Name: Un modèle modifié de régulation de la rénine dans la sténose de l’artère rénale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez le modèle 2K1C chez la souris pour induire une sténose de l'artère rénale et étudier l'expression de la rénine. Cette méthode chirurgicale fiable permet d'explorer les mécanismes moléculaires de l'hypertension rénale vasculaire et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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La recherche a été financée par la subvention de développement des chercheurs scientifiques de l’IBLNH (1K01HL135461-01) à JAG. Merci à David Carmona-Berrio et Isabel Adarve-Rengifo pour leur assistance technique.

Les souris ont été hébergées et soignées à la division des soins aux animaux du Vanderbilt University Medical Center (VUMC) conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du ministère américain de la Santé et des Services sociaux. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la VUMC avant le début des expériences.
1. Préparation et dissection des animaux
<ol><li>Allumez le germinateur et la pompe à eau du coussin chauffant environ 30 minutes avant de commencer la chirurgie.</li>
	<li>Couper un tube en polyuréthane de 0,5 mm de longueur avec un scalpel tranchant. Enlevez 0,2 mm de la circonférence en faisant une coupe dans le sens de la longueur pour faire un brassard. REMARQUE: Il s’agit d’une partie essentielle de la procédure de sténose de l’artère rénale qui nécessite une précision extrême, une attention aux détails et de la patience. Essayez de couper plusieurs morceaux de tubes en polyuréthane à la fois. Effectuez toute cette procédure au microscope.</li>
	<li>Avant d’aller plus loin, mettez des gants chirurgicaux stériles et un masque chirurgical.</li>
	<li>Utilisez des souris C57BL/6 de type sauvage (WT) de 6 à 8 semaines. Utilisez un nombre égal de souris mâles et femelles pour éviter tout biais sexuel.</li>
	<li>Notez le poids des souris avant d’effectuer une intervention chirurgicale. Le poids idéal pour effectuer une sténose de l’artère rénale avec un tube de polyuréthane est de 18 à 22 g. Manipulez doucement les souris et ne pas agiter pendant l’injection de l’anesthésie. Administrer une analgésie préopératoire (Ketofgen, 5 mg/kg de corps). REMARQUE: Lors du transfert des souris de leur salle de logement à la salle d’opération, transportez-les avec beaucoup de douceur et de soin pour éviter l’agitation. Il est fortement recommandé de transporter des cages à souris dans les mains au lieu d’un chariot.</li>
	<li>Anesthésier les souris avec un mélange de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel) par injections intrapéritonéales (I.P.).</li>
	<li>Replacez la souris à l’intérieur de la cage jusqu’à ce qu’elle soit complètement anesthésiée. Il faut environ 4-5 minutes avant que la souris soit complètement inconsciente. Pincez la queue ou l’orteil avec une pince pour vérifier si la souris est complètement inconsciente et prête pour la chirurgie.</li>
	<li>Posez la souris sur le dos sur une serviette en papier. Enlevez les poils de l’abdomen latéral à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique en suivant la direction opposée de la croissance des cheveux. Après avoir rasé le site chirurgical, nettoyez la zone avec un gommage chirurgical contenant de l’iode (ou de la chlorhexidine) suivi d’un rinçage avec de l’éthanol à 70% (ou une solution saline stérile).  Répétez 3 fois. REMARQUE: La procédure d’épilation doit être effectuée à une certaine distance ou de préférence sur un banc différent du banc de procédure chirurgicale pour éviter toute interférence et contamination des poils pendant la procédure chirurgicale.</li>
	<li>Couvrir le coussin chauffant avec une feuille stérile. Amenez la souris sur le banc chirurgical et placez-la sur la feuille stérile, face au côté latéral droit de la souris vers le microscope. Maintenir une température constante du tampon de 37 °C avec de l’eau en circulation.</li>
	<li>Ouvrez le sac stérilisé contenant tout le matériel chirurgical. À l’aide d’un microscope à dissection et de ciseaux stériles, faites une petite incision du flanc (près de la 13ecôte thoracique , la dernière côte chez la souris) et à environ 0,5 cm des vertèbres. Continuez le long des vertèbres lombaires et faites une incision de 1 pouce.</li>
	<li>Tirez vers l’arrière la peau et les muscles pour exposer le rein.</li>
