Name: Test de chimiotaxis in situ pour examiner le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Apprenez le test de chimiotaxis in situ (ISCA) pour étudier le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques. Cette méthode microfluidique permet de quantifier la chimiotaxie et d'isoler des microorganismes.

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Cette recherche a été financée en partie par la Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, par le biais de la subvention GBMF3801 à J.R.S. et R.S., et un prix d’enquêteur (GBMF3783) à R.S., ainsi qu’une bourse du Conseil australien de recherche (DE160100636) à J.B.R., un prix de la Fondation Simons à B.S.L. (594111), et une subvention de la Fondation Simons (542395) à R.S. dans le cadre des Principes microbiens des écosystèmes microbiens (PriME) Collaborative.

Nous recommandons d’exécuter la section 1 avant les expériences sur le terrain afin d’optimiser les résultats.
1. Optimisation de laboratoire
REMARQUE : Les volumes décrits dans la procédure d’optimisation sont suffisants pour un seul ISCA (composé de 20 puits).
<ol><li>Préparation du produit chimique d’intérêt REMARQUE : La concentration optimale pour chaque chimioattractant doit souvent être déterminée dans des conditions de laboratoire avant les déploiements sur le terrain. Le champ de concentration chimique diminuera en magnitude avec la distance de la source (puits ISCA), ce qui signifie que la concentration ressentie par les micro-organismes dans l’environnement sera inférieure à celle présente à l’intérieur de l’appareil. La concentration optimale à utiliser dans le puits ISCA dépend du taux de diffusion du chimiotractant. Si la concentration dans le puits est trop faible (proche de la limite de détection des microbes), aucune chimiotaxis positive ne sera observée. Inversement, si la concentration dans le puits est trop élevée, la concentration sera également élevée dans l’environnement immédiat et l’accumulation microbienne se produira au-dessus des puits de l’ISCA plutôt qu’à l’intérieur. Par conséquent, la série de dilution doit être effectuée dans des conditions de laboratoire pour chaque composé afin de déterminer la concentration optimale pour les déploiements sur le terrain. Idéalement, une plage de concentration devrait également être testée sur le terrain pour confirmer les résultats de laboratoire.<ol>
<li>Préparer 2,5 L d’un milieu approprié contenant la concentration de sel appropriée (p. ex., saline tamponnée de phosphate [PBS] ou eau de mer artificielle). Filtrer le milieu à l’aide d’un filtre de 0,2 μm à l’aide d’une pompe péristaltique ou sous vide et d’une autoclave.</li>
		<li>Préparer une solution de 10 mM de chimioattractant dans 1 mL du milieu stérile. Filtrer la solution chimioattractante à l’aide d’un filtre à seringues de 0,2 μm pour éliminer les particules et les contaminants potentiels. REMARQUE : Idéalement, aucun composé organique autre que le chimiotractant ne devrait être présent dans la solution finale.</li>
	</ol></li>
	<li>Plage de concentration par série de dilution<ol>
<li>Diluer la solution de stock chimioattractant filtrée en série, allant (par exemple) de 10 mM à 100 μM. REMARQUE : Au moins un volume final de 0,7 mL est nécessaire par concentration testée.</li>
	</ol></li>
	<li>Chargement de l’ISCA<ol>
<li>Remplissez une seringue de 1 mL avec le chimioattractant filtré et connectez-la à une seringue de 27 G. Tenir l’ISCA avec le port orienté vers le haut, injecter lentement la substance jusqu’à ce qu’une petite gouttelette apparaisse sur le dessus du port. REMARQUE : 1) Chaque dilution ou substance doit être injectée avec une seringue et une aiguille séparées pour prévenir la contamination croisée. 2) Cette petite gouttelette est importante parce qu’elle garantit qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée dans le port, ce qui pourrait nuire à la capacité des microbes de migrer à travers le port. 3) Il est recommandé de remplir une rangée entière par substance ou concentration (cinq puits) afin de fournir un volume minimal adéquat pour d’autres analyses. 4) Une ligne par ISCA doit agir comme contrôle négatif et doit être remplie avec le milieu filtré dans lequel les microbes seront suspendus. Ce traitement explique l’effet de la motilité aléatoire par les microbes dans les puits de l’ISCA et devrait être utilisé pour normaliser les traitements contenant un chimiotractant.</li>
