Name: Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez la double électroporation in utero pour étudier les interactions neuronales lors de la corticogenèse chez la souris embryonnaire. Cette méthode permet de visualiser les populations cellulaires ciblées spatialement et temporellement.

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Les auteurs remercient Cristina Andrés Carbonell et les membres de l’établissement de soins aux animaux de l’Universidad de Valencia pour leur assistance technique. Nous tenons également à remercier Isabel Fariñas et Sacramento R. Ferrón pour les réactifs et le partage de leur équipement avec nous. I.M.W est financé par un contrat de Garantie Juvenil de la Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D est financé par le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz est titulaire d’une subvention De Ramón y Cajal (RYC-2015-19058) du Ministerio de Ciencia espagnol, Innovación y Universidades (MICINN). Ces travaux ont été financés RYC-2015-19058 et SAF2017-82880-R (MICINN).

La procédure décrite ci-après a été approuvée par le comité d’éthique chargé de l’expérimentation, le bien-être animal de l’Universidad de Valencia et de la Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica du Comunidad Valenciana, et adhère aux directives du Conseil international pour les sciences animales de laboratoire (ICLAS) examinées dans le Real Decreto 53/2013 de la législation espagnole ainsi que dans la directive 2010/63/EU du Parlement européen et du Conseil.
REMARQUE : Ce protocole comporte deux objectifs différents : 1) la première étude, appelée « stratégie A », permet l’analyse des interactions entre les cellules Cajal-Retzius (cellules CR) et les neurones de projection corticale nés tôt dans le même hémisphère cérébral; 2) la deuxième étude, la « tratégie », est réalisée afin d’examiner l’innervation des neurones de projection callosal de la couche supérieure du côté contralatéral du néocortex.
1. Préparation de préchirurgie
<ol><li>Préparation de l’ADN<ol>
<li>Transformez chimiquement ou électrocompétent les cellules E. coli DH5α avec les plasmides d’intérêt, plaquez-les sur des plaques d’agar LB avec l’antibiotique approprié et incuber toute la nuit à 37 °C. REMARQUE : Tous les plasmides utilisés ici contiennent le promoteur général du poulet β-actine (CAG) qui est à l’origine de l’expression d’une protéine fluorescente-reporter (CAG-mCherry et CAG-EGFP pour la stratégie A et CAG-BFP et CAG-nEGFP-2A-mtDTomato pour la stratégie B). Tous contiennent une résistance à l’ampicilline (AMP).</li>
		<li>Choisissez des colonies individuelles de chaque transformation du plasmide et initiez une culture liquide de démarrage dans 2 mL de bouillon de Luria + ampicilline (LB+AMP) dans des tubes de culture bactérienne pendant 3−4 h à 37 °C avec secousse vigoureuse (200 tr/min). Après, définissez une plus grande culture bactérienne dans une fiole Erlenmeyer de 500 ml, ajoutant 200 ml de LB+AMP et 1 ml de la culture de démarrage. Incuber toute la nuit à 37 °C dans le shaker orbital à 200 tr/min.</li>
		<li>Utilisez un kit maxi-prep sans endotoxine(Table des matériaux)suivant les instructions du fabricant pour obtenir de l’ADN plasmide pur et concentré des cultures liquides. Resuspender l’ADN dans ~50−100 μL de tampon Tris-EDTA (TE) sans endotoxines pour obtenir des concentrations d’au moins 5 μg/μL.</li>
		<li>Pour chaque chirurgie, préparez une solution avec un volume final de 10 μL contenant 1 μL de colorant vert rapide, une solution d’ADN plasmide d’intérêt pour une concentration finale de 1 μg/μL pour chaque plasmide et un tampon TE sans endotoxine. Par exemple, mélanger 1 μL de colorant vert rapide, 2 μL d’une solution d’ADN plasmide de 5 μg/μL et 7 μL de tampon TE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipette tirant<ol>
<li>Tirer les capillaires en verre borosilicate (1/0,58 mm de diamètre extérieur/intérieur) dans un puller vertical de micropipette jusqu’à ce que la pointe atteigne une longueur de 1−1,5 cm et la couper à l’aide de forceps disséquants à un angle d’environ 30° sous une portée de dissection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuration de la salle de chirurgie<ol>
