In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Nous avons créé un modèle individuel riche en collagène pour imiter l’environnement que les cellules éprouvent in vivo en utilisant la technique macromoléculaire d’encombrement. La peau est un environnement surpeuplé, contrairement à l’environnement liquide que nous utilisons déjà pour cultiver des cellules in vitro. Comparé au système traditionnel de culture cellulaire monocouche, ce modèle recrée l’environnement moléculaire encombré que les cellules éprouvent in vivo, particulièrement dans les tissus cicatriciels où la matrice extracellulaire abondante déplace l’eau liquide.

Outre les cicatrices hypertrophiques, cette technique d’encombrement macromoléculaire peut être utilisée pour des études où la matrice extracellulaire est abondante, comme la fibrose pulmonaire. Cultivez des fibroblastes dérivés de cicatrices et normaux selon les instructions manuscrites. Ensuite, ensemencer dans 24 plaques de puits à 50 000 cellules par puits en un millilitre de milieu.

Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Préparez l’encombrement macromoléculaire ou les médias MMC en mélangeant ficoll 70, Ficoll 400 et acide ascorbique en 10%FCS DMEM. Incubez les médias dans un bain d’eau pour disperser les fouleurs dans la solution.

Ensuite, stérilisez-le avec un filtre de 0,2 micromètre. Aspirez les médias usés des fibroblastes et remplacez-les par des supports MMC fraîchement fabriqués. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant six jours, en changeant les médias MMC tous les trois jours.

Préparez une solution Sirius Red en dissolvant 0,2 gramme de poudre Direct Red 80 en 200 millilitres d’eau déionisée distillée avec un millilitre d’acide acétique. Aspirez les supports MMC des cellules et ajoutez 300 microlitres de solution Sirius Red à chaque puits. Ensuite, retournez les cellules à l’incubateur pendant 90 minutes.

Après l’incubation, rincer délicatement la solution Sirius Red à l’eau du robinet et laisser sécher l’assiette toute la nuit. Le lendemain, extraire le Sirius Red en ajoutant 200 microlitres d’hydroxyde de sodium molaire de 0,1 molaire dans chaque puits et en secouant la plaque pendant cinq à dix minutes. Transférer 100 microlitres de la tache extraite dans une plaque transparente de 96 puits et mesurer l’absorption à 620 nanomètres avec un lecteur de micro plaque.

Lavez chaque puits avec 200 microlitres de PBS et fixez les cellules avec du méthanol à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 3%BSA aux puits et incuber la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Aspirer la solution de blocage et ajouter 200 microlitres d’anti-collagène un anticorps à chaque puits.

Incuber la plaque pendant 90 minutes. Puis aspirer l’anticorps et laver les puits trois fois avec PBS pendant cinq minutes par lavage. Ajouter 200 microlitres d’anticorps secondaires Goat Anti-Rabbit-FITC et de DAPI à chaque puits.

Couvrir la plaque de papier d’aluminium et l’incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Jetez l’anticorps secondaire et le DAPI et répétez les lavages avec PBS. Visualisez ensuite la fluorescence directement au microscope.

Après avoir lavé les cellules deux fois avec PBS, ajouter 40 microlitres de tampon de lyse dans chaque puits et gratter la couche cellulaire avec une pointe de pipette. Ensuite, transférez la protéine lysate dans des tubes de micro centrifugeuse pour mesurer la concentration en protéines. Chargez 10 microgrammes de protéines dans chaque puits d’un gel protéique Bis-Tris de 4 à 12 % et effectuez le SDS-PAGE à 200 volts pendant 30 minutes.

Une fois terminée, transférer la protéine dans une membrane de nitrocellulose en faisant fonctionner une tache occidentale à 90 volts pendant 90 minutes, en prenant soin d’éviter la formation de bulles entre le gel et la membrane. Bloquez la membrane avec 10 millilitres de tampon de blocage. Puis l’incuber avec des anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, lavez la membrane cinq fois avec 0,1 % de TBS Tween 20 pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, incuber la membrane avec un anticorps secondaire adapté à l’espèce pendant une heure à température ambiante. Répétez les lavages et visualisez la fluorescence à l’aide d’un système d’imagerie.

Après avoir purifié l’ARN total avec un kit commercial d’extraction d’ARN, mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à micro volume. Utilisez ensuite un kit de synthèse cDNA pour effectuer une synthèse de l’ADN du premier brin. Mélanger l’ADNC avec 10 microlitres de Supermix vert SYBR et transférer les échantillons dans une plaque de puits personnalisée 96 pré-enduite d’amorces oligonucléotides.

Ajustez le volume total à 20 microlitres par puits avec de l’eau et exécutez rt-PCR selon les instructions manuscrites. La densité cellulaire des fibroblastes humains hypertrophiques de peau scar-dérivés a augmenté de manière significative après culturisme avec Ficoll comparé à l’utilisation de PVP ou du contrôle. L’encombrement macromoléculaire avec Ficoll à l’occupation fractionnelle de volume de 9% a sensiblement augmenté le dépôt du collagène, y compris le collagène un, comparé à d’autres formulations.

Cela a été démontré par une analyse quantitative. Des fibroblastes dérivés de cicatrices et des fibroblastes cutals normaux cultivés dans les environnements MMC se sont révélés pour réguler l’expression des espèces d’ECM en plus du collagène. Notamment, une expression élevée des métalloprotéineases matricielles ou MMPs s’est trouvée pour s’accumuler dans les tissus hypertrophiques de cicatrice comparés aux tissus indigènes.

On l’a observé que l’expression de MMP2, neuf et 13 ont été sensiblement up-regulated dans les deux cultures cellulaires cultivées dans des conditions macromoléculaires d’encombrement. Les MMM jouent un rôle important lors de la cicatrisation des plaies et de la formation de cicatrices, régulant l’assemblage et le remodelage de l’ECM. La synthèse de l’interleukine six et du facteur vasculaire de croissance endothéliale était indétectable dans une tache occidentale.

Mais l’analyse de RT-PCR a indiqué que l’expression de l’interleukin six était sensiblement vers le haut-réglée, alors que l’expression du facteur de croissance endothélial vasculaire était down-regulated dans les fibroblastes cultivés dans des conditions de MMC. Lorsque vous essayez ce protocole, il est très important de choisir les fibroblastes cutatéaux qui ont très peu d’agents pathogènes co. Nous devons également garder à l’esprit que l’acide ascorbique est un ingrédient essentiel dans le milieu MMC.

Nous sommes particulièrement intéressés à détecter davantage le dépôt et l’alignement du collagène dans ce modèle MMC. Nous prévoyons d’utiliser des techniques microscopiques avancées pour comparer ce modèle in vitro avec des tissus cicatriciels indigènes in vivo. Nous encourageons les autres à utiliser cette technique d’entassement macromoléculaire pour améliorer l’authenticité in vitro des tissus modaux auxiliaires.

Bien sûr, l’encombrement macromoléculaire peut également être utilisé pour recalculer des modèles de maladie et de pathologie in vitro.