Name: Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez un protocole optimisé pour l'isolation, la culture longue durée et la transfection siRNA de cardiomyocytes adultes de souris et de rats. Cette méthode permet de maintenir des cellules viables et fonctionnelles pendant plus de 20 jours.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été appuyé par le financement du Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’Université de Cincinnati, College of Medicine, au Dr Onur Kanisicak; une subvention des National Institutes of Health (R01HL148598) au Dr Onur Kanisicak. Le Dr Onur Kanisicak est soutenu par l’American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Le Dr Perwez Alam est soutenu par la subvention postdoctorale de l’American Heart Association (AHA_20POST35200267). Le Dr Malina J. Ivey est soutenu par une subvention T32 des NIH (HL 125204-06A1).

Toutes les expériences doivent être réalisées conformément aux lignes directrices du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par le National Institute of Health (NIH) des États-Unis. Tous les protocoles affichés dans la vidéo ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Cincinnati, College of Medicine.
1. Préparation avant l’extraction cardiaque de souris adultes (et rats)
<ol><li>Préparer les solutions de perfusion, d’enzyme et d’arrêt correspondantes, selon les recettes données respectivement aux tableaux 1 et 2, pour l’isolement des rats et des souris. Filtrer les solutions à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toute contamination ou particules non déguisées.</li>
	<li>Nettoyez et stérilisez les instruments chirurgicaux en les trempant dans 70% d’alcool pendant 15 min, puis lavez-les avec de l’eau distillée double. Laissez les outils sécher à l’air sur une serviette en papier propre.</li>
	<li>Préchauffer le bain d’eau à 37 ºC. Vérifiez le niveau d’eau dans le bain d’eau pour assurer une circulation ininterrompue de l’eau chaude à travers l’appareil de perfusion pendant la procédure.</li>
	<li>Nettoyez l’appareil de perfusion en courant avec 70% d’alcool pendant 5 min. Répétez. REMARQUE : Augmentez le débit, ce qui aide à nettoyer le tube.</li>
	<li>Après le débit d’alcool, nettoyer les restes d’alcool en exécutant de l’eau distillée double pendant 10 min.</li>
	<li>Mettre en place 3 plats jetables de taille moyenne pesant des plats pour nettoyer le cœur après l’excision. Remplissez les plats de 20 mL de tampon de myocyte.</li>
	<li>Ajouter 2 à 3 gouttes d’héparine dans chaque plat à l’aide de la pipette Pasteur et bien mélanger en pipeting plusieurs fois.</li>
	<li>Prenez une seringue de 10 mL avec une canule à aiguille émoussée. REMARQUE : Une canule à aiguille émoussée peut être préparée en coupant la pointe d’une aiguille propre et stérile. Une aiguille de 21 G et une aiguille de 14 G ont été utilisées pour fabriquer la canule de la souris et du rat, respectivement.</li>
	<li>Remplissez la seringue avec un tampon de perfusion (tableau 1). Retirez les bulles d’air de la seringue et placez-la dans le troisième plat à une position inclinée. Fixez-le avec du ruban adhésif. REMARQUE : Pour les rats, la solution A (tableau 2) a été utilisée au lieu de la tampon de perfusion de myocyte.</li>
	<li>Préparer un nœud lâche avec une suture chirurgicale et le placer autour de l’aiguille.</li>
	<li>Injectez la souris avec de l’héparine (100 unités USP/souris) par injection intrapéritonéale, 20 min avant l’injection d’anesthésie.</li>
	<li>Faire circuler la tampon de perfusion de myocyte (tableau 1) à travers l’appareil de perfusion. Diminuer le débit à 3 mL/min. REMARQUE : Pour les rats, la solution A (tableau 2) a été utilisée au lieu de la tampon de perfusion de myocyte.</li>
	<li>Après 5 min, remplacer le tampon de perfusion par la solution enzymatique (tableau 1). Saturer la solution enzymatique avec de l’oxygène pendant le processus. Utilisez un débit de 3 mL/min. REMARQUE : Pour l’isolement de cm de rat, utilisez la solution E (Tableau 2) à la place.</li>