<li>Mettez tout l’équipement sur la table d’opération (c.-à-d. pinces, ciseaux, forceps, micropipettes, aiguille et porte-aiguille). Allumez le coussin chauffant et couvrez-le d’un tampon absorbant chirurgical stérile. Assurez-vous que le réservoir de la machine pour l’anesthésie par inhalation est rempli d’isoflurane, le réservoir d’oxygène contient suffisamment d’oxygène, et le système fonctionne correctement. REMARQUE : La salle de chirurgie et le matériau résistant doivent être maintenus aussi stériles que possible (c.-à-d. que tout le matériel doit être autoclavé avant la chirurgie et les surfaces doivent être aseptisées avec 70 % d’éthanol). Les électrodes de platine doivent être soigneusement désinfectées d’abord avec du savon germicidal et deuxième avec 70% d’éthanol avant la chirurgie.</li>
		<li>Préparer 100 mL de 0,9% (w/v) solution saline stérile contenant de la pénicilline-streptomycine 1:100 et remplir une boîte de Pétri de 10 cm. Placez la plaque sur le dessus du tampon chauffé pour réchauffer la solution.</li>
		<li>Remplir une seringue de 1 mL avec 150 μL d’une solution analgésique (p. ex., 0,1 mg/kg de buprénorphine).</li>
		<li>Chargez la pipette tirée avec 5 μL de la solution finale d’ADN plasmide préparée à l’étape 1.1.4. Connectez le capillaire à un tube d’aspiration à commande de bouche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Première chirurgie d’électroporation in utero
<ol><li>Placez une souris enceinte E11.5 (stratégie A) ou E13.5 (stratégie B) C57BL/6 à l’intérieur d’une chambre d’induction fermée avec 2,5% (v/v) isoflurane à 0,8 L/min et attendez qu’elle soit anesthésiée. Transférer la souris sur le coussin chauffant et mettre son nez dans un masque pour la livraison constante de l’isoflurane. Vérifiez l’absence d’un réflexe de pédale comme indicateur d’une bonne anesthésie. REMARQUE : L’âgemorryonique est déterminé en fonction du jour où le bouchon vaginal est observé (E0.5).</li>
	<li>Injectez la femelle enceinte avec la solution analgésique (0,1 mg/kg de buprénorphine) sous-cutanée. Pour éviter que les yeux ne sèchent pendant la procédure, appliquez une goutte d’onguent oculaire dans chaque œil à l’aide d’un coton-tige.</li>
	<li>Raser la zone abdominale de la souris avec un rasoir électrique et la laver 2x avec 70% (v/v) lingettes à l’éthanol, une fois avec des lingettes à l’iode, et une dernière fois avec un lingettes à éthanol.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux pour faire une incision de 30 mm de long à travers la peau dans le côté droit de l’animal et soigneusement séparer la peau adjacente du muscle avec une spatule émoussée. Ensuite, faire une deuxième incision dans la paroi abdominale.</li>
	<li>Couvrez l’abdomen d’un morceau de papier de soie plié préalablement désinfecté avec 70% d’éthanol contenant une fente de 40 mm de long en son centre. Tirez soigneusement l’utérus hors de la cavité abdominale avec des forceps d’anneau. REMARQUE : L’utérus doit être maintenu humide avec la solution saline chaude préparée à l’étape 1.3.2 pendant toute la procédure.</li>
	<li>Précharger les pipettes tirées avec la solution d’ADN préparée à l’étape 1.1.4. Injectez ~0,5 μL de la solution d’ADN par embryon dans le ventricule latéral de l’hémisphère sélectionné à l’aide du tube d’aspiration commandé par la bouche jusqu’à ce que le colorant vert rapide soit perceptible à l’intérieur du ventricule.</li>
	<li>Placez des électrodes de platine de type forceps par la suite autour de la tête de l’embryon injecté (comme le montre la figure 1A et la figure 2A). Orienter les électrodes pour cibler la région du cerveau désirée. Dirigez le pôle positif vers la paroi médiale pour électroporer l’ourlet cortical (stratégie A) ou vers le cortex latéral (stratégie B) pour étiqueter les cellules générées dans cette zone. REMARQUE : Dans tous les cas, le cœur et le placenta doivent être évités pour assurer la survie embryonnaire.</li>
	<li>Appliquer la séquence spécifique des impulsions électriques à l’aide d’un électroporateur à ondes carrées suivant les indications indiquées au tableau 1 (stratégie A E11.5 embryons : quatre impulsions de 25 V et 40 ms, séparées par intervalles de 950 ms; embryons de la stratégie B E13.5 : cinq impulsions de 35 V et 60 ms, avec des intervalles de 950 ms).</li>
	<li>Placez soigneusement l’utérus de nouveau dans la cavité abdominale avec des forceps, remplissez-le avec la solution saline chaude, et fermez la paroi abdominale avec une suture d’aiguille 6-0. Joignez les deux côtés de l’incision initiale faite dans la peau à l’aide d’une aiguille 6-0 suture ou des clips de suture.</li>