	<li>Nettoyez et retirez la graisse environnante à l’aide de coton-tiges stériles pour isoler l’artère rénale. Isolez le nerf rénal de l’artère rénale à l’aide d’une pince incurvée.</li>
	<li>Lors de la réalisation de la chirurgie simulée, appliquez des sutures pour fermer la peau et appliquez un antibiotique sur la plaie fermée, puis passez aux soins postopératoires. Sinon, procédez à la section suivante pour sténose de l’artère. NOTE: Chaque expérience devrait avoir des animaux fictifs comme contrôles de l’intervention chirurgicale. Les animaux fictifs sont constitués de souris qui ont subi la procédure chirurgicale consistant à exposer l’artère rénale sans y placer de brassard.</li>
</ol>2. Sténose de l’artère rénale droite
<ol><li>Placez deux sutures en nylon sous l’artère rénale droite, faites des nœuds lâches, puis placez le brassard autour de l’artère rénale principale à peu près égale entre la bifurcation rénale et aorte.</li>
	<li>Fermez le brassard à l’aide des sutures en nylon. Faites quatre nœuds pour chaque suture afin d’éviter la probabilité de perdre les sutures après la chirurgie.</li>
	<li>Fermez l’incision dans le muscle en appliquant une simple suture continue.</li>
	<li>Faites de simples sutures interrompues pour fermer la peau.</li>
	<li>Administrer des analgésiques approuvés par l’IACUC. REMARQUE: Outils chirurgicaux en autoclave avant chaque utilisation. Si plus d’une intervention chirurgicale est effectuée à la fois, essuyez tous les outils utilisés avec une jauge d’alcool stérile et placez-les dans un germinateur chaud pendant 15 à 30 s après chaque chirurgie. Changez également de gants stériles pour chaque souris.</li>
</ol>3. Soins postopératoires
<ol><li>Remettez les souris dans leur cage et laissez la cage à moitié allumée, à moitié éteinte, un coussin chauffant d’eau circulant pendant 2 à 3 heures. Ajouter de la nourriture de récupération de régime gel à l’intérieur de la cage.</li>
	<li>Administrer l’analgésique (kétoprofène) par voie intrapéritonéale (dose : 5 mg/kg p.c.) le lendemain.</li>
	<li>Pesez les souris pendant les deux prochains jours; si certaines souris perdent plus de 20% de leur poids, consultez le vétérinaire et décidez si l’animal doit être euthanasié en suivant la procédure appropriée autorisée par l’IACUC.</li>
	<li>Surveillez les souris quotidiennement pour évaluer la rougeur, l’enflure, la douleur ou l’infection.</li>
	<li>Consulter un vétérinaire pour les complications postopératoires conformément aux politiques institutionnelles de l’IACUC.</li>
</ol>4. Prélèvement de tissus
<ol><li>Prélever du tissu 3 semaines après l’intervention chirurgicale. Notez le poids de chaque souris.</li>
	<li>Euthanasier la souris avec une procédure approuvée par l’IACUC.</li>
	<li>Placez la souris sur une plate-forme stérile en décubitus dorsal pour la disséquer.</li>
	<li>Fixez et étendez les membres pour limiter les mouvements.</li>
	<li>Pulvérisez soigneusement les souris avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Faites une incision médiane pour ouvrir l’abdomen et la poitrine à l’aide de ciseaux tranchants.</li>
	<li>Retirez la peau et la paroi péritonéale.</li>
	<li>Exposez soigneusement le cœur et percez le ventricule droit et exsanguinez la souris.</li>
	<li>Retirez les deux reins à l’aide d’une pince. Les reins sont situés sur le dos des souris. REMARQUE: Ne mélangez pas les deux reins. Soyez conscient des reins sténosés, simulés et controlatéraux.</li>
	<li>Retirez la capsule rénale, nettoyez-les de toute graisse et notez le poids de chaque rein séparément.</li>
	<li>Couper une coupe longitudinale des deux reins et fixer dans 4% PFA pendant une nuit à 4 ° C pour être ensuite traité pour l’incorporation de paraffine, pour effectuer l’hybridation in situ (ISH) et l’immunohistochimie (IHC). Suivez les protocoles ISH et IHC comme indiqué23,24.</li>
	<li>Isoler le cortex du rein restant et congeler dans de l’azote liquide pour effectuer un transfert Western. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à l’analyse.</li>
	<li>Quantifier les expressions de rénine et de N-GAL avec Western blot comme décrit dans la littérature23,24.</li>
</ol>5. Statistiques
<ol><li>Utiliser une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle pour les expériences avec trois conditions ou plus, suivies de tests post-hoc de Bonferroni pour les comparaisons entre les groupes individuels. Considérons une valeur de p égale ou inférieure à 0,05 significative. Utilisez un logiciel (par exemple, GraphPad Prism 8.2) pour effectuer toutes les analyses statistiques.</li>
</ol>