	</ol></li>
	<li>Déploiement en laboratoire<ol>
<li>Du jour au lendemain, incuber une culture de 5 mL enrichie de 1% de bouillon marin (pour les bactéries marines) ou de 1% de bouillon de lysogénie (LB, pour les bactéries d’eau douce). REMARQUE : Les isolats bactériens motiles ou les communautés bactériennes naturelles peuvent être utilisés pour les déploiements en laboratoire.</li>
		<li>Incuber la culture pendant 12 h à température ambiante (RT) et 180 tr/min. Après 12 h, assurez-vous que les communautés microbiennes sont motiles par observation directe au microscope.</li>
		<li>Faites tourner la culture à 1 500 x g pendant 10 min et resuspendez 1/100 dans 150 mL de milieu approprié (p. ex., eau de mer filtrée, eau douce filtrée).</li>
		<li>Placez deux petits morceaux de ruban adhésif à double face sur la surface plane d’un plateau de capacité de 200 mL (les couvercles des boîtes à pointes de 1 mL ont les dimensions idéales à cet effet et peuvent facilement être autoclavés). Placez un ISCA sur le dessus, en vous assurant qu’il se fixe solidement à la bande. Remplissez lentement le plateau de déploiement avec la solution bactérienne à l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL. REMARQUE : Remplissez le plateau jusqu’à ce que l’ISCA soit submergée sous environ 1 à 2 cm de liquide. Si vous utilisez plusieurs plateaux, utilisez le même volume dans l’ensemble.</li>
		<li>Laisser l’ISCA incuber pendant 1 h pour permettre la chimiotaxie bactérienne. Après 1 h, retirer le milieu très doucement avec une pipette sérologique de 50 mL pour minimiser le débit turbulent.</li>
		<li>Récupérez l’ISCA du plateau de déploiement sans toucher la surface supérieure. Utilisez une pipette et des essuie-glaces jetables pour enlever le liquide restant sur la surface de l’ISCA. REMARQUE : Il est important d’éviter de toucher les ports pendant ce processus, car les changements de pression qui en résultent peuvent éliminer ou ajouter des bactéries de l’environnement extérieur dans le puits et biaiser ainsi la densité bactérienne et la composition à l’intérieur du puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Récupération des échantillons<ol>
<li>En tenant l’ISCA avec le port orienté vers le bas, récupérer le volume des puits à l’aide d’une aiguille stérile de 27 G fixée à une seringue de 1 mL. REMARQUE : Chaque rangée (si elle contient la même substance) peut être mise en commun pour fournir un échantillon de travail d’environ 550 μL. Cet échantillon peut ensuite être aliquoté dans différents tubes en fonction des applications en aval requises.</li>
		<li>Déterminer le nombre de bactéries attirées par chaque concentration de chimioattractant en analysant les échantillons avec la cytométrie de flux12. Choisissez la concentration de chimioattractant qui maximise la chimiotaxis pour les déploiements ultérieurs sur le terrain.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation au déploiement sur le terrain
REMARQUE : La préparation du matériau et la construction de l’enceinte d’amortissement des débits (section 2) doivent être effectuées avant le déploiement.
<ol><li>Préparation des matériaux<ol>
<li>Préparer tous les documents énumérés au tableau 1. REMARQUE : Des quantités de matériaux sont fournies pour un ISCA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construction et préparation de l’enceinte d’amortissement du débit REMARQUE : L’enceinte d’amortissement des débits minimise les turbulences indésirables qui empêchent autrement l’établissement de gradients chimiques émanant de l’ISCA.<ol>
<li>Couper les morceaux pour l’enceinte de déploiement à l’aide d’un coupe-laser à partir d’une feuille acrylique de 3 mm. REMARQUE : Le fichier des pièces se trouve à l’aide du lien suivant : <https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220>.</li>
		<li>Assemblez les morceaux découpés au laser comme le démontre la figure 2 à l’aide de colle acrylique. REMARQUE : Assemblez les pièces avec soin. Les trous ou le désalignement peuvent créer des fuites lors du déploiement, ce qui a un impact direct sur la qualité des données.</li>
		<li>Laisser sécher l’enceinte assemblée pendant la nuit.</li>