	<li>Maintenez l’animal sur le coussin chauffant et surveillez-le jusqu’à sa récupération de l’anesthésie. Fournir une dose supplémentaire d’analgésie (150 μL)   dans une solution hydrogel placée dans sa cage domestique.</li>
	<li>24 heures après la chirurgie, administrer une dose supplémentaire d’analgésie (150 μL). Continuer la surveillance quotidienne par inspection visuelle pour la douleur et la détresse possibles. Observez le comportement de l’animal, testez ses réflexes normaux de membre postérieur, et inspectez la suture pour les signes possibles de dommages dus au léchage ou au grattage de la blessure.</li>
</ol>3. Deuxième électroporation in utero
<ol><li>Deux jours après la chirurgie initiale, répétez les étapes 2.1−2.3. Bien que le rétablissement des femelles enceintes après la chirurgie soit très bon, vérifiez qu’elles montrent un comportement normal et ne présentent aucun signe de douleur ou de détresse avant d’effectuer la deuxième chirurgie (embryons E13.5 pour la stratégie A et E15.5 pour la stratégie B).</li>
	<li>Faire une incision de 30 mm de long à travers la peau comme à l’étape 2.4 et une deuxième incision à la paroi abdominale, cette fois dans le côté gauche de l’animal. Exposer soigneusement l’utérus sur un tissu désinfecté tel que décrit à l’étape 2.5. REMARQUE : Veillez à ne pas interférer avec l’incision précédemment faite de l’autre côté.</li>
	<li>Injecter environ 0,5 μL par embryon de la solution d’ADN dans le ventricule latéral du cerveau de l’hémisphère précédemment électroporated dans le cas de la stratégie A et dans le ventricule latéral du cerveau de l’hémisphère contralatéral pour la stratégie B. REMARQUE : N’utilisez que des embryons présentant un développement normal et aucun signe de réabsorption.</li>
	<li>Placez les électrodes autour de la tête de l’embryon telle que décrite à l’étape 2.7, diriger l’électrode positive vers le cortex latéral et appliquer les impulsions appropriées suivant les indications indiquées au tableau 1 (stratégie A E13.5 embryons: cinq impulsions de 35 V et 60 ms séparées par intervalles de 950 ms; stratégie B E15.5 embryons: cinq impulsions de 50 V et 80 ms séparés par des intervalles de 950 ms).</li>
	<li>Continuer et terminer la chirurgie telle que décrite aux étapes 2.8−2.10.</li>
</ol>4. Récolte et sectionnage des tissus
<ol><li>Stratégie A<ol>
<li>Quatre jours après la deuxième électroporation (E17.5), effectuer la dislocation cervicale de la femelle enceinte et le placer dans une position de supination.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux, faire une incision ventrale pour extraire les cornes utérines et avec des forceps les placer dans une boîte de Pétri remplie de 1x de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) placée sur la glace. REMARQUE : La basse température rend possible l’anesthésie des embryons.</li>
		<li>À l’aide de pinces à épiler, extraire les embryons du sac amniotique et les transférer avec des forceps dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS sous une portée de dissection. Tenez soigneusement la tête des embryons à l’aide de forceps et conduisez la dissection du cerveau avec une pince à épiler pour enlever d’abord la peau sur la tête, puis le crâne. Utilisez une spatule pour extraire les cerveaux exposés.</li>
		<li>Recueillir les cerveaux avec une cuillère et les déposer dans une plaque de 48 puits remplie de la solution fixative (4% [w/v] paraformaldéhyde [PFA] en 1x PBS). Testez immédiatement pour le résultat réussi des deux électroporations en examinant les cerveaux à l’aide d’un microscope d’épifluorescence inversé, par exemple.</li>
		<li>Fixer le cerveau embryonnaire pendant la nuit à 4 °C dans un shaker orbital. Laver avec 1x PBS pour éliminer les traces de PFA. Ensuite, transférez-les à PBS avec des conservateurs antifongiques (1x PBS-0,05% (w/v) d’azide de sodium). ATTENTION : La PFA et l’azide de sodium sont des composés cytotoxiques qui nécessitent des précautions particulières pendant leur utilisation.</li>
		<li>Incorporer les cerveaux fixés dans 4% (w/v) agarose point de fusion faible dans 1x PBS et attendre ~ 10 min jusqu’à ce qu’il se solidifie. Collez-les au porte-tissu vibratoire à l’aide de colle de cyanoacrylate avec les ampoules olfactives orientées vers le haut pour obtenir des sections coronales.</li>
		<li>Initiez le vibratome et sélectionnez les paramètres souhaités : 100 μm de largeur, 0,60 μm/s de vitesse et 0,60 mm d’amplitude.</li>