	<li>Anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale d’anesthésie. Utilisez la dose appropriée d’anesthésie, recommandée par l’IACUC, pour la chirurgie terminale.</li>
	<li>Confirmer une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence d’une réponse à une pincée d’orteil. Ensuite, mettez la souris sur la plate-forme chirurgicale.</li>
</ol>2. Extraction du cœur de souris adultes (et de rats)
<ol><li>Stériliser la peau en essuyant avec 70% d’alcool.</li>
	<li>Ouvrez soigneusement la poitrine.</li>
	<li>Exciser le cœur. Évitez les tissus non cardiaques pendant l’excision.</li>
	<li>Mettez le cœur sur le premier plat, rempli de tampon de perfusion (Tableau 1). REMARQUE : Utiliser la solution A pour le rat (tableau 2).</li>
	<li>Dégagez le sang du cœur en serrant doucement.</li>
	<li>Transférer le cœur dans le deuxième plat.</li>
	<li>Nettoyez le sang du cœur et retirez les tissus non cardiaques. Par la suite, transférer le cœur dans le troisième plat.</li>
	<li>Coupez les poumons et les autres tissus environnants et cannulez par l’intermédiaire de l’aorte ascendante. Cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible (<5 min) afin d’améliorer la qualité et la quantité de CM.</li>
</ol>3. Digestion du cœur
<ol><li>Digestion du cœur de souris REMARQUE : Toutes les solutions/tampons qui circulent dans le cœur de la souris doivent être oxygénées tout au long de la procédure.<ol>
<li>Retirez soigneusement l’aiguille cannuillante de la seringue et connectez-la à l’appareil de perfusion de Langendorff.</li>
		<li>Évitez toute bulle d’air entrant dans le cœur, ce qui peut affecter le flux à travers la solution enzymatique et la digestion.</li>
		<li>Déplacez la veste d’eau vers le haut pour fournir un environnement homogène au coeur. Permettre à la solution enzymatique de circuler dans le cœur à une vitesse de 2-3 mL/min. REMARQUE : La vitesse de la solution de dépassement est critique et a un impact significatif sur le résultat de la quantité et de la qualité cm.</li>
		<li>Laissez la solution enzymatique circuler dans le cœur pendant 2 min.</li>
		<li>À 2 min, ajouter 40 μL de 100 μM CaCl2 solution à la solution enzymatique et mélanger. Laissez passer la solution enzymatique dans le cœur pendant encore 10-15 min. REMARQUE : Une fois que le flux devient lisse, le cœur devient brunâtre et doux, indiquant la distribution uniforme de l’enzyme de collagènease et la bonne digestion du cœur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digestion du cœur de rat REMARQUE : Toutes les solutions/tampons qui circulent dans le cœur du rat doivent être oxygénées tout au long de la procédure.<ol>
<li>Retirez soigneusement l’aiguille cannuillante de la seringue et connectez-la à l’appareil de perfusion de Langendorff.</li>
		<li>Évitez toute bulle d’air entrant dans le cœur, ce qui peut affecter le flux à travers la solution enzymatique et la digestion.</li>
		<li>Déplacez la veste d’eau vers le haut pour fournir un environnement homogène au coeur.</li>
		<li>Démarrer le flux de la solution A à une vitesse de 2-3 mL/min pendant 3-5 min pour enlever tout sang du cœur. REMARQUE : La vitesse de la solution de dépassement est critique et a un impact significatif sur le résultat de la qualité CM.</li>
		<li>Une fois le sang dégagé du cœur, passez de la solution A à la solution E (Tableau 2). Solution de titrage E avec CaCl2 comme indiqué ci-dessous pour une concentration finale de 0,1 mM en solution :<ol>
<li>Après 10 min de perfusion, ajouter 12,5 μL de 0,1 M CaCl2.</li>
			<li>Après 15 min de perfusion, ajouter 25 μL de 0,1 M CaCl2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laissez la solution enzymatique passer à travers le cœur pendant encore 30-40 min, jusqu’à ce que le flux devient rapide et le cœur est souple.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Préparation de la suspension à cellule unique CM