		<li>Laver l’enceinte avec de l’eau déionisée.</li>
		<li>Identifier les fuites potentielles en versant de l’eau déionisée dans l’enceinte. Fixer les joints qui fuient en ajoutant plus de colle acrylique, puis répétez les étapes 2.2.3–2.2.5.</li>
		<li>Couper les fils à vis dans la pièce acrylique qui sera utilisé pour sécuriser l’ISCA. Ceci peut être réalisé à l’aide d’un robinet avec un diamètre et un pas correspondant aux vis de montage.<ol>
<li>Tout d’abord, apposer le robinet dans une clé à robinet, puis fixer la pièce acrylique à taper dans un vice banctop. Pour les meilleurs résultats, assurez-vous que la pièce acrylique est aussi de niveau que possible. Assurez-vous que le robinet est perpendiculaire à la pièce acrylique et commencez à tourner la clé de robinet (dans le sens des aiguilles d’une montre), en appliquant une pression légère sur le robinet.</li>
			<li>Après plusieurs révolutions complètes dans la pièce acrylique, inverser la rotation du robinet (dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) pour un quart de rotation pour effacer l’acrylique du robinet. Répétez le processus jusqu’à ce que toute la profondeur de la pièce acrylique soit tapée.</li>
			<li>Enfin, retirez le robinet (en tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) et testez les fils à l’aide d’une vis.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procédure sur le terrain
<ol><li>Filtration de l’eau<ol>
<li>Recueillir l’eau du site du champ lorsque vous êtes prêt à commencer l’expérience. Filtrer 5 ml d’eau par ISCA à travers un filtre à seringues de 0,2 μm (avec une seringue de 50 ml) dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. REMARQUE : Environ 3 mL d’eau filtrée sont nécessaires pour remplir tous les puits d’une ISCA; cependant, il est recommandé de filtrer 1) 5 mL par appareil pour tenir compte des pertes pendant le processus de filtration quadruple, et 2) préserver les aliquots des filtrates comme contrôles négatifs pour la cytométrie de flux et les procédures moléculaires.</li>
		<li>Filtrer le filtrate deux fois à travers une cartouche de filtre gp hydrophile de 0,2 μm (en utilisant la même, les deux fois) avec une nouvelle seringue de 50 ml dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Filtrer le filtrate à travers un filtre à seringues de 0,02 μm (avec une nouvelle seringue de 50 ml) dans un nouveau tube conique de 50 mL. REMARQUE : Cette quadruple filtration devrait éliminer presque tous les micro-organismes et particules de l’eau. Gardez le filtrate final à l’écart de toute source de chaleur jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Cette eau sera utilisée pour réutiliser tous les produits chimiques utilisés dans l’ISCA, et elle doit être maintenue à la même température que l’eau sur le site de déploiement. Des flux convectifs déclenchés par des différences de température entre les puits isca et l’environnement extérieur peuvent autrement se produire.</li>
		<li>Utilisez des aliquots du filtrate pour réutilire tous les chimioattractants d’intérêt (généralement secs) aux concentrations désirées dans les tubes de centrifugeuse conique de 15 mL.</li>
		<li>Filtrer les chimiotracteurs resuspendés à travers un filtre à seringues de 0,2 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL dans des tubes stériles de centrifugeuse conique de 15 m L pour éliminer les particules indésirables ou les composés insolubles (si vous utilisez des extraits). REMARQUE : Filtrer doucement pour empêcher les particules de passer à travers le filtre. Il est important de résuspender les chimioattractants dans l’eau ultrafiltrée à partir du site du champ et de ne pas les solubiliser dans d’autres solutions. L’utilisation de l’eau du site du champ est nécessaire pour (1) obtenir la même concentration de sel à l’intérieur des puits que dans l’eau environnementale en vrac pour prévenir le débit axé sur la densité, et (2) garantir que les niveaux d’éléments nutritifs de fond sont égaux à l’intérieur et à l’extérieur du puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Remplissage ISCA<ol>
<li>Effectuez la section 1.3 pour remplir l’ISCA. REMARQUE : Il est recommandé de remplir une rangée (cinq puits) par substance (c.-à-d. trois substances différentes par ISCA et une lutte contre l’eau de mer ultrafiltrée).</li>
	</ol></li>