		<li>Fixez le cerveau à l’intérieur du récipient vibratoire, remplissez-le de solution PBS 1x et commencez à recueillir des sections de série coronales à l’aide d’une brosse dans une plaque de puits de 48 remplie d’azide de sodium 1x PBS-0,05 % (w/v) pour avoir une représentation complète du cerveau (p. ex., environ sept sections par puits et six puits par embryon).</li>
		<li>Montez les sections désirées dans des lames de verre au microscope à l’aide d’une brosse fine. Couvrez-les de couvercles en verre. Pour le stockage à long terme ajouter milieu de montage, ce qui empêche le photobleaching et la photooxydation. Observez les lames sous un microscope à épifluorescence verticale pour évaluer l’efficacité de l’électroporation.</li>
	</ol></li>
	<li>Stratégie B<ol>
<li>Laissez naître les chiots précédemment électroporés à e13.5 et E15.5 et attendez jusqu’à P15 pour effectuer la perfusion transcardique à l’aide de la même solution fixative utilisée à l’étape 4.1.4.</li>
		<li>Juste avant la perfusion, intraperitoneally administrer une dose de 75/1 mg/kg de kétamine/médetomidine. Lorsque le réflexe de pédale est perdu, fixer la souris en position supinée et faire une incision ventrale suivant la ligne médiane à l’aide de ciseaux pour exposer à la fois la cage thoracique et le diaphragme.</li>
		<li>Couper le diaphragme et ouvrir la cage thoracique pour accéder au cœur. Tenez la cage thoracique à l’aide d’un hémostat et faites une incision dans l’atrium droit avec de beaux ciseaux.</li>
		<li>Pénétrer dans le ventricule gauche à l’aide d’une aiguille reliée à un tube flexible à une pompe de perfusion péristaltique. Démarrer la perfusion transcardique, en livrant au moins 25 mL de 4% PFA à un flux constant de 5,5 mL/min (temps total ~5 min).</li>
		<li>Disséquer le cerveau des animaux perfusés. Tout d’abord, retirer la peau sur la tête avec des ciseaux et des forceps. Commencez à couper le crâne à l’aide de ciseaux et retirez soigneusement des sections des os du crâne jusqu’à ce qu’ils soient complètement enlevés. Enfin, extraire le cerveau à l’aide d’une spatule.</li>
		<li>Transférer les cerveaux dans une plaque de 24 puits et les fixer avec 4% PFA pendant la nuit à 4 °C sur un shaker orbital. Arrêter la fixation en remplaçant pfa par 0,05% (w/v) d’azide de sodium dans pbs. REMARQUE : Comme indiqué à l’étape 4.1.5, il est conseillé d’effectuer un lavage intermédiaire avec 1x PBS.</li>
		<li>Répétez les étapes 4.1.6−4.1.9, en changeant les paramètres vibratoires pour les cerveaux postnatals (largeur 40 μm, vitesse de 1,20 μm/s et 0,5 mm d’amplitude). REMARQUE : L’immunohistochimie ou l’immunofluorescence peut être effectuée pour détecter des marqueurs cellulaires spécifiques ou améliorer le signal des protéines fluorescentes utilisées dans l’électroporation.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imagerie et analyse de fluorescence confocale
<ol><li>Allumez le microscope confocal, placez les lames de microscope contenant les sections cérébrales montées sur le support de diapositives de microscope et sélectionnez les canaux où les images de fluorescence seront prises (c.-à-d. 420−460 nm pour BFP, 490−540 nm pour GFP et 570−620 nm pour mCherry et tdTomato).</li>
	<li>Effectuer le balayage d’échantillon pour obtenir des images de carte de chaque section de cerveau à deux longueurs d’onde différentes pour une vue générale de la sortie d’électroporation double. Une fois terminé, sélectionnez l’objectif 10x et le mode d’observation multi-area-Z-stack-timelapse. Cela permettra de programmer l’acquisition automatique d’images de fluorescence à différentes localisations XYZ dans les sections du cerveau.</li>
	<li>Dans chacune des régions choisies (XY), définissez des paramètres d’imagerie appropriés (c.-à-d. l’intensité laser, la sensibilité photomultiplicateur et une résolution minimale de 1 024 x 1 024), ainsi que la profondeur de la numérisation (Z) selon les plans de l’échantillon où la fluorescence est visible.</li>
	<li>Obtenez des images de grossissement (10x) de toutes les régions choisies et exportez-les du format OIF au format TIFF à l’aide du logiciel de visionneuse de microscopes.</li>
	<li>Modifier l’objectif 60x, répéter l’étape 5.3 et capturer des images de grossissement élevé pour observer les interactions cellule-cellule d’une manière plus détaillée. Exportez-les comme indiqué à l’étape 5.4.</li>
	<li>Ouvrez les images acquises avec n’importe quel logiciel d’imagerie (p. ex., Fidji) pour une analyse plus approfondie.</li>
</ol>