<ol><li>Préparation de la suspension à cellule unique CM (souris)<ol>
<li>Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez-le dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie de 5 mL de solution enzymatique et transférez le plat sur une hotte de biosécurité. REMARQUE : Assurer une digestion cardiaque suffisante avant d’enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Le temps de digestion dépend de l’activité enzymatique, le flux de la solution, et la taille du cœur.</li>
		<li>Effectuer toute autre désagrégation mécanique dans un capot de biosécurité pour assurer la stérilité et éviter la contamination.</li>
		<li>Retirez soigneusement les atrias(1/4 e de la partie du cœur basal) et les tissus adipeux supplémentaires.</li>
		<li>Hacher le cœur avec des forceps en morceaux fins.</li>
		<li>Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à un angle de 45º.</li>
		<li>Utilisez cette pipette Pasteur pour distribuer le tissu cardiaque dans une suspension unicellulaire par pipetage doux. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires. REMARQUE : Retirez la partie étroite et inférieure du tuyau de transfert pour réduire les dommages causés par cm en raison de l’entrage mécanique.</li>
		<li>Ensuite, ajouter 5 mL de solution d’arrêt pour arrêter l’activité enzymatique, ce qui évite la possibilité de surdigestion.</li>
		<li>Prenez un produit conique frais de 50 mL et placez-le sur une passoire à cellules stérile de 100 μm.</li>
		<li>Passer la suspension cardiomyocyte à travers la passoire cellulaire pour enlever le morceau de tissu. Laver la boîte et la passoire Petri avec une autre solution d’arrêt de 5 mL (tableau 1)pour recueillir les cardiomyocytes qui restent attachés à la passoire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la suspension à cellule unique CM (rat)<ol>
<li>Retirer le cœur du système de perfusion langendorff. Déplacez le cœur vers une boîte de Pétri de 100 mm remplie de 5 mL de solution A et déplacez le plat vers une hotte de biosécurité. REMARQUE : Assurer une digestion cardiaque suffisante avant d’enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Le temps de digestion dépend de l’activité enzymatique, le flux de la solution, et la taille du cœur.</li>
		<li>Effectuer toute autre désagrégation mécanique dans un capot de biosécurité pour assurer la stérilité et éviter la contamination.</li>
		<li>Retirez soigneusement les atrias (1/4e de la partie du cœur basal) et les tissus adipeux supplémentaires.</li>
		<li>Hacher le cœur avec des forceps en morceaux fins.</li>
		<li>Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à un angle de 45º.</li>
		<li>Utilisez cette pipette Pasteur pour distribuer le tissu cardiaque en suspension unicellulaire par pipetage doux. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires. REMARQUE : Retirez la partie étroite et inférieure du tuyau de transfert pour réduire les dommages causés par cm en raison de l’entrage mécanique.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de solution B (tableau 2) à la suspension CM et passer la solution à travers une passoire à cellules de 100 μm pour enlever les morceaux restants de graisse ou d’autres tissus non digérés.</li>
		<li>Recueillir le filtrate dans un flacon conique frais de 50 mL.</li>
		<li>Utilisez un autre 5 mL de solution B pour laver la boîte de Pétri et tout cm restant à travers la passoire cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Suppression des non-CM
<ol><li>Retrait des non-CM de la suspension adulte à cellule unique (souris)<ol>
<li>Centrifuge la suspension cellulaire à 20 x g pendant 3 min.</li>
