Name: Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Apprenez à optimiser le séquençage d'échantillons d'ARN FFPE dégradés. Cette méthode améliore la qualité et la quantité des données d'expression génique pour la recherche en biologie et en neurosciences.

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Nous remercions la Dre Danielle Carrick (Division de la lutte contre le cancer et des sciences de la population, Institut national du cancer) d’avoir continué à aider, en particulier pour le lancement de cette étude, pour nous fournir les échantillons et pour des suggestions utiles au cours de l’analyse des données. Nous remercions sincèrement tous les membres de l’installation de séquençage du CCR au Laboratoire national de recherche sur le cancer de Frederick pour leur aide pendant la préparation et le séquençage de l’échantillon, en particulier Brenda Ho pour l’aide dans l’échantillon QC, Oksana Allemand pour la bibliothèque QC, Tatyana Smirnova pour la gestion des séquenceurs. Nous tenons également à remercier Tsai-wei Shen et Ashley Walton de Sequencing Facility Bioinformatics Group d’avoir aidé à l’analyse des données et à la mise en œuvre du pipeline RNA-seq. Nous remercions également le CCBR et le NCBR pour leur aide à l’élaboration du pipeline d’analyse RNaseq et de l’élaboration des meilleures pratiques.

<ol><li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).</li>
<li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187(2014).</li>
<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261(2007).</li>
<li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632(2017).</li>
<li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15(2017).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092(2012).</li>
<li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEER+cancer+registry+biospecimen+research%3A+yesterday+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050(2019).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li>
<li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA+quality%2C+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh%2C+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351(2018).</li>
<li>Babraham Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Babraham Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46(2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Broad Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2019).</li>
<li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSeQC%3A+quality+control+of+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292(2018).</li>
<li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).</li>
<li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+set+enrichment+analysis%3A+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li>
<li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Ces travaux ont été financés par le National Cancer Institute (NCI), les National Institutes of Health (NIH). Leidos Biomedical Research, Inc. est l’entrepreneur en opérations et en soutien technique du Laboratoire national de recherche sur le cancer de Frederick, qui est entièrement financé par les NIH. Plusieurs auteurs (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) sont affiliés à Leidos Biomedical Research, Inc., mais tous les auteurs sont entièrement financés par l’Institut national du cancer, y compris les salaires des auteurs et le matériel de recherche. Leidos Biomedical Research, Inc. n’a pas fourni de salaire aux auteurs (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) ou du matériel pour l’étude, ni dans la conception de l’étude, la collecte de données, l’analyse, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

La méthode décrite ici décrit les principales étapes nécessaires pour obtenir de bonnes données de séquence à partir d’échantillons FFPE-ARN. Les principaux points à considérer avec cette méthode sont les suivants : (1) Assurez-vous que l’ARN est conservé le mieux possible après l’extraction en minimisant les cycles de manipulation et de congélation et de décongélation de l’échantillon. Les aliquots de QC séparés sont très utiles. (2) Utilisez une mesure QC qui est la meilleure pour l’ensemble d’échantillons donné. Les v...