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<li>Takiguchi-Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Reelin-Positive+Marginal+Zone+Cells+from+the+Caudomedial+Wall+of+Telencephalic+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).</li>
<li>Berry, M., Rogers, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+neuroblasts+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).</li>
<li>Alcántara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+patterns+of+reelin+mRNA+expression+in+the+forebrain+of+the+developing+and+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.</a> Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).</li>
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<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+specification%2C+and+diversity+of+callosal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li>
<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li>
<li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li>
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<li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+brain%2C+the+human+nature+of+cortical+circuits%2C+and+intellectual+creativity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).</li>
<li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics+identifies+cell+type%E2%80%93specific+molecular+changes+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’étude des interactions cellule-cellule in vivo dans les régions à forte densité cellulaire comme le cortex cérébral est une tâche complexe. Les approches traditionnelles, y compris l’utilisation d’anticorps pour étiqueter les neurites, ne conviennent pas en raison de l’absence de marqueurs spécifiques pour différentes populations cellulaires. L’utilisation de modèles murins transgéniques, où un type de cellule particulier exprime une protéine fluorescente, est utile pour visualiser les processus neuronaux, mais cela dé...

Le cortex cérébral est une structure très complexe et complexement organisée. Pour atteindre un tel degré d’organisation, les neurones de projection cortical passent par des processus développementaux complexes qui nécessitent leur génération temporelle, la migration vers leur destination finale dans la plaque corticale, et l’établissement de connexions à courte et à longue portée1,2. Pendant longtemps, la façon classique d’étudier la corticogenèse a été basée sur l’utilisation de modèles de knock-out ou de knock-in murine de gènes d’intérêt. Toutefois, cette stratégie, et en particulier l’utilisation de souris knock-out conditionnelles, prend beaucoup de temps et coûte cher, et présente parfois des problèmes supplémentaires concernant l’existence de la redondance génétique ou l’absence de conducteurs spécifiques CRE, entre autres questions. Une des approches qui ont surgi pour essayer de résoudre ces problèmes et qui est aujourd’hui largement utilisé pour étudier le développement cortical est in utero électroporation3,4. L’électroporation in utero est une technique utilisée pour la transgenèse somatique, permettant le ciblage in vivo des cellules souches neuronales et de leur progéniture. Cette méthode peut être utilisée pour étiqueter les cellules par l’expression des protéines fluorescentes5,6, pour la manipulation des gènes in vivo (c.-à-d. gain ou perte d’essais de fonction)7,8,9, pour isoler les cortices électroporated dans vitro et les cellules de culture8,10. En outre, l’électroporation in utero permet le contrôle temporel et régional de la zone ciblée. Cette technique a de nombreuses applications et a été largement utilisé pour étudier la migration neuronale, la division des cellules souches, la connectivité neuronale, et d’autres sujets8,9,11,12.
Le manuscrit actuel décrit l’utilisation d’une variante d’électroporation in utero, appelée double électroporation in utero, pour analyser les interactions des cellules dans le cortex cérébral avec différentes origines temporelles et spatiales. Ces études sont extrêmement complexes à compléter lorsque vous utilisez des modèles murins parce qu’ils nécessitent l’utilisation combinée de plusieurs lignes transgéniques. Certaines des applications du protocole décrites dans cet article comprennent l’étude des interactions étroites entre les cellules voisines, ainsi que les interactions entre les cellules éloignées par le biais de projections à long terme. La méthode exige l’exécution de deux chirurgies d’électroporation in utero indépendantes, séparées temporellement et spatialement, sur les mêmes embryons pour cibler différentes populations cellulaires d’intérêt. L’avantage de cette approche est la possibilité de manipuler la fonction génique dans un ou les deux types de neurones à l’aide d’animaux de type sauvage. En outre, ces expériences fonctionnelles peuvent être combinées avec l’expression de protéines fluorescentes cytoplasmiques ou membranaires pour visualiser la morphologie fine des cellules ciblées, y compris les dendrites et les axones, et analyser les différences possibles dans les interactions cellulaires par rapport à un contrôle (c.-à-d. les cellules étiquetées uniquement avec la protéine fluorescente).
Le protocole délimité ici est axé sur l’étude des interactions cellulaires à l’intérieur du néocortex, mais cette stratégie pourrait également être utilisée pour examiner les interactions avec les zones extracorticales qui peuvent être ciblées à l’aide d’électroporation in utero, comme le subpallium ou le thalamus13,14, ou les interactions cellule-cellule dans d’autres structures, comme le cervelet15. Le ciblage de différentes zones est basé sur l’orientation des électrodes et sur le ventricule où l’ADN est injecté (latéral, troisième ou quatrième). Avec la stratégie décrite ici, nous pouvons étiqueter un nombre important de cellules, ce qui est utile pour évaluer les changements généraux dans la connectivité / innervation dans les expériences fonctionnelles. Néanmoins, pour étudier les changements fins dans la connectivité, on peut utiliser des versions modifiées de l’électroporation in utero pour obtenir l’étiquetage clairsemé et identifier les cellules simples16. En résumé, l’électroporation in utero est une méthode polyvalente qui permet de cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement et d’étudier leurs interactions en détail, soit dans des conditions de contrôle, soit combinées à des expériences fonctionnelles, réduisant considérablement les coûts temporels et économiques.