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<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+signaling+pathways+activated+in+a+murine+model+of+two-kidney%2C+one-clip+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of signaling pathways activated in a murine model of two-kidney, one-clip hypertension.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (4), 1055-1068 (2009).</li>
<li>Wiesel, P., Mazzolai, L., Nussberger, J., Pedrazzini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-kidney%2C+one+clip+and+one-kidney%2C+one+clip+hypertension+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Two-kidney, one clip and one-kidney, one clip hypertension in mice.</a> Hypertension. 29 (4), 1025-1030 (1997).</li>
<li>Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+experimental+hypertension+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Models of experimental hypertension in mice.</a> Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts, financier ou autre, n’est déclaré par les auteurs.

La sténose de l’artère rénale est une cause importante d’hypertension secondaire ou résistante et de lésions rénales 1,29. Le modèle Goldblatt à deux reins (2K1C) a été utilisé pour étudier l’hypertension rénovasculaire induite par RASténose 1,17,18,19. Un certain nombre d’études antérieures utilisant divers modèles animaux ont montré q...

La sténose de l’artère rénale (RASténose) est un problème intraitable qui touche environ 6 % des personnes de plus de 65 ans et jusqu’à 40 % des personnes atteintes d’une maladie coronarienne ou vasculaire périphérique 1,2. Les traitements actuels de la maladie sont limités; par conséquent, il existe un besoin critique de développer de nouvelles thérapies pour traiter l’hypertension rénovasculaire ou l’hypertension résistante induite par la RASténose. Le système rénine-angiotensine aldostérone (SRAA) est la voie clé impliquée dans la pathogenèse de l’hypertension induite par RASténose ou de l’hypertension rénovasculaire 3,4. Les thérapies connues ciblant le SRAA, comme les inhibiteurs de l’ECA ou les antagonistes des récepteurs de l’angiotensine, soulagent l’hypertension, mais nécessitent un examen approfondi de l’insuffisance rénale et de l’hyperkaliémie 5,6,7. La rénine catalyse l’étape de limitation du taux dans le SRAA; il convertit l’angiotensinogène en angiotensine I. Dans l’athérosclérose, la formation de plaque provoque le rétrécissement de l’artère rénale qui entraîne la sécrétion de rénine, entraînant une hypertension rénovasculaire et des lésions rénales8. Un certain nombre d’études ont rapporté des niveaux accrus de stress oxydatif pendant l’hypertension rénovasculaire chez l’homme, qui ont été corroborés avec le modèle de souris à deux reins à un clip (2K1C) ainsi qu’avec d’autres modèles animaux hypertendus 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . Le mécanisme moléculaire du contrôle de l’expression de la rénine au cours de l’hypertension rénovasculaire induite par RASténose n’est pas bien compris et justifie des recherches plus approfondies.
Les modèles animaux expérimentaux qui récapitulent de manière fiable et reproductible RASténose sont importants pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires du contrôle de l’expression de la rénine pour le développement de nouvelles thérapies. Le modèle murin 2K1C est un modèle expérimental bien établi pour étudier la pathogenèse de l’hypertension rénovasculaire17,18,19,20. Ce modèle est généré par la constriction de l’artère rénale à l’aide d’un clip 17,20,21, produisant ainsi une occlusion de l’artère rénale qui entraîne une augmentation de l’expression de la rénine et de l’hypertension 17,19,20,21. Cependant, il n’y a pas de rapports techniques disponibles, qui décrivent une procédure étape par étape pour générer une sténose de l’artère rénale dans des modèles animaux.
Des clips conventionnels en argent en forme de U, des tubes en polyuréthane et d’autres clips ont été utilisés pour resserrer l’artère rénale afin d’induire une sténose de l’artère rénale. Certaines études ont montré que la conception et le matériau du clip sont essentiels pour obtenir des données fiables et reproductibles avec le modèle animal 2K1C. Selon Lorenz et al., l’utilisation de clips en argent conventionnels conçus en U induit un faible taux de réussite de l’hypertension (40-60%)21. En raison de la conception du clip, l’artère rénale est pressée latéralement, déclenchant quelques constrictions et une plus grande probabilité d’être délogée de l’artère rénale. La malléabilité et la ductilité de l’argent peuvent permettre des changements dans la largeur des clips; par conséquent, provoquant différents niveaux d’hypertension chez les souris. Les dioxydes d’argent sur le clip peuvent provoquer une inflammation périvasculaire, une prolifération intimale et une granulation des tissus, modifiant le diamètre de l’artère rénale22. En raison de la variabilité des niveaux d’hypertension obtenus avec le clip en argent conventionnel de conception U, Warner et al. et Lorenz et al. ont utilisé avec succès un tube en polyuréthane de conception plus ronde pour initier la sténose de l’artère rénale chez la souris, générant une induction plus fiable et cohérente du modèle animal à deux reins à un clip20,21.
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole chirurgical pour générer une RASténose expérimentale chez la souris, en utilisant le tube en polyuréthane pour resserrer l’artère rénale. Le brassard rond en polyuréthane est un clip plus reproductible, fiable et peu coûteux pour générer une sténose chez la souris. L’objectif de ce modèle expérimental est d’étudier et de définir le mécanisme moléculaire et cellulaire du contrôle de l’expression de la rénine au cours de la sténose de l’artère rénale. Nous avons confirmé le succès du modèle de souris RASténose en mesurant l’expression de la rénine et le marqueur de lésion rénale neutrophile gélatinase-associated lipocalin (N-GAL).