	<li>Déploiement sur le terrain<ol>
<li>Visser l’ISCA (Figure 3A) sur la pièce 9 de l’enceinte (figure 2K et figure 3B). REMARQUE : L’enceinte d’amortissement de l’écoulement décrite ci-dessus peut contenir deux ISCA côte à côte ou une ISCA placée au centre.</li>
		<li>Fermez l’enceinte (figure 3C)et scellez-la avec du ruban adhésif (figure 3D). REMARQUE : Les rides doivent être évitées pour assurer un joint parfait. Sceller tous les côtés d’abord, puis (dans une deuxième étape) sceller les trous latéraux, qui seront utilisés pour drainer l’eau de l’enceinte à la fin de l’échantillonnage. Ne pas sceller les trous supérieurs et inférieurs. Ne placez pas l’ISCA à l’envers, car le débit à densité peut se produire dans les puits contenant des chimioattractants, ce qui biaise le nombre de cellules dans les puits.</li>
		<li>Étant donné que l’enceinte doit rester stable pendant le déploiement, il est recommandé de l’attacher à des structures artificielles (p. ex., ponton, échelle) à l’aide de cordons élastiques. REMARQUE : L’enceinte peut être fixée à un bras de déploiement (ici, une pince modifiée avec une plate-forme perpendiculaire) à l’aide de cordons élastiques avant l’immersion dans l’eau. Alternativement, l’enceinte peut être remplie et fixée avec un petit poids sur des substrats peu profonds. Si des déploiements sont prévus dans l’océan pélagique, l’enceinte peut être fixée à un filet avec une bouée d’un côté et le poids de plongée de l’autre.</li>
		<li>Submergez complètement l’enceinte pour commencer à remplir. Pendant le remplissage, maintenez fermement l’enceinte pour éviter un mouvement excessif de l’eau à l’intérieur. Une fois que le niveau de l’eau atteint le sommet de l’enceinte, assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur. REMARQUE : Dans le cas où certaines bulles d’air sont emprisonnées, inclinez doucement l’enceinte avec le trou d’évent orienté vers le haut, ce qui permettra aux bulles de s’échapper.</li>
		<li>Une fois complètement plein, sceller les trous inférieurs et supérieurs avec deux bouchons, qui peuvent être fabriqués à partir de silicium ou de caoutchouc ou en scellant les extrémités de 20 pointes de pipette μL (figure 4). REMARQUE : Cette étape empêche l’écoulement à l’intérieur de l’enceinte pendant l’échantillonnage.</li>
		<li>Laissez l’ISCA en place pour l’échantillonnage pendant 1 à 3 h. REMARQUE : Le temps de déploiement idéal est principalement dicté par la température de l’eau et le temps de doublement de la communauté bactérienne. Lorsque la température de l’eau est supérieure à 20 °C, il n’est pas recommandé de déployer l’ISCA pendant plus de 1 h, car la division cellulaire peut se produire dans les puits contenant des chimioattractants après 1,5–2,0 h. Toutefois, le temps de déploiement optimal peut être testé avant l’expérience de l’ISCA en modifiant les communautés naturelles avec les produits chimiques chargés et en quantifiant le nombre de cellules dans le temps.</li>
		<li>Retirez l’enceinte de l’eau. Placez-le sur un récipient permettant de drainer l’eau de l’enceinte.</li>
		<li>Retirez très doucement la partie supérieure du ruban adhésif des trous avant. REMARQUE : L’écoulement de l’eau qui sort de l’enceinte doit être à une vitesse de ruissellement. Procéder un trou à la fois, du haut de l’enceinte vers le bas. Il faut environ 10 à 15 min pour drainer complètement l’enceinte.</li>
		<li>Une fois que la ligne de flottaison passe sous le dessus de l’ISCA, retirez le bouchon inférieur et égouttez le reste de l’eau.</li>
		<li>Pendant que les ISCA sont toujours fixées à l’enceinte, retirez soigneusement l’eau emprisonnée sur le dessus de l’ISCA à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
		<li>Retirer l’ISCA sans toucher la surface supérieure et utiliser un lingettes jetables pour enlever tout liquide restant à la surface. REMARQUE : Il est important de ne pas toucher les ports pendant ce processus, car les changements de pression qui en résultent peuvent éliminer ou ajouter des bactéries en vrac dans le puits et biaiser les dénombrements bactériens.</li>
		<li>Récupérez les échantillons de l’ISCA en répétant l’étape 1.5.1.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Applications en aval
REMARQUE : Les volumes sont donnés sur la base d’un échantillon de 550 μL (une rangée d’une ISCA).