		<li>Jeter le supernatant et resuspender les cellules dans 10 mL de solution d’arrêt (Tableau 1). REMARQUE : L’augmentation de la concentration de BSA dans la solution d’arrêt augmentera sa viscosité et réduira le taux de sédimentation des non-MC.</li>
		<li>Resuspendez les CM par l’inversion douce du tube 3-5 fois.</li>
		<li>À intervalles de 3 min, ajouter 10 μL de 100 μM CaCl2 solution et mélanger. Répétez trois fois.</li>
		<li>Après le quatrième ajout, centrifuge la suspension cardiomyocyte à 20 x g pendant 3 min.</li>
		<li>Jetez le supernatant.</li>
		<li>Resuspend les MC en préchauffés (37 ºC), les supports de placage CM de souris adultes (tableau 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retrait des non-CM des suspensions adultes à cellule unique (rat)<ol>
<li>Cellules de granulés à 20 x g pendant 3 min à 25 ºC.</li>
		<li>Jeter le supernatant et resuspender les cellules en 25 mL de solution B (Tableau 2).</li>
		<li>Mélanger les cellules par une légère inversion et les placer dans un support de tube pour permettre au CM de s’installer sous la gravité.</li>
		<li>Jeter soigneusement le supernatant.</li>
		<li>Resuspendez les cellules dans 25 mL frais de la solution B et titrez-les à 1,0 mM CaCl2 par addition progressive de 50 μL, 75 μL et 100 μL de 0,1 M CaCl2 à intervalles de 3 à 5 min. REMARQUE : Une concentration plus élevée de BSA dans la solution B pourrait être utilisée à cette étape. L’augmentation de la concentration de BSA dans la solution B augmente la viscosité et, par conséquent, réduit le taux de sédimentation des non-MC.</li>
		<li>Cellules de granulés à 20 x g pendant 3 min à 25 ºC, aspirant le supernatant, et ajouter le volume désiré de la culture de cellules de rat adultes (tableau 4).</li>
		<li>Semer les CM sur une plaque enduite de laminine. REMARQUE : Le pré-placage des MC sur une plaque de culture non enduite peut être utilisé pour minimiser la contamination des cellules non CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Placage CM adulte
<ol><li>Pré-placage<ol>
<li>Resuspend les cardiomyocytes dans les médias culturels.</li>
		<li>Pré-plaquer les cellules dans un plat de 60 mm ou 100 mm pour la souris ou le rat CM, respectivement.</li>
		<li>Incuber les CM pendant 2 h dans un incubateur complété par 5% de CO2 à 37 ºC.</li>
		<li>Pendant l’incubation pré-plaque, enduisez les plaques de culture cellulaire de laminine (10 μg/mL en PBS) pour la culture CM à long terme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après 2 h de pré-placage, recueillir les CM dans un flacon conique de 50 mL.</li>
	<li>Recueillir les cellules du plat et les re-plaquer dans une plaque de culture de 24 puits enduit de laminine pour des expériences de transfection.</li>
	<li>Cellules de culture dans un incubateur à 37 ºC complétés par 5% avec CO2. 4-6 heures est suffisante pour adhérer aux cardiomyocytes avec la surface, et donc, la transfection peut être effectuée 6 heures après le placage. REMARQUE : Le milieu de placage contenant FBS est couramment utilisé et montre une meilleure compatibilité avec les études de prolifération. Cependant, un milieu sans sérum peut être utilisé pour des expériences où des facteurs sécrétoires sont analysés.</li>
</ol>7. Transfection
<ol><li>Incuber les MC aux plaques de culture cellulaire recouvertes de laminine pendant 4-6 heures.</li>
	<li>Quatre heures après l’ensemencement cm sur la plaque enduite de laminine, les cellules transfectées avec des siARN (50 nM) d’intérêt à l’aide d’un réactif transfection (par exemple, lipofectamine RNAiMAX) selon le protocole du fabricant.</li>
	<li>Changez de support 24 heures après la transfection et toutes les 24 heures après cela pendant jusqu’à 20 jours.</li>
	<li>Après 20 jours, fixer les cellules avec 4% PFA dans PBS pour les applications en aval, y compris l’immunocytochimie pour les marqueurs cardiaques spécifiques tels que troponine pour assurer cardiomyocytes vivants ont été cultivés avec succès à long terme.</li>
</ol>