L’utilisation d’approches de séquençage de nouvelle génération nous a permis de glaner une mine d’informations provenant de divers types d’échantillons. Cependant, les échantillons anciens et mal conservés restent inapplicables pour les méthodes couramment utilisées pour générer des données de séquence et nécessitent souvent des modifications à des protocoles bien établis. Les tissus FFPE représentent un tel type d’échantillon qui a été largement utilisé pour les spécimens cliniques1,2,3. Tandis que la préservation de FFPE maintient la morphologie de tissu, les acides nucléiques dans les tissus de FFPE présentent habituellement un large éventail de dommages et de dégradation, rendant difficile de récupérer l’information génomique qui peut mener aux informations importantes au sujet des mécanismes moléculaires sous-jacents à divers désordres.
Les données d’expression génique générées par le séquençage de l’ARN sont souvent déterminantes dans l’étude des mécanismes de maladie et de résistance et complètent l’analyse de mutation de l’ADN. Cependant, l’ARN est plus sensible à la dégradation, ce qui rend plus difficile de générer des données précises d’expression génique à partir de tissus FFPE. De plus, étant donné que la grande disponibilité et l’abordabilité du séquençage sont relativement récentes, les spécimens plus anciens n’étaient souvent pas entreposés dans des conditions nécessaires pour préserver l’intégrité de l’ARN. Certains des problèmes pour les échantillons ffPE comprennent la dégradation de l’ARN due à l’intégration dans la paraffine, la modification chimique de l’ARN conduisant à la fragmentation ou la réfractabilité aux processus enzymatiques nécessaires pour le séquençage, et la perte des queues poly-A, limitant l’applicabilité de l’oligo-dT comme amorce pour la transcriptase inverse4. Un autre défi est la manipulation /stockage des échantillons FFPE dans des conditions sous-optimales, ce qui peut conduire à une dégradation supplémentaire des molécules de laboratoire telles que l’ARN dans les tissus5. Ceci est particulièrement pertinent pour les échantillons plus anciens qui peuvent avoir été prélevés à un moment où l’analyse de l’expression génique par séquençage de l’ARN n’était pas prévue pour les échantillons. Tous ces éléments conduisent à une diminution de la qualité et de la quantité de l’ARN extrait disponible pour générer des données de séquence utiles. La faible probabilité de succès, combinée au coût élevé du séquençage, a dissuadé de nombreux chercheurs d’essayer de générer et d’analyser les données sur l’expression des gènes à partir d’échantillons potentiellement utiles de la FFPE. Certaines études menées ces dernières années ont démontré la facilité d’utilisation des tissus FFPE pour l’analyse de l’expression génique2,6,7,8,9, mais pour des échantillons moins nombreux et/ou plus récents.
Comme étude de faisabilité, nous avons utilisé l’ARN extrait des spécimens de tissu tumoral FFPE de trois dépôts de tissus résiduels de surveillance, d’épidémiologie et de résultats finaux (SEER) registres du cancer pour le séquençage de l’ARN et l’analyse de l’expression génique10. Achetés des laboratoires cliniques de pathologie, les tissus de FFPE des adénocarcinomes séreux ovariens de haute qualité ont été stockés de 7 à 32 ans dans des conditions variables avant l’extraction d’ARN. Parce que dans la plupart des cas, ces blocs avaient été stockés dans différents sites pendant des années sans attendre une analyse génétique sensible à l’avenir, peu de soin n’avait été pris pour préserver les acides nucléiques. Ainsi, la plupart des échantillons présentaient de l’ARN de mauvaise qualité, avec une grande proportion d’échantillons contaminés par des bactéries. Néanmoins, nous avons été en mesure d’effectuer la quantification des gènes, de mesurer l’uniformité et la continuité de la couverture génétique et d’effectuer l’analyse de corrélation Pearson entre les répliques biologiques pour mesurer la reproductibilité. Sur la base d’un ensemble de panneaux génétiques de signature clé, nous avons comparé les échantillons de notre étude avec les données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) et confirmé qu’environ 60 % des échantillons avaient des profils d’expression géniquecomparables 11. En nous basant sur la corrélation entre les divers résultats de QC et les métadonnées de l’échantillon, nous avons identifié des mesures clés de QC qui ont une bonne valeur prédictive pour identifier les échantillons qui sont plus susceptibles de générer des données de séquence utilisables11.
Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour l’évaluation de la qualité de l’ARN FFPE, la génération de bibliothèques de séquençage à partir d’échantillons d’ARN extraits, et l’analyse bioinformatique des données de séquençage.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1506</td><td></td></tr><tr><td>Kit ADN haute sensibilité Agilent</td><td></td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Kit v2-Illumina</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de préparation de bibliothèque d’ARN directionnel pour Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7765S</td><td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td></tr><tr><td>NEBNext Kit de déplétion de l’ARNr (Humain/Souris/Rat)</td><td>Nouvelle-Angleterre Biolabs</td><td>E6310L</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500 Système de séquençage</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td>NextSeq 500 Guide du système : https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td></tr><tr><td>NextSeq PhiX Control Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3002</td><td></td></tr><tr><td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td>20024907</tr><tr><td>10X Genomics Séparateur magnétique 10X</td><td>Genomics</td><td>120250</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur Multimixeur</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td> 1851197 <td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs de séquençage</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Package de cellules</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche tampon et cartouche de réactif</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium (0,2N)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0607D-6</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-151-871</td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’arn ffpe dégradés