<ol><li>Fixer 100 μL de contenu de puits avec du glutaraldéhyde (concentration finale de 2 %) pour la cytométrie du débit afin de quantifier le chemotaxis à chaque attractant. REMARQUE : Conserver sur la glace (ou à 4 °C) et analyser les échantillons le même jour. Alternativement, les échantillons peuvent être congelés par flash dans l’azote liquide après fixation si l’analyse n’est pas possible le même jour. La cytométrie du débit est la méthode recommandée pour quantifier le nombre de cellules dans les puits isca, car il est simple, rapide et précis12.</li>
	<li>Congeler 300 μL de teneur en puits dans l’azote liquide pour l’extraction et l’analyse ultérieures de l’ADN11. REMARQUE : Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à l’analyse.</li>
	<li>Ajouter 90 μL de contenu de puits à 10 μL de tampon TE-glycérol et congeler les échantillons pour la génomique unicellulaire13.</li>
	<li>Étendre 10 à 20 μL sur les plaques d’agar contenant le milieu désiré pour l’isolement bactérien.</li>
</ol>

<ol><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338, 628-633 (2012).</li>
<li>Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microbial+motility+and+chemotaxis+in+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).</li>
<li>Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+of+bacteria+from+marine+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Repulsion of bacteria from marine surfaces.</a> Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> PNAS. 113, 1576-1581 (2016).</li>
<li>Matilla, M., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bacterial+chemotaxis+on+host+infection+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).</li>
<li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in bacteria.</a> Science. 153, 708-716 (1966).</li>
<li>Adler, J., Dahl, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+the+motility+of+bacteria+and+for+comparing+random+and+non-random+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility.</a> Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).</li>
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<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Lambert, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+situ+chemotaxis+assay+to+study+the+behaviour+of+aquatic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities.</a> Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).</li>
<li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).</li>
<li>Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaworzewska%2C+ET+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , (1982).</li>
<li>Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudation+and+rhizosphere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root exudation and rhizosphere biology.</a> Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

À l’échelle des micro-organismes aquatiques, l’environnement est loin d’être homogène et se caractérise souvent par des gradients physiques/chimiques qui structurent les communautés microbiennes1,15. La capacité des micro-organismes motiles à utiliser le comportement (c.-à-d. la chimiotaxis) facilite la recherche de nourriture dans ces microenvironnements hétérogènes1. L’étude de la chimiotaxis directement dans l’environnement a le potenti...

Divers micro-organismes utilisent la motilité et la chimiotaxis pour exploiter des environnements nutritifs irréguliers, trouver des hôtes, ou éviter les conditions délétères1,2,3. Ces comportements microbiens peuvent à leur tour influencer les taux de transformation chimique4 et favoriser des partenariats symbiotiques entre les écosystèmes terrestres, d’eau douce et marins2,5.
Chemotaxis a été largement étudié dans des conditions de laboratoire pour les 60 dernières années6. La première méthode quantitative pour étudier la chimiotaxis, l’essai capillaire, implique un tube capillaire rempli d’un chimioattractant putatif immergé dans une suspension de bactéries6. La diffusion du produit chimique hors du tube crée un gradient chimique, et les bactéries chimiotaxiques réagissent à ce gradient en migrant dans le tube7. Depuis le développement de l’essai capillaire, encore largement utilisé aujourd’hui, de nombreuses autres techniques ont été développées pour étudier la chimiotaxis dans des conditions physiques/chimiques de plus en plus contrôlées, la plus récente impliquant l’utilisation de microfluidiques8,9,10.
La microfluidique, associée à la microscopie vidéo à haute vitesse, permet de suivre le comportement des cellules individuelles en réponse à des gradients soigneusement contrôlés. Bien que ces techniques aient grandement amélioré notre compréhension de la chimiotaxis, elles ont été limitées à l’utilisation en laboratoire et ne se traduisent pas facilement par le déploiement sur le terrain dans les systèmes environnementaux. Par conséquent, la capacité des communautés naturelles de bactéries à utiliser des chimiotaxis dans les écosystèmes naturels n’a pas été examinée; ainsi, la compréhension actuelle de l’importance écologique potentielle de la chimiotaxis est biaisée vers des conditions artificielles de laboratoire et un nombre limité d’isolats bactériens de culture en laboratoire. L’ISCA récemment développé surmonte ces limitations11.
L’ISCA s’appuie sur le principe général de l’essai capillaire; cependant, il utilise des techniques modernes de microfabrication pour fournir une plate-forme expérimentale hautement répliquée et facilement déployable pour la quantification de la chimiotaxis vers des composés d’intérêt pour l’environnement naturel. Il permet également l’identification et la caractérisation des micro-organismes chimiotaxiques par l’isolement direct ou les techniques moléculaires. Alors que le premier dispositif de travail a été auto-fabriqué et construit en verre et PDMS11, la dernière version moulée par injection est composée de polycarbonate, en utilisant une procédure de fabrication très standardisée (pour l’intérêt pour la dernière version de l’appareil, les auteurs correspondants peuvent être contactés).