<ol><li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li>
<li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748(2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li>
<li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289(2013).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+ischemic+heart+disease%3A+novel+carriers+for+bioinformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451(2019).</li>
<li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases%3A+Beneficial+or+Detrimental%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058(2018).</li>
<li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li>
<li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089(2019).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-210-mediated+proliferation%2C+survival%2C+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634(2017).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li>
<li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357(2014).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li>
<li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li>
<li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+2%2C3-butanedione+monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li>
</ol>

Il est essentiel d’établir un protocole pour l’isolement cardiomyocyte adulte et la culture à long terme pour effectuer des études mécanistes spécifiques aux cellules. Il n’y a que quelques rapports discutant des protocoles adultes d’isolement cm, et encore moins d’entre eux sont utilisés pour la culture à long terme des souris adultes CM15,16,17. Il est démontré que le rat adulte CM a une plus grande tolérance à la culture in v...

Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes de décès dans le monde. Presque tous les types de lésions cardiaques entraînent une perte importante de cardiomyocytes adultes (CM). Les cœurs de mammifères adultes sont incapables de réparer leurs lésions cardiaques en raison de la nature sénescente du CM1adulte. Ainsi, toute insulte au cœur des mammifères adultes entraîne une perte permanente de CMs, conduisant à une diminution de la fonction cardiaque et l’insuffisance cardiaque. Contrairement aux mammifères adultes, les petits animaux comme le poisson zèbre et les cœurs de newt peuvent régénérer leurs lésions cardiaques par la prolifération existante cm2,3,4. Un effort mondial est en cours pour trouver une nouvelle intervention thérapeutique pour les lésions cardiaques par le biais d’approches prolifératives et non prolifératives. Au cours des dernières décennies, divers types de modèles génétiques de souris ont été développés pour étudier les lésions cardiaques et la réparation. Cependant, l’utilisation de modèles animaux in vivo continue d’être une approche coûteuse avec la complexité supplémentaire pour déchiffrer un mécanisme cellulaire autonome à partir d’effets secondaires. En outre, les systèmes in vivo sont difficiles à analyser les effets spécifiques cm d’une intervention pharmacologique qui induit la signalisation cardioprotectrice de la CM.
De plus, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour effectuer des analyses de prolifération des CM. Les tests de prolifération cm nécessitent un minimum de 4-5 jours pour que les cellules soient induites dans le cycle cellulaire et pour obtenir des données précises par la suite. En outre, les études qui utilisent des CM isolés pour des études électrophysiologiques, le dépistage des médicaments, les études de toxicité, et les études d’homéostasie Ca++ ont tous besoin d’un système de culture amélioré5,6,7. En outre, des études récentes montrent l’importance cardioprotectrice des cytokines sécrétées par les CMs (cardiokines)8,9. Afin d’étudier le rôle thérapeutique et le mécanisme moléculaire de ces cardiokines pendant la réparation et la régénération de coeur, une culture prolongée est exigée.
Les CMs adultes de rat sont assez robustes pour l’isolement unicellulaire et la culture à long terme dans un système in vitro10,11,12. Cependant, les CM de souris adultes sont d’un grand intérêt pour les tests in vitro, en raison de la disponibilité d’une variété de modèles de souris génétiquement modifiés, ce qui permet la conception et l’exécution de diverses analyses innovantes qui ne sont pas possibles avec le rat CM13. Contrairement à l’isolement adulte de CM de rat, il est assez difficile d’obtenir une suspension d’une seule cellule des coeurs de souris adultes, et la culture à long terme des CM de souris adultes dans la culture est encore plus difficile.
L’isolement adulte de CM des coeurs de souris et de rat utilisant un système de Langendorff a précédemment été établi pour étudier la fonction de CM5,14,15. Ici, nous avons décrit en détail les protocoles pour l’isolement adulte de CM des rats et des souris, aussi bien qu’une culture modifiée à long terme, la transfection, et la prolifération de CM des cellules isolées.

<table><tbody><tr><td>2,3-Butane Dione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatine</td><td>APExBIO</td><td>B1387</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Passoire</td> <td>cellulaireBD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cel-miR-67</td><td>Dharmacon</td><td>CN-001000-01-50</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase type2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert graduées jetables</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de pesée jetables en polystyrène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z154881-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified EagleThermo</td><td>Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pointe fine Pince de haute précision</td><td>Fisherbrand</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5400</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>PSLAB-018285-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Haute Précision Droite Large Pointe Forte Pince à épiler / Pince</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr> microscope <tr><td>optique</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Laminine de souris naturelle</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Protéase XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sélénium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865+5G</td><td></td></tr><tr><td>siMeis2</td><td>Dharmacon</td><td>s161030</td><td></td></tr><tr><td>siRb1</td><td>Dharmacon</td><td>s128325</td><td></td></tr><tr><td>Droite Blunt/SharpCiseaux de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td>28252</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td> <td>droite à pointe de précision très fineFisherbrand</td><td>16-100-120</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux ultra-lisses, bords biseautés</td><td>Fisherbrand</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Fisher Scientific</td><td>3006S</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

La culture ex vivo des cardiomyocytes mammifères adultes (CM) présente le système expérimental le plus pertinent pour l’étude in vitro de la biologie cardiaque. Les CMs des mammifères adultes sont des cellules différenciées en phase terminale avec une capacité proliférative minimale. L’état post-mitotique des MCM adultes non seulement limite la progression du cycle cellulaire cardiomyocyte, mais limite également la culture efficace des CM. En outre, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour de nombreuses études, telles que la prolifération cm et l’analyse de l’expression des gènes.
La souris et le rat sont les deux animaux de laboratoire les plus préférés à être utilisés pour l’isolement cardiomyocyte. Bien que la culture à long terme des CMs de rat soit possible, les CMs adultes de souris sont sensibles à la mort et ne peuvent pas être cultivés plus de cinq jours dans des conditions normales. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser l’isolement cellulaire et le protocole de culture à long terme pour les CM murines adultes. Avec ce protocole modifié, il est possible d’isoler et de culture avec succès les CM adultes de souris et de rats pendant plus de 20 jours. De plus, l’efficacité de la transfection du SIRNA du CM isolé est considérablement augmentée par rapport aux rapports précédents. Pour l’isolement cm de souris adulte, la méthode de perfusion de Langendorff est employée avec une solution enzymatique optimale et le temps suffisant pour la dissociation complète de matrice extracellulaire. Afin d’obtenir des MC ventriculaires purs, les deux atrias ont été disséqués et jetés avant de procéder à la dissociation et au placage. Les cellules ont été dispersées sur une plaque enduite de laminine, ce qui a permis un attachement efficace et rapide. Les CM ont été autorisés à se contenter de 4-6 h avant la transfection de siRNA. Les médias culturels ont été rafraîchis tous les 24 h pendant 20 jours, et par la suite, les CM ont été fixés et tachés pour des marqueurs cardiaques spécifiques tels que la troponine et des marqueurs du cycle cellulaire tels que KI67.