<table><tbody><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’aspirateur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Baby-mixter hémostat (perfusion)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilicaté</td><td>WPI</td><td>1B100-6</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine (BUPREX 0,3 mg/ml)</td><td>Rb Pharmaceuticals Limited</td><td></td><td></td>921425</tr><tr><td>plasmide CAG-BFP</td><td>Aimablement fourni par U.M&uuml ; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide CAG-EGFP</td><td>Aimablement fourni par U.M&uuml ; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mPlasmide de cerise</td><td>Aimablement fourni par U.M&uuml ; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide CAG-mtdTomato-2A-nGFP</td><td>Aimablement fourni par U.M&uuml ; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Cotons-tiges</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>B. Braun Portée chirurgicale</td><td>1050044</td><td></td></tr><tr><td>de dissection</td><td>Zeiss</td><td>stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir électrique</td><td>Oster</td><td>76998</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TE sans endotoxines</td><td>QIAGEN</td><td>1018499</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes à l’éthanol</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux</td><td>Alcon</td><td>682542.6</td><td></td></tr><tr><td>Colorant vert rapide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils scientifiques fins (FST)</td><td>14069-09</td><td></td></tr><tr><td>LED de fluorescence</td><td>CoolLED</td><td>pE-300-W</td><td></td></tr><tr><td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td><td>Roche</td><td>3143422001</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostats (suture)</td><td>Outils scientifiques fins (FST)</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Coussin</td> <td>chauffantUFESA</td><td>AL5514</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes iodées</td><td>Vaporisateur Lorsoul</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Flow-Meter</td><td>A15B5001</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Karizoo</td><td>586259</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (Anastemine)</td><td>Fatro Ib&eacute ; rica SL</td><td>583889-2</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes de précision Kimtech</td><td>Kimberly-Clark</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Agar GEN</td><td>Labkem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) bouillon GEN</td><td>Labkem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Médétomidine (Sedator)</td><td>Dechra</td><td>573749.2</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de microscope</td><td>Menel-Gl&auml ; ser</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Labbox</td><td>SLIB-F10-050</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Mutiwell (24)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32024</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Mutiwell (48)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (pour solution saline)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 25 G (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur orbital S150</td><td>Stuart Scientific</td><td>5133</td><td></td></tr><tr><td>P Selecta Incubateur</td><td>J. P. Selecta, s.a.</td><td></td><td></td>0485472</tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion péristaltique</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler Platinum, 5 mm de diamètre</td><td>Btx</td><td>45-0489</td><td></td></tr><tr><td>Système de fermeture cutanée reflex - Clips de 7 mm, boîte de 100</td><td>AgnThos</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Système de fermeture cutanée réflexe - Clip Applyer, 7mm</td><td>AgnThos</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pince à anneau</td><td>Outils de science fine (FST)</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>122712-1608</td><td></td></tr><tr><td>Tampon absorbant chirurgical (steryle)</td><td>Suture chirurgicale HK Surgical</td><td>-M</td><td></td></tr><tr><td>(Surgicryl PGA 6-0)</td><td>SMI Suture Matériaux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BYD11071512 Seringue 1ml (BD plastipak)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>303172 Plat de</td><td></td></tr><tr><td>culture tissulaire 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette vertical</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscope vertical</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