L’ISCA est de la taille d’une carte de crédit et se compose de 20 puits répartis dans un réseau de puits de 5 x 4, chacun relié à l’environnement aquatique externe par un petit port (800 μm de diamètre; Figure 1). Les chimioattractants putatifs chargés dans les puits se diffusent dans l’environnement via le port, et les microbes chimiotaxiques réagissent en nageant à travers le port dans le puits. Comme de nombreux facteurs peuvent influer sur le résultat d’une expérience isca dans l’environnement naturel, ce protocole étape par étape aidera les nouveaux utilisateurs à surmonter les obstacles potentiels et à faciliter des déploiements efficaces.

<table><tbody><tr><td>Colle acrylique</td><td>Evonik</td><td>1133</td><td>Acrifix 1S 0116</td></tr><tr><td>Feuille acrylique</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K725</td><td>Ou autre entreprise</td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td><td>Scotch</td><td>3M 810</td><td>Scotch Magic</td></tr><tr><td>tape Autoclave</td><td>Systec</td><td>D-200</td><td>Ou autre entreprise</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002451</td><td>Ou autre entreprise</td></tr><tr><td>Cordon élastique</td><td>Paracord Planet</td><td>667569184000</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR780546-500EA</td><td>Tube Eppendorf</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique - 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11507411</td><td>Tube Falcon</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique - 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td>Tube Falcon</td></tr><tr><td>Bras de déploiement</td><td>Irwin</td><td>1964719</td><td>Ou une autre entreprise</td></tr><tr><td>Connecteur de boîtier de déploiement</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Voir les alternatives dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Essuie-glaces jetables</td><td>Kimtech - Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Cytometer Beckman</td><td></td><td>C09756</td><td>CYTOFlex</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td>Ou autre société</td></tr><tr><td>Colorant fluorescent vert</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9430</td><td>SYBR Vert I - dilution finale 1:10 000</td></tr><tr><td>Cartouche filtrante GP hydrophile - 0,2 & micro ; m</td><td>Merck</td><td>C3235</td><td>Filtre Sterivex</td></tr><tr><td>In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)</td><td>-</td><td>-</td><td>Contacter les auteurs correspondants</td></tr><tr><td>Découpeuse laser</td><td>Epilog Laser</td><td>Fusion pro 32</td><td>Ou autre société</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Ou autre société</td></tr><tr><td>Marine Broth 2216</td><td>VWR</td><td>90004-006</td><td>Difco</td></tr><tr><td>Nylon vis à tête plate fendue</td><td>McMaster-Carr</td><td>92929A243</td><td>M 2 & times ; 4 & times ; 8 mm</td></tr><tr><td>Set de pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td>Ou d’une autre entreprise</td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td>Ou d’une autre entreprise</td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 20 & micro ; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Ou une autre société</td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 200 & micro ; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-1</td><td>Ou une autre entreprise</td></tr><tr><td></td><td>Sel de mer Sigma Aldrich</td><td>S9883</td><td>Pour l’eau de mer artificielle</td></tr><tr><td>Pipette sérologique - 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SIAL1490-100EA</td><td>Ou une autre entreprise</td></tr><tr><td>Filtre à seringue - 0,02 & micro ; m</td><td>Whatman</td><td>WHA68091002</td><td>Anatop filtre</td></tr> à <tr><td>seringue - 0.2 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>10695211</td><td>Or different company</td></tr><tr><td>Seringue aiguille 27G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td>0.4 &times ; 12 mm</td></tr><tr><td>Seringues - 1 mL</td><td>Codau</td><td>329650</td><td>Insulin Luer U-100</td></tr><tr><td>Seringues - 10 mL</td><td>BD</td><td>303134</td><td>ou autre société</td></tr><tr><td>Seringues - 50 mL</td><td>BD</td><td>15899152</td><td>Ou autre société</td></tr><tr><td>Tube rack - 15 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Ou autre entreprise</td></tr><tr><td>Rack de tube - 50 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Ou autre entreprise</td></tr><tr><td>Robinet à usage général en acier rapide non revêtu</td><td>McMaster-Carr</td><td>8305A77</td><td>Ou autre société</td></tr><tr><td>Filtre à vide - 0.2 &micro ; m</td><td>Filtre Merck</td><td>SCGPS05RE</td><td>Steritop</td></tr></tbody></table>