Le protocole modifié actuel permet l’isolement efficace et la culture des rats et des souris CMs in vitro. Pour l’isolement de CM de rat, un total de 3 adultes (12 semaines)mâle Fischer 344 rats ont été utilisés dans la procédure. La figure 1 montre l’appareil chirurgical et les configurations d’isolement requises dans la procédure; chaque partie a été marquée et décrite dans la légende de la figure. Collagène de type 2 a été utilisé pour la digestion, ce qui donne une grande quantité de CMs...

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

L’objectif de cette vidéo est de démontrer un protocole normalisé pour l’isolement des cardiomyocytes adultes, la culture à long terme et la transfection. Isoler et cultiver les cardiomyocytes de souris ou de rats continue d’être une méthode essentielle pour étudier la biologie cellulaire autonome des cardiomyocytes dans le cœur sain et de la maladie. Il y a plusieurs questions auxquelles nous pouvons répondre à l’aide de cardiomyocytes isolés.Comme le potentiel proliférant. Il y a des changements d’expression de gène ou des expressions spécifiques de cytokine sur la réponse de blessure. Malheureusement, les cardiomyocytes de souris ne survivent pas au-delà d’une semaine dans des conditions normales de culture.Par conséquent, dans cette vidéo, nous décrivons une méthode optimisée pour isoler les cardiomyocytes adultes de souris, les transfixés et les avons cultivés bien au-delà de 21 jours, cette technique est d’abord difficile à maîtriser. Mais avec la pratique, on peut atteindre environ 80 à 90% survivre dans les cardiomyocytes après l’isolement et environ une efficacité de transfection à 100 pour cent. Et la plupart de ces cardiomyocytes dans des conditions correctes peuvent sur

isolation-transfection-long-term-culture-adult-mouse-rat

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans ce papier, nous avons décrit d'une manière typique à isoler et cultiver les myocytes cardiaques de rat adulte. Collagénase et la protéase sont utilisés pour digérer et d'isoler les myocytes unique. Myocytes cultivés suivre ce protocole répondent aux exigences les plus expérimenter.

Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat

Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d'animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d'enquêtes cellulaires par microscopie confocale.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

Nous décrivons une méthode fiable pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

Ce protocole décrit une méthode étape par étape pour l’isolement reproductible et la culture à long terme de cardiomyocytes de souris adultes avec un rendement, une pureté et une viabilité élevés.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Plusieurs protocoles ont été développés et décrits pour l'isolement de différents types de cellules cardiaques d'un cœur de rat. Ici, un protocole optimisé est décrit qui permet d'isoler des types de cellules cardiaques majeurs de haute qualité (cardiomyocytes, cellules endothéliales et fibroblastes) à partir d'une seule préparation, réduisant ainsi les coûts expérimentaux.

Isolation simultanée de cardiomyocytes de haute qualité, de cellules endothéliales et de fibroblastes d&#39;un coeur de rat adulte

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement et la culture du rat adulte cardiomyocytes ventriculaires (CVDA). CVDA isolé peut être utilisé pour la culture à courte et à long terme. L’isolement et la culture de CVDA peuvent jouer un rôle clé dans l’élaboration de nouveaux schémas thérapeutiques pour les maladies cardiaques.

Isolement et culture des Cardiomyocytes de Rat adulte

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

Découvrez un protocole optimisé pour l'isolation, la culture longue durée et la transfection siRNA de cardiomyocytes adultes de souris et de rats. Cette méthode permet de maintenir des cellules viables et fonctionnelles pendant plus de 20 jours.

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Explorer plus de vidéos