiqué pour la recherche fondamentale et translationnelle. Cet article sur les méthodes détaille l’utilisation de l’imagerie fluorescente multiplexée de cellules vivantes pour l’évaluation cinétique simultanée de différents phénotypes d’organoïdes.

Imagerie multiplexe de cellules vivantes pour les réponses médicamenteuses dans des modèles organoïdes de cancer dérivés de patients

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution, sans marquage et des organoïdes à l’aide de l’holotomographie à faible cohérence. Ce protocole détaille la préparation de la culture d’organoïdes, l’acquisition d’images et l’analyse d’images informatiques, permettant de visualiser en temps réel la dynamique structurelle et les réponses aux médicaments dans les organoïdes vivants.

Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

Découvrez le criblage de médicaments en temps réel sur des tranches tumorales organotypiques. Cette méthode permet d'évaluer la viabilité tissulaire avec un débit moyen-élevé pour accélérer le développement préclinique en oncologie.

Mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique

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