test de chimiotaxis in situ pour examiner le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Les comportements microbiens, tels que la motilité et la chimiotaxis (la capacité d’une cellule à modifier son mouvement en réponse à un gradient chimique), sont répandus dans les domaines bactérien et archéal. Les chimiotaxis peuvent se traduire par d’importants avantages d’acquisition de ressources dans des environnements hétérogènes. Il joue également un rôle crucial dans les interactions symbiotiques, les maladies et les processus mondiaux, tels que le cyclisme biogéochimique. Cependant, les techniques actuelles limitent la recherche de chimiotaxis au laboratoire et ne sont pas facilement applicables sur le terrain. Présenté ici est un protocole étape par étape pour le déploiement de l’essai in situ chemotaxis (ISCA), un dispositif qui permet un interrogatoire robuste de chimiotaxis microbienne directement dans l’environnement naturel. L’ISCA est un dispositif microfluidique composé d’un réseau de 20 puits, dans lequel les produits chimiques d’intérêt peuvent être chargés. Une fois déployés dans des environnements aqueux, les produits chimiques se diffusent hors des puits, créant des gradients de concentration auxquels les microbes sentent et réagissent en nageant dans les puits par le biais de chimiotaxis. Le contenu du puits peut ensuite être échantillonné et utilisé pour (1) quantifier la force des réponses chimiotaxiques à des composés spécifiques par cytométrie de flux, (2) isoler et la culture des micro-organismes sensibles, et (3) caractériser l’identité et le potentiel génomique des populations répondantes par des techniques moléculaires. L’ISCA est une plate-forme flexible qui peut être déployée dans n’importe quel système avec une phase aqueuse, y compris les milieux marins, d’eau douce et de sol.

Cette section présente les résultats de laboratoire utilisant l’ISCA pour tester la réponse chimiotaxique des microbes marins à une gamme de concentration de glutamine, un acide aminé connu pour attirer les bactéries du sol14. La concentration de glutamine qui a suscité la réponse chimiotactique la plus forte dans les essais de laboratoire a été employée pour effectuer un essai de chemotaxis dans l’environnement marin.
Pour effectuer les tests de laboratoire, les commun...

Présenté ici est le protocole pour un test de chimiotaxis in situ, un dispositif microfluidique récemment développé qui permet des études du comportement microbien directement dans l’environnement.

Test de chimiotaxis in situ pour examiner le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Notre protocole nous permet de quantifier solidement les chimiotaxis microbiens directement dans leur habitat. Ainsi, nous pouvons isoler les micro-organismes et mieux quantifier et comprendre le potentiel métabolique. L’essai in situ de chimiotaxis, ou ISCA en bref, est un dispositif flexible, convivial, et simple qui permet un nouvel aperçu des comportements microbiens et donc le rôle et la fonction des micro-organismes dans n’importe quel environnement qui a une phase liquide.Estelle Clerc, qui est actuellement doctorante dans mon groupe de recherche, démontre la procédure de déploiement en laboratoire et sur le terrain. Avant de préparer le chimioattractant, filtrer le milieu à l’aide d’un filtre de 0,2 micromètre et autoclave la solution filtrée. Ensuite, préparez une solution 10 millimolaire de chimioattractant dans 1 millilitre du milieu stérile, et filtrez la solution chimioattractante avec un filtre à seringues de 0,2 micromètre pour éliminer les particules et les contaminants potentiels.Ensuite, diluer la solution de stock de chimioattractant filtré en série, selon le protocole expérimental. Pour remplir un ISCA, fixez une aiguille de calibre 27 à une seringue de 1 millilitre et chargez une seringue pour chaque concentration du chimioattractant filtré. En tenant l’appareil avec le port orienté vers le haut, injectez lentement chaque concentration de la substance dans chacun des cinq puits d’une rangée de l’appareil jusqu’à ce qu’une petite gouttelette apparaisse au-dessus de chaque port.Lorsque tous les puits ont été remplis, transférer 1,5 millilitre de la culture des bactéries marines ou d’eau douce d’intérêt dans 150 millilitres du milieu de culture bactérienne approprié. Ensuite, placez deux petits morceaux de ruban adhésif à double face sur la surface plane d’un plateau de capacité de 200 millilitres. Et fixez un ISCA sur chaque morceau de ruban adhésif.