Immunomarquage de testicules de drosophiles de mont entier pour l’analyse confocale 3D de grands spermatocytes

La coloration intégrale des tissus de la drosophile, tels que les échantillons de testicules, est souvent problématique en raison de la pénétration limitée des anticorps. Notre protocole de fixation utilisant du NP40 et de l’heptane permet un marquage uniforme et reproductible. En maintenant la forme du tissu tout en permettant une pénétration profonde des anticorps, cette procédure facilite l’acquisition reproductible et quantifiable de l’immunocoloration en trois dimensions, à la fois individuellement et dans les études de colocalisation.

Pour l’évaluation des cellules germinales diploïdes, de zéro à 15 heures après l’éclosion, anesthésez les mouches par une brève exposition au dioxyde de carbone et transférez les mouches dans un coussinet anti-mouches. Placez le tampon sous un microscope de dissection à un grossissement de 10X et utilisez une pince pour retirer les têtes de cinq à 10 mouches mâles. Transférez les corps de mouches décapités dans 100 microlitres de tampon de Ringer sur une lame en verre recouvert de silicone sur un support à fond noir, et utilisez le grossissement 40X et une paire de pinces numéro cinq pour saisir une mouche entre le thorax et l’abdomen.

Ensuite, éloignez l’abdomen du thorax et isolez rapidement les testicules et les tissus adjacents de la carcasse de la mouche. Une fois que tous les testicules ont été prélevés, nettoyez les échantillons de tout tissu restant et utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour retirer l’excès de tampon autour des testicules disséqués. Placez ensuite une goutte de paraformaldéhyde à 4 % sur les testicules et transférez rapidement les tissus dans un tube contenant deux millilitres de solution de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparée, complétée par du NP40 à 20 % et de l’heptane.

Pour une fixation complète des échantillons de testicules, agitez le tube verticalement pendant 30 secondes avant d’incuber les testicules sur un mélangeur rotatif à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, transférez le tube dans un support à tubes et laissez les testicules se déposer au fond du tube. Retirez toute l’heptane et la solution fixatrice et rincez rapidement les testicules trois fois avec du PBS.

Après le dernier lavage, transférez les testicules dans un nouveau tube de 200 microlitres et utilisez une pipette de 200 microlitres équipée d’un embout de pipette de 10 microlitres pour éliminer tout excès de tampon. Ajoutez ensuite 200 microlitres de PBS-To frais dans le tube et placez les testicules sur de la glace. Pour le marquage des anticorps des échantillons de testicules, remplacer le PBS par 200 microlitres de PBS-T à 0,3 % pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.

Après la perméabilisation, bloquez toute liaison non spécifique avec 0,3 % de PBS-T plus 5 % de sérum de chèvre normal pendant une heure à température ambiante avant d’ajouter 200 microlitres de l’anticorps principal d’intérêt dilué dans 0,3 % de PBS-T plus 5 % de sérum de chèvre normal pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius ou à température ambiante avec balancement. Le lendemain matin, lavez les échantillons en trois lavages de 15 minutes avec du PBS-T frais à 0,3 % et en les balançant à température ambiante par lavage et laissez les testicules se déposer au fond du tube par gravité. Ajouter 200 microlitres d’un anticorps secondaire approprié dans le tube pour une incubation de quatre heures avec balancement à température ambiante à l’abri de la lumière avant de laver les échantillons dans du PBS-T frais à 0,3 % par lavage, comme démontré.

Après le lavage à 0,3 % PBS-T, laver les échantillons une fois avec du PBS-T à 0,2 % et une fois avec du PBS-T à 0,1 % pendant 30 minutes par lavage sur la bascule, suivie d’un dernier lavage de 30 minutes avec du PBS seul. Après le lavage PBS, étiquetez les échantillons avec 180 microlitres d’une solution DAPI d’un microgramme par millilitre dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, suivis de trois lavages de 5 minutes dans du PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une lame propre, et utilisez une pointe de pipette amorcée à 0,1 % de PBS-T pour transférer les testicules sur la lame.

Aspirez tout excès de PBS et ajoutez 100 microlitres de Citifluor AF1. Placez délicatement une lamelle en verre sur le tissu, en prenant soin d’éviter de piéger les bulles d’air, et utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle sur la lame avant d’observer les lames par microscopie à fluorescence confocale. Après avoir acquis des images confocales des échantillons, importez les images dans un logiciel d’analyse d’images approprié.

Ensuite, utilisez la segmentation manuelle pour définir le noyau à l’intérieur de chaque cellule et déterminer les coefficients de corrélation de Pearson à l’intérieur du volume entier entre deux fluorophores. Ce protocole permet l’acquisition d’images confocales d’une qualité suffisante pour être traitées pour une reconstitution 3D. Par exemple, dans ces quatre coupes en série adjacentes d’un spermatocyte de stade S5, un faible niveau de Mad1 est observé au niveau de l’enveloppe nucléaire et une accumulation de haut niveau de Mad1 peut être visualisée en conjonction avec la coloration DAPI dans le noyau.

dans cette image reconstituée en 3D, la présence de Mad1 à la surface du nucléaire et l’accumulation de Mad1 dans le noyau peuvent être observées avec l’ADN. Dans ces reconstitutions 3D, on peut observer de gros spermatocytes S5 colorés à la Nucléoporine 62 et au Mad1 ou à l’Importin-bêta et au DAPI. Dans les deux reconstructions, les composants associés aux pores nucléaires semblent être répartis de manière non uniforme sur le bord nucléaire sous forme de points de taille irrégulière.

Tout en conservant le volume 3D des cellules, ce protocole facilite également une pénétration uniforme des anticorps d’intérêt dans la profondeur de chaque cellule, permettant des analyses quantitatives, telles que la colocalisation. Parce que le protocole permet une mesure fiable des colocalisations à partir de testicules indépendants, il peut également être utilisé pour comparer la coloration dans différents génotypes de mouches. La quantité de NP40 utilisée est essentielle pour une perméabilisation suffisante.

Si la procédure est suivie de près, un marquage reproductible et une préservation de la structure nucléaire en 3D peuvent être obtenus. Bien que la coloration complète des tissus de la drosophile puisse être délicate, ce protocole peut être facilement adapté à d’autres échantillons.