L’électroporation in utero est une technique de transfert d’ADN in vivo largement utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la corticogenèse des mammifères. Cette procédure tire parti des ventricules cérébraux pour permettre l’introduction de l’ADN d’intérêt et utilise une paire d’électrodes pour diriger l’entrée du matériel génétique dans les cellules qui tapissent le ventricule, les cellules souches neuronales. Cette méthode permet aux chercheurs d’étiqueter les cellules désirées et/ou de manipuler l’expression de gènes d’intérêt pour ces cellules. Il a plusieurs applications, y compris des tests ciblant la migration neuronale, le traçage des lignées et le pathfinding axonal. Une caractéristique importante de cette méthode est son contrôle temporel et régional, permettant le contournement des problèmes potentiels liés à la létalité embryonnaire ou à l’absence de souris conducteur cre spécifiques. Un autre aspect pertinent de cette technique est qu’elle contribue à réduire considérablement les limites économiques et temporelles qui impliquent la génération de nouvelles lignées de souris, qui deviennent particulièrement importantes dans l’étude des interactions entre les types de cellules qui proviennent de zones éloignées du cerveau à différents âges de développement. Nous décrivons ici une stratégie de double électroporation qui permet de cibler les populations cellulaires qui sont séparées spatialement et temporellement. Grâce à cette approche, nous pouvons étiqueter différents sous-types de cellules à différents endroits avec des protéines fluorescentes sélectionnées pour les visualiser, et/ou nous pouvons manipuler les gènes d’intérêt exprimés par ces différentes cellules au moment opportun. Cette stratégie améliore le potentiel de l’électroporation in utero et fournit un outil puissant pour étudier le comportement des populations cellulaires séparées temporellement et spatialement qui migrent pour établir des contacts étroits, ainsi que des interactions à long terme par le biais de projections axonales, réduisant les coûts temporels et économiques.