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

L’analyse de l’expression génique par séquençage de l’ARN (ARN-seq) permet un aperçu unique des échantillons cliniques qui peuvent potentiellement mener à une compréhension mécaniste de la base de diverses maladies ainsi que des mécanismes de résistance et/ou de susceptibilité. Cependant, les tissus ffPE, qui représentent la méthode la plus commune pour préserver la morphologie des tissus dans les spécimens cliniques, ne sont pas les meilleures sources pour l’analyse de profilage d’expression génique. L’ARN obtenu à partir de tels échantillons est souvent dégradé, fragmenté et chimiquement modifié, ce qui conduit à des bibliothèques de séquençage sous-optimales. À leur tour, ceux-ci génèrent des données de séquence de mauvaise qualité qui peuvent ne pas être fiables pour l’analyse de l’expression des gènes et la découverte de la mutation. Afin de tirer le meilleur parti des échantillons de la FFPE et d’obtenir les meilleures données possibles à partir d’échantillons de mauvaise qualité, il est important de prendre certaines précautions tout en planifiant la conception expérimentale, en préparant les bibliothèques de séquençage et lors de l’analyse des données. Cela comprend l’utilisation de mesures appropriées pour un contrôle précis de la qualité de l’échantillon (QC), l’identification des meilleures méthodes pour diverses étapes au cours de la génération de bibliothèque de séquençage, et la bibliothèque soigneuse QC. En outre, l’application d’outils logiciels et de paramètres corrects pour l’analyse des données de séquence est essentielle afin d’identifier les artefacts dans les données ARN-seq, filtrer la contamination et les lectures de faible qualité, évaluer l’uniformité de la couverture génétique et mesurer la reproductibilité des profils d’expression génique parmi les répliques biologiques. Ces étapes peuvent assurer une grande précision et une reproductibilité pour le profilage d’échantillons d’ARN très hétérogènes. Ici, nous décrivons les différentes étapes pour l’échantillon QC, la préparation de bibliothèque et QC, le séquençage, et l’analyse de données qui peuvent aider à augmenter la quantité de données utiles obtenues à partir de l’ARN de mauvaise qualité, comme celui obtenu à partir de tissus FFPE-ARN.

La méthodologie décrite ci-dessus a été appliquée à 67 échantillons de FFPE qui avaient été stockés dans une variété de conditions différentes pendant 7 à 32 ans (le délai médian d’entreposage de l’échantillon était de 17,5 ans). Le jeu de données et les résultats d’analyse présentés ici ont déjà été décrits et publiés dans Zhao et coll.11. En vérifiant la qualité de l’échantillon telle que décrite précédemment (c.-à-d. des traces par exemple dans la figure 2),le DV<s...

Cette méthode décrit les étapes pour améliorer la qualité et la quantité de données de séquence qui peuvent être obtenues à partir d’échantillons d’ARN formalin-fixes paraffin-embedded (FFPE). Nous décrivons la méthodologie pour évaluer plus précisément la qualité des échantillons FFPE-ARN, préparer des bibliothèques de séquençage et analyser les données des échantillons FFPE-ARN.

Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Notre protocole peut être utilisé pour améliorer la qualité et la quantité des données d’expression génétique générées à partir d’échantillons d’ARN dérivés du FFPE, en particulier dans des échantillons de qualité sous-optimale. Cette technique évalue la qualité de l’ARN dans les échantillons de tissus FFPE et permet d’optimiser leur traitement en aval afin d’améliorer la quantité et la qualité des données de séquençage de l’échantillon. Cette méthode permet la caractérisation complète d’une transcription dans l’échantillon biologique et clinique et peut fournir un aperçu des éléments fonctionnels du génome dans le développement et la maladie.La dégradation ffpe-ARN et la sélection des méthodes pour l’échantillon QC, la préparation de la bibliothèque, et l’analyse des données peuvent tous être très difficiles. Soyez méticuleux lorsque vous choisissez les bonnes méthodes et les contrôles appropriés. La démonstration visuelle permet aux spectateurs d’observer les petites modifications subtiles et les précautions nécessaires lors de la planification, de l’évaluation et du processus de séquençage, en particulier pour les échantillons de FFPE mal conservés.Pour vérifier la qualité de l’échantillon d’ARN, exécutez l’échantillon sur un système d’ARN QC selon les instructions du fabricant et utilisez le logiciel de bioanalyse approprié pour analyser la distribution des fragments d’ARN dans l’échantillon et calculer la proportion de fragments de plus de 100 et 200 nucléotides. Sur la base des mesures qc, identifier les échantillons avec moins de 40% des fragments de plus de 100 nucléotides pour permettre l’exclusion de ces échantillons du traitement. Pour le séquençage, décongeler les kits de rééquençage appropriés en fonction des paramètres de fonctionnement dans un bain d’eau à température ambiante et placer le plateau de réapprovisionnement à quatre degrés Celsius après le dégel.Placez l’emballage des cellules d’écoulement à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant que le paquet se réchauffe, ouvrez l’application Illumina Experiment Manager et sélectionnez Créer une feuille d’échantillon. Sélectionnez le séquenceur à utiliser et cliquez sur Suivant.Entrez le code à barres du kit de reagent et les autres paramètres de flux de travail appropriés. Téléchargez ensuite une feuille d’échantillon créée selon les critères de séquence Illumina. Pour préparer la bibliothèque d’échantillons et la bibliothèque de contrôle PhiX, dénominatez et diluez les bibliothèques aux concentrations appropriées et mélangez l’échantillon et les bibliothèques de contrôle PhiX pour obtenir un rapport de volume de contrôle PhiX de 5 %.Lorsque les cellules d’écoulement sont prêtes, retirez l’emballage, nettoyez la surface vitrée avec un lingette d’alcool sans peluche et séchez le verre avec un tissu de laboratoire à faible pommade. Retirez la cartouche de reagent de quatre degrés Celsius de stockage et inversez la cartouche cinq fois pour mélanger les reagents. Appuyez doucement sur la cartouche sur le banc pour réduire les bulles d’air et charger l’échantillon dénaturé et dilué dans la cartouche de reagent dans le réservoir désigné.Chargez la cellule d’écoulement, la cartouche tampon et la cartouche de réaccente sur le système. Effectuez ensuite une vérification automatisée et passez en revue la sortie pour vous assurer que les paramètres d’exécuter passent la vérification du système. Lorsque la vérification automatisée est terminée, sélectionnez commencer l’exécuter de séquençage.Pour visualiser les résultats qc pré-traitement et qc post-alignement, exécutez multi-QC pour générer un rapport agrégé en format HTML. Pour déterminer les effets des lots et évaluer la carte de qualité de l’ensemble de données donné, utilisez un script R pour exécuter une analyse des composants principaux. L’analyse de corrélation de l’échantillon peut ensuite être effectuée à l’aide de la corrélation Pearson entre les différents échantillons.L’estimation de la proportion de fragments de plus de 100 nucléotides est plus utile qu’une estimation des fragments de plus de 200 nucléotides, car elle est plus sensible pour mesurer avec précision la proportion de fragments plus petits pour les échantillons d’ARN fortement dégradés. Compte tenu du degré élevé de dégradation de l’ensemble de l’échantillon, une méthode totale de préparation de la bibliothèque d’ARN est recommandée. Par exemple, ici, les bibliothèques de séquençage préparées à partir de quatre échantillons différents sont affichées.Ici, des aperçus de la qualité brute du séquençage des fichiers FastQ et du contenu de l’adaptateur d’échantillon sont affichés. Le dépistage rapide de la QQC peut aider à détecter la contamination comme la contamination bactérienne ou de souris dans les échantillons. L’alignement star peut être utilisé pour déterminer la proportion de lues cartographiées au génome de référence, le pourcentage de lectures cartographiées de façon unique au génome de référence et la proportion de lues qui n’ont pas été cartographiées, ou qui ont été cartographiées en loci multiples.Les statistiques de la carte et du RSeQC peuvent être utilisées pour déterminer le pourcentage d’ARN messagers, de bases introniques et intergéniques présentes dans les lectures cartographiées. Pour ces analyses représentatives, certaines bibliothèques dégradées avaient un biais de trois principaux dans lequel plus de lectures ont été cartographiées plus près des trois premières que des cinq extrémités principales. En outre, l’analyse des composants principaux peut être effectuée pour déterminer le pourcentage de la variation totale capturée par les principaux composants pour les répliques biologiques de chaque échantillon.Prenez soin d’éviter la dégradation de l’échantillon, préparez des répliques et plusieurs couches pour chaque échantillon, utilisez les mesures appropriées pour évaluer la qualité de l’échantillon et utilisez la bonne méthode de préparation de la bibliothèque. En utilisant cette méthodologie, de plus grandes études ngs peuvent être réalisées avec des échantillons ffpe auparavant inutilisables avec des temps et des conditions de stockage variables pour obtenir un aperçu d’une variété d’états de la maladie différents. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier les grandes archives existantes de l’échantillon ffpe avec de riches informations cliniques et peut grandement améliorer les études sur le cancer en fonction de la population.

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