<table><tbody><tr><td>Diet Gel</td><td>Clear H2O</td><td>Diet-Gel 76A</td><td>Régime de récupération chirurgicale</td></tr><tr><td>EMC Heated Hard pad</td><td>Hallowell</td><td>000A2788B</td><td>Les coussins chauffants ont été utilisés pour garder les souris au chaud</td></tr><tr><td>Ethilon Nylon Suture</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>4-0 (1,5 métrique), Cette suture a été utilisée pour fermer le péritoine et la peau</td></tr><tr><td>Ethilon Suture en nylon</td><td>Ethicon</td><td>2815 G</td><td>8-0 (0,4 métrique), Cette suture a été utilisée pour fermer le brassard afin d’attacher et de resserrer l’artère</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>GER 5287</td><td>Stériliser les outils chirurgicaux entre les chirurgies</td></tr><tr><td>Kétoprofène</td><td>Zoetis</td><td>Ketofen</td><td>Analgésique</td></tr><tr><td>Polyuréthane</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>MRE-025</td><td>Ce tube a été utilisé pour initier la sténose</td></tr><tr><td>Povidone-iode antiseptique écouvillons</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td>Il a été appliqué après l’épilation et la chirurgie de la peau</td></tr><tr><td>Reflex 7 Clip Applier</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>204-1000</td><td>Cet applicateur de clip a été utilisé pour appliquer un clip au cas où une ou plusieurs sutures se détacheraient</td></tr><tr><td>Draps de serviette</td><td>stériles Dynarex</td><td>4410</td><td>Il a été utilisé comme drap de lit pour les souris pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>Pommade antibiotique triple</td><td>Medi-First</td><td>22312</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à eau</td><td>Stryker</td><td>T/pump Professionnels</td><td>Utilisé pour réchauffer et faire circuler l’eau dans le coussin dur chauffant pour garder les souris au chaud pendant et après la chirurgie</td></tr></tbody></table>