Les interactions entre les cellules voisines sont nées dans des endroits distal et à des moments différents : cellules Cajal-Retzius (cellules CR) et neurones de projection corticale en migration précoce (stratégie A)
L’interaction des cellules CR et des neurones de projection corticale précoce a été précédemment décrite comme nécessaire pour réguler la translocation somale par l’intermédiaire de molécules d’adhérence de la néctine et de la cadhérine à l’aide d’une double stra...

L’électroporation double in utero permet de cibler les populations cellulaires qui sont séparées spatialement et temporellement. Cette technique est utile pour visualiser les interactions entre ces populations cellulaires à l’aide de protéines fluorescentes dans des conditions normales, mais aussi après des expériences fonctionnelles pour perturber les gènes d’intérêt.

Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

Double électroporation in utero est une méthode puissante pour étudier les aspects importants de la corticogenèse des mammifères tels que l’interaction entre les cellules des neurones, généré à différents endroits et âges de développement. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’examiner les interactions non perturbées entre ces différentes populations cellulaires d’une manière rapide, détaillée et peu coûteuse. Une implication frappante de notre méthode est qu’elle facilite une meilleure compréhension de la façon dont notre câblage est modifié dans les troubles neuronaux comme l’autisme et la schizophrénie.Cette étude n’est pas limitée au néocortex, mais elle peut également être utilisée pour analyser les interactions cellule à cellule, dans les zones exocortico comme le sépale ou le cervelet. L’une des étapes les plus difficiles est l’injection d’ADN dans les ventricules latéraux des embryons précoces. L’utilisation d’une source de lumière vive est essentielle pour réussir les injections.Pour chaque chirurgie d’abord préparer une solution de 10 microlitres contenant un microlitre de colorant vert rapide, un microgramme par microlitre solution d’ADN plasmide d’i

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En injection intraventriculaire Utero et l&#39;électroporation d&#39;embryons de souris E15

Électroporation in utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou in vitro des effets de l'altération génétique.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

Cette vidéo démontre l’administration de l’ADN plasmidique dans les cellules neuronales cérébelleuses d’embryons murins en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode est utile pour comprendre la fonction in vivo des gènes dans le développement normal du cerveau et les changements dans l’expression des gènes des cellules neuronales au cours de la progression tumorale.

Livraison de gènes basée sur l’électroporation in utero : une technique pour injecter de l’ADN plasmidique dans des cellules cérébelleuses embryonnaires d’embryons murins

Cette procédure montre comment cibler les interneurones dans le cerveau antérieur de souris en développement au moyen de l’électroporation in utero. Cette technique s’est avérée particulièrement efficace pour obtenir une expression génique sélective dans des sous-types d’interneurones destinés aux couches superficielles du cortex.

Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

Nous démontrons une méthode pour greffer des cellules cultivées dans des sites définis d’embryons de souris précoces afin de déterminer leur potentiel in vivo. Nous introduisons également une méthode d’électroporation optimisée qui utilise des capillaires en verre de diamètre connu, permettant l’administration précise d’ADN exogène dans quelques cellules des embryons.

Méthodes de transfert localisé précisément de cellules ou de l&#39;ADN dans des embryons de souris après l&#39;implantation précoce

Ce protocole décrit en détail comment transfecter spécifiquement différentes régions du système nerveux central C57BL/6 via électroporation in utero. Ce protocole comprend des instructions détaillées pour les transfections de régions qui se développent dans le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le noyau septal latéral et le striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

Présenté ici est un protocole pour effectuer la manipulation génétique dans le cerveau de furet embryonnaire en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode permet de cibler les cellules progénitrices neuronales dans le néocortex in vivo.

In Vivo Ciblage des cellules progénitrices neuronales dans le néocortex de Ferret par In Utero Electroporation

Découvrez la double électroporation in utero pour étudier les interactions neuronales lors de la corticogenèse chez la souris embryonnaire. Cette méthode permet de visualiser les populations cellulaires ciblées spatialement et temporellement.

Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

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