À l’aide d’une pipette sérologique de 50 millilitres, remplissez lentement le plateau de déploiement avec la solution bactérienne. Et permettre aux bactéries de répondre à la chimioattractant d’intérêt pendant une heure. Pour terminer l’analyse, utilisez une nouvelle pipette de 50 millilitres pour retirer doucement le milieu du plateau ISCA.Pour récupérer les échantillons, placez d’abord l’ISCA de sorte que le port soit orienté vers le bas. Ensuite, utilisez une seringue stérile de 1 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 pour tirer la solution de chaque puits. Tirer les échantillons de chaque rangée de la même concentration en un seul tube.Ensuite, analyser les échantillons par cytométrie d’écoulement pour déterminer le nombre de bactéries attirées par chaque concentration de chimioattractants. Pour préparer un ISCA pour le déploiement sur le terrain, d’abord, recueillir 5 millilitres d’eau par ISCA du côté du champ et filtrer l’eau à travers un filtre de seringue de 0,2 micromètre dans un tube conique de 50 millilitres. Passez l’eau filtrée de seringue à travers une cartouche de filtre hydrophile GP deux fois, la collecte du filtrate dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres, après chaque rinçage.Filtrez ensuite l’eau à travers un filtre à seringues de 0,02 micromètre dans un nouveau tube de 50 millilitres. Utilisez des aliquots du filtrate pour résuser tous les chimioattractants d’intérêt aux concentrations désirées dans les tubes coniques individuels de 15 millilitres. Ensuite, utilisez des seringues de 10 millilitres pour filtrer les chimioattractants résuspendus à travers des filtres de seringue individuels de 0,2 micromètre dans des tubes stériles de centrifugeuse conique de 15 millilitres pour éliminer les particules indésirables ou les composés insolubles d’eau.Pour le déploiement sur le terrain de l’ISCA, vissez chaque ISCA sur la pièce 9 de l’enceinte de l’appareil et fermez l’enceinte. Sceller l’enceinte avec du ruban adhésif et utiliser des cordons élastiques pour fixer l’enceinte à un bras de déploiement et à une structure humaine. Alternativement, l’enceinte peut être fixée avec un petit poids sur un substrat peu profond ou attachée à un filet dans l’océan Pélagique.Submergez complètement l’enceinte pour commencer le remplissage, en tenant fermement l’enceinte pour éviter un mouvement excessif de l’eau à l’intérieur. Une fois que le niveau de l’eau a atteint le sommet de l’enceinte, assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur. Lorsque l’enceinte est complètement pleine, sceller les trous du bas et du haut avec deux bouchons.Ensuite, laissez l’ISCA en place pendant 1 à 3 heures. À la fin de la période d’échantillonnage, retirez l’enceinte de l’eau. Placez l’enceinte au-dessus d’un récipient pour évacuer l’eau et retirez soigneusement la partie supérieure du ruban adhésif des trous avant.Une fois que la conduite d’eau est passée sous le dessus de l’ISCA, retirez la prise inférieure et égouttez le reste de l’eau. Pendant que les ISCA sont toujours fixés à l’enceinte, utilisez une pipette de 1 millilitre, ou une seringue de 1 millilitre, pour enlever soigneusement l’eau emprisonnée au-dessus de chaque ISCA et enlever les ISCA sans toucher la surface supérieure. Ensuite, utilisez un lingette jetable pour enlever tout liquide restant à la surface, et récupérer les échantillons comme démontré pour la récupération de l’échantillon de laboratoire.Dans cette analyse in vitro représentative, 1 millimolar a été déterminé pour être la concentration optimale de déploiement de glutamine car il a induit une réponse chemotactic significative qui était 18 fois plus élevée que le contrôle filtré d’eau de mer. Des concentrations plus élevées et plus faibles de glutamine ont également induit une réponse chimoactique significative, mais plus faible. Dans cette analyse de déploiement sur le terrain, cinq répliques isca remplies de glutamine de 1 millimolaire ont été déployées pendant 1 heure sur un site côtier près de Sydney, en Australie.Et l’ISCA rempli de glutamine a attiré près de trois fois plus de bactéries que les puits de contrôle remplis d’eau de mer filtrée. La chose la plus importante à retenir lors du déploiement de l’ISCA, à la fois en laboratoire et sur le terrain, est d’éviter de créer de forts flux de fluides qui empêcheront la chimiotaxie. Les échantillons dérivés de l’ISCA peuvent être utilisés pour identifier des organismes ou des gènes spécifiques, pour caractériser le potentiel génomique des organismes chimoactiques et pour isoler de façon ciblée des souches spécifiques sur les médias sélectifs.

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