un modèle modifié de régulation de la rénine dans la sténose de l’artère rénale

A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis

La sténose de l’artère rénale est une affection fréquente chez les patients atteints d’une maladie coronarienne ou vasculaire périphérique où le système rénine-angiotensine aldostérone (RAAS) est suractivé. Dans ce contexte, il y a un rétrécissement des artères rénales qui stimule une augmentation de l’expression et de la libération de rénine, la protéase limitant le taux dans le SRAA. L’augmentation de l’expression de la rénine qui en résulte est un facteur connu d’hypertension rénovasculaire, fréquemment associée à des lésions rénales et à des lésions des organes terminaux. Ainsi, il y a un grand intérêt à développer de nouveaux traitements pour cette condition. Le mécanisme moléculaire et cellulaire du contrôle de la rénine dans la sténose de l’artère rénale n’est pas entièrement compris et justifie des recherches plus approfondies. Pour induire une sténose de l’artère rénale chez la souris, un modèle murin Goldblatt modifié à 2 reins 1 clip (2K1C) a été développé. Le rein droit a été sténosé chez des souris de type sauvage et des souris opérées de manière simulée ont été utilisées comme témoin. Après une sténose de l’artère rénale, nous avons déterminé l’expression de la rénine et les lésions rénales. Des reins ont été récoltés et des cortex frais ont été utilisés pour déterminer l’expression des protéines et de l’ARNm de la rénine. Ce modèle animal est reproductible et peut être utilisé pour étudier les réponses physiopathologiques, les voies moléculaires et cellulaires impliquées dans l’hypertension rénovasculaire et les lésions rénales.

La constriction de l’artère rénale augmente l’expression de la rénine dans le rein sténosé tout en réprimant l’expression dans le rein controlatéral. Le modèle de sténose à deux reins (2K1C) ou Goldblatt induit une augmentation de l’expression de la rénine et des lésions rénales. Ceci est reconnu comme le meilleur modèle représentatif de sténose unilatérale de l’artère rénale chez l’homme.
L’expression de la rénine et de la prorénine (précurseur de la rénine) a été mesurée par immunobuvardage....

Un modèle murin Goldblatt modifié à 2 reins 1 clip (2K1C) a été développé en utilisant des tubes en polyuréthane pour initier une sténose de l’artère rénale, induisant une augmentation de l’expression de la rénine et des lésions rénales. Ici, nous décrivons une procédure détaillée de préparation et de placement du brassard sur l’artère rénale pour générer un modèle murin 2K1C reproductible et cohérent.

Un modèle modifié de régulation de la rénine dans la sténose de l’artère rénale

Renal artery stenosis is a common condition in patients with coronary or peripheral vascular disease where the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) ...

