Production et caractérisation des macrophages humains à partir de cellules souches pluripotentes

La recherche en biologie des macrophages humains a été limitée parce qu’elle repose sur la collecte de cellules auprès des donneurs. Ce protocole montre une méthode dans laquelle nous pouvons produire des macrophages humains à partir de cellules souches pluripotentes en laboratoire. Il s’agit d’un protocole robuste qui peut être mis à l’échelle pour produire des macrophages en grande quantité pour les thérapies cellulaires ou la recherche.

Les cellules souches pluripotentes peuvent être manipulées génétiquement. Ainsi, dans ce protocole, nous pouvons générer des macrophages avec un phénotype spécifique, des étiquettes fluorescentes, et aussi des macrophages pour modéliser les états de la maladie. La démonstration visuelle de ce protocole est utile parce que l’utilisation de l’outil de passage facile ne sera pas familière à de nombreux chercheurs.

En outre, le niveau de soin nécessaire lors de la reconstitution des médias et la récolte des cellules est difficile à mettre en mots. Lorsque les cellules d’culture ont atteint 80% de confluence, remplacer le milieu de culture usé par 1,5 millilitres de milieu frais. En tenant le récipient de culture dans une main, roulez un outil de passage de cellules jetables à travers la plaque dans une direction.

Toutes les lames du rouleau doivent toucher la plaque. Maintenir une pression uniforme pendant le roulis. Répétez le roulement dans la même direction jusqu’à ce que tout le puits ait été couvert.

Faites pivoter le récipient de culture à 90 degrés et répétez le roulement. Avec une pipette stérile, utiliser des supports dans le puits pour déloger les colonies coupées. Aspirer CELLstart et remplacer les médias.

Transférer les cellules à un rapport d’un à quatre sur des puits pré-enduits préparés comme décrit dans le manuscrit. Pour commencer le processus de différenciation le jour zéro, ajouter 2,25 millilitres de la scène un média dans deux puits d’une plaque de six puits à fixation ultra faible. Ensuite, pour un puits confluent à 80 % d’iPSC dans une plaque de six puits, remplacez le média d’entretien par 1,5 millilitres de supports de première étape.

Couper les colonies à l’aide d’un nouvel outil de passage cellulaire. À l’aide d’une pipette, transférer les colonies coupées dans les deux puits de la plaque ultra-basse de six puits. Le deuxième jour, ajuster les concentrations de cytokine en ajoutant 0,5 millilitres de hESC SFM media à la plaque de six puits contenant le jour deux corps embryoïdes.

Le quatrième jour, enduire quatre puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits avec 0,1 % de gélatine. Après avoir incubé pendant au moins 10 minutes, retirer la gélatine et ajouter 2,5 millilitres de la deuxième étape des médias. Recueillir les corps embryoïdes formés dans les deux puits d’une plaque de six puits et les placer dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.

Laissez-les s’installer au fond du tube par gravité. Ensuite, aspirez soigneusement le média du tube et resuspendez les corps embryoïdes en deux millilitres de l’étape deux médias. Transférer 10 à 15 corps embryoïdes dans un puits recouvert de gélatine contenant 2,5 millilitres de médias de stade 2 et incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Pendant deux à trois semaines, changez les médias tous les trois à quatre jours. Le placage des EP est crucial. Avoir moins de 10 ou plus de 15 ER ou les avoir inégalement répartis peut conduire à de faibles rendements de macrophages.

Après deux à trois semaines, les corps embryoïdes commencent à libérer des cellules hématopoïétiques non hématopoïétiques en suspension. À l’aide d’une passoire de 40 micromètres, recueillez ces cellules dans un tube de 50 millilitres, puis reconstituez les supports. Centrifugeuse la suspension des cellules hématopoïétiques à 200 fois g pendant trois minutes.

Resuspendez les cellules hématopoïétiques dans les médias de stade trois. Ensuite, plaquez les cellules à une densité de 0,2 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Changez la scène trois médias tous les cinq jours.

Après neuf à 11 jours, les macrophages seront entièrement différenciés et entièrement fonctionnels. Ajouter huit fois 10 aux quatrièmes macrophages dérivés de l’iPSC en 200 microlitres de la phase trois des médias à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 100 microlitres de solution perlée à chaque puits contenant des macrophages dérivés de l’iPSC.

Utilisez un système d’imagerie à haute teneur pour l’image de la plaque. Acquérir trois champs ou plus dans chaque puits pour obtenir une bonne représentation. Les colonies d’iPSC, les corps embryoïdes, les cellules de suspension hématopoïétiques et les macrophages matures étaient morphologiquement distincts.

Les macrophages iPSC-dérivés étaient grands, ont eu de petits noyaux ovales simples et ont eu le cytoplasme abondant contenant beaucoup de vésicules. Le phénotype de macrophage a été évalué par cytométrie de flux. Les macrophages mûrs iPSC-dérivés ont exprimé le marqueur de lignée CD45 et le marqueur de maturation de macrophage 25F9 et étaient négatifs pour le marqueur immature de macrophage de monocyte CD93.

Les macrophages iPSC-dérivés ont exprimé plusieurs marqueurs myéloïdes de lignée et étaient positifs pour le marqueur immunisé de modulation CD86. Une petite proportion des macrophages ont exprimé des récepteurs de chimiokine CX3CR1, CCR2, CCR5, et CCR8. La capacité phagocytique d’iPSC-DM a été évaluée utilisant des bioparticules et un système d’imagerie à haute teneur.

Les bioparticules étaient nonfluorescentes lorsqu’elles étaient ajoutées aux cultures macrophages, mais après la phagocytose fluorées vert vif dans le pH acide intracellulaire. La fraction phagocytique représente la proportion de macrophages que les bioparticules phagocytosed et l’indice phagocytique est la mesure du nombre de bioparticules que chaque macrophage ingéré. Les macrophages peuvent changer le phénotype en réponse aux indices environnementaux.

RT-PCR a été utilisé pour quantifier l’expression upregulated de l’ARNm des gènes. Les macrophages traités par LPS et interféron gamma ou IL4 ont montré un pourcentage significativement inférieur de cellules phagocytiques par rapport aux macrophages naïfs. Les macrophages traités avec IL10 ont montré un pourcentage accru de cellules phagocytiques et un index phagocytique accru.

Ce protocole pourrait être utilisé pour fournir une source disponible sur le marché de cellules pour traiter des maladies telles que les maladies hépatiques chroniques où les macrophages se sont montrés thérapeutiques dans les modèles animaux. Les macrophages dérivés de l’iPSC peuvent être utilisés pour étudier les macrophages associés à plusieurs états de la maladie. Par exemple, nous utilisons ces cellules pour étudier les macrophages associés aux tumeurs dans le cancer du sein.

Nous avons modifié le phénotype des macrophages dérivés de l’iPSC par programmation génétique à l’aide d’un seul facteur de transcription appelé KLF1. Avec cela, nous avons produit des macrophages qui ressemblent à des macrophages de l’île érythroïde et ils ont fourni un aperçu de la production et la maturation des globules rouges.