Le modèle murin 2K1C est une méthode fiable et reproductible pour induire une sténose de l’artère rénale. Ce protocole est précieux pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de l’expression de la rénine au cours de l’hypertension vasculaire rénale. Ce modèle animal imite la sténose unilatérale de l’artère rénale chez l’homme.La fiabilité et la reproductibilité en font un bon modèle pour discerner de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l’hypertension vasculaire rénale. Cette technique nécessite des connaissances de base pour effectuer une intervention chirurgicale chez la souris. Il y a deux parties critiques : la préparation de la tubulure et la mise en place de la tubulure dans l’artère rénale.Les deux sont décrits en détail. La constriction de l’artère rénale droite à l’aide d’un tube coupé avec précision est essentielle. Cette vidéo de la procédure montrera aux apprenants comment couper le tube, puis accéder et resserrer l’artère.Commencez par couper le tube pour la procédure de sténose. Coupez un morceau de tube en polyuréthane de 0,5 millimètre de long avec un scalpel bien aiguisé. Ensuite, faites un brassard en enlevant 0,2 millimètre de la circonférence avec une coupe dans le sens de la longueur.Enregistrez le poids des souris, qui doit être compris entre 18 et 22 grammes, pour effectuer la sténose de l’artère rénale avec le tube en polyuréthane. Le poids des souris est essentiel pour effectuer la chirurgie. Après avoir anesthésié et administré l’analgésique à la souris, remettez-la à l’intérieur de la cage jusqu’à ce qu’elle soit complètement inconsciente.Pincez l’orteil avec une pince pour vérifier si la souris est complètement anesthésiée et prête pour la chirurgie. Posez la souris sur le dos sur une serviette en papier à l’écart de la zone de chirurgie et retirez les poils de l’abdomen latéral avec une tondeuse à cheveux électrique en suivant la direction opposée de la croissance des cheveux. Nettoyez la zone rasée avec un tampon de gaze d’alcool stérile et appliquez une solution topique de povidone iodée.Ouvrez le sac stérilisé contenant tout le matériel chirurgical. En travaillant sous le microscope de dissection, utilisez des ciseaux tranchants stériles pour faire une petite incision de flanc à environ 0,5 centimètre des vertèbres. Procédez le long des vertèbres lombaires et faites une incision d’un pouce.Tirez la peau et les muscles vers l’arrière pour exposer les reins. Ensuite, nettoyez et retirez la graisse environnante avec des cotons-tiges pour isoler l’artère rénale. Isolez le nerf rénal de l’artère rénale à l’aide de la pince incurvée.Nettoyez le liquide écoulé près de l’artère rénale avec un coton-tige. Placez deux sutures en nylon sous l’artère rénale droite, faites des nœuds lâches et placez le brassard autour de l’artère rénale principale, à peu près à égale distance entre le rein et la bifurcation de l’aorte. Fermez le brassard à l’aide des sutures en nylon, en faisant trois nœuds pour chaque suture afin d’éviter la probabilité de perdre les sutures après la chirurgie.Fermez l’incision dans le muscle en appliquant une simple suture continue et faites des sutures simples interrompues pour fermer la peau. Remettez les souris dans leur cage et laissez la demi-cage sur un coussin chauffant d’eau en circulation pendant deux à trois heures pour que les animaux se remettent de la chirurgie. Fournissez aux animaux de la nourriture de récupération au régime en gel.Le lendemain, administrez un analgésique. Pesez les souris pendant les deux prochains jours et consultez le vétérinaire si une souris perd plus de 20 % de son poids. Inspectez les souris tous les jours pour évaluer la présence de rougeur, d’enflure, de douleur ou d’infection.Enregistrez le poids de chaque souris. Après avoir euthanasié l’animal, placez-le sur une plate-forme stérile en position couchée. Fixez et étendez les membres pour limiter les mouvements et vaporisez soigneusement la souris avec de l’éthanol à 70 %.Utilisez des ciseaux pour faire une incision médiane et ouvrir la région de l’abdomen et de la poitrine. Tirez la peau et la paroi du péritoine, puis exposez soigneusement le cœur et perforez le ventricule droit. Retirez les deux reins à l’aide d’une pince, en gardant une trace du rein qui a été sténosé.Retirez les capsules rénales, nettoyez-les de toute graisse et notez le poids de chaque rein séparément. Coupez une section longitudinale des deux reins et fixez-les dans 4 % de PFA pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour l’hybridation in situ et l’immunohistochimie. Isolez le cortex du rein restant et congelez-le dans de l’azote liquide pour effectuer un Western blot.Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’analyse soit plus approfondie. La constriction de l’artère rénale augmente l’expression de la rénine dans le rein sténosé, tout en réprimant l’expression dans le rein controlatéral. Le modèle de sténose à deux reins et à un clip a induit l’expression de la rénine et augmenté les lésions rénales.L’expression de la rénine et de la prorénine a été mesurée par immunoblot. Les données montrent que l’expression de la rénine et de la prorénine a augmenté dans le rein sténosé par rapport aux reins controlatéraux et factices, ce qui suggère que le brassard rétrécissait l’artère rénale et provoquait des changements dans la perfusion rénale. Une immunohistochimie a été réalisée pour visualiser la localisation de l’expression de la rénine.Les images ont confirmé une expression accrue de la rénine dans le rein coupé. De plus, le recrutement de cellules juxtaglomérulaires le long de l’artère afférente a été observé dans le rein sténosé. Pour étudier l’effet sur les niveaux d’expression de l’ARNm de la rénine, une hybridation in situ a été réalisée.Les données suggèrent une augmentation du recrutement de l’ARNm de la rénine et des cellules JG dans le rein sténosé. Une autre caractéristique de la sténose de l’artère rénale est la régulation à la hausse des marqueurs de lésions rénales en raison de changements dans la perfusion rénale, la production de superoxyde et l’hypertension. Par conséquent, le N-GAL a été mesuré par immunoblotting, montrant que le marqueur de l’insuffisance rénale aiguë était fortement régulé à la hausse dans le rein sténosé.Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de placer les sutures en nylon autour de l’artère rénale avant de placer le brassard. Cela permet d’accélérer la procédure.

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