Name: Découverte des gènes conducteurs dans les tumeurs de tige de tige de cancer de HT29-dérivées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Découvrez l'identification des gènes conducteurs surexprimés dans les cellules souches cancéreuses colorectales HT29 par RNA-Seq et bioinformatique. Cette méthode révèle les mécanismes moléculaires de la tumorigénèse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient le Laboratoire de biologie des radiations de l’Institut de recherche radiologique de l’hôpital Chang Gung Memorial pour son soutien technique. Cette étude a été soutenue par des subventions de l’hôpital Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), de l’hôpital général Cheng Hsin (CHGH 106-06) et de l’hôpital Commémoratif Mackay (MMH-CT-10605 et MMH-106-61). Les organismes de financement n’ont eu aucune influence dans la conception de l’étude et de la collecte, de l’analyse et de l’interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.

1. Culture cellulaire et formation de tumeursphères
<ol><li>Culture HT29 cellules dans un plat de 10 cm contenant le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% sérum bovin foetal (FBS) et 1% antibiotique pénicilline-streptomycine (P/S).</li>
	<li>Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et 95% d’humidité dans des conditions aseptiques, jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence.</li>
	<li>Trypsiniser les cellules HT29 avec 1 mL de trypsine de 0,25% pendant 5 min à 37 °C et par conséquent neutraliser la trypsine en ajoutant 2 mL de DMEM avec 10% FBS et 1% P/S.</li>
	<li>Compter les cellules HT29 à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Ajouter 2 000 cellules/puits à un faible attaché 6 plaques de puits avec 2 mL de DMEM sans sérum avec 1% P/S et complété par 0,2% B27, 20 ng/mL du facteur de croissance épidermique (FEM), 20 ng/mL du facteur de croissance du fibroblaste (bFGF), 20 ng/mL du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et 20 ng/mL d’interleukine 6 (IL6).</li>
	<li>Faire pousser les cellules à 37 °C avec 5% de CO2 et 95% d’humidité dans des conditions aseptiques.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de cellules souches cancéreuses moyenne tous les 2 jours jusqu’à ce que les tumeurs mesurent >100 μm de diamètre pendant au moins 7 jours.</li>
	<li>Observez et mesurez le diamètre de la tumeur à l’aide d’un microscope inversé avec un système d’imagerie cellulaire numérique.</li>
	<li>Lorsque les tumeurs atteignent >100 μm de diamètre, trypsinize les tumeursphéres avec 0,25% trypsin pendant 5 min à 37 °C et neutraliser la trypsin en ajoutant 2x le volume du milieu de croissance. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifugeuse à 1 200 tr/min pendant 10 min et retirer le supernatant.</li>
	<li>Incuber 5 x 104 cellules avec 2 μL d’anti-LGR5-PE et 2 μL d’anti-CD133-PE dans 100 μL de DMEM individuellement pendant 30 min à température ambiante, en secouant à 200 tr/min. REMARQUE : Le CD133 est un biomarqueur général des cellules souches cancéreuses qui est fortement exprimé dans les cellules HT29.</li>
	<li>Ajoutez 900 μL de PBS et analysez l’expression LGR5 et CD133 à l’aide de la cytométrie de flux. Un changement de fluorescence dans le canal FL2-H indique l’expression des gènes.</li>
</ol>2. Isolement de l’ARN
REMARQUE : Utilisez un kit commercial (voir tableau des matériaux)avec une colonne rapide pour l’isolement de l’ARN suivant les instructions du fabricant.
<ol><li>Ajouter 50 μL de PBS aux cellules récoltées (2 x 105 cellules) et les réutiler avec du pipetage.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de lyse contenant 2 μL de bêta-mercaptoéthanol (β-ME). Vortex rapidement et laisser reposer pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 16 000 x g pendant 10 min. Recueillir le supernatant et mélanger avec 200 μL d’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Utilisez la colonne jointe pour enlever le solvant par centrifugation à 14 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Laver à l’aide de la solution de lavage 1 et 2 pour éliminer complètement les non-ARN par centrifugation à 14 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Centrifugeuse à nouveau à 14.000 x g pendant 2 min pour enlever l’éthanol résiduel.</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’eau distillée, la centrifugeuse à 14 000 x g pendant 1 min et la recueillir.</li>
	<li>Mesurer la concentration d’ARN à l’aide de l’OD260 à l’aide d’un spectrophotomètre. Concentration d’ARN (μg/mL) = (OD260) x (40 μg ARN/mL) et OD260/OD280 > 2. Les échantillons d’ARN doivent avoir un numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) > 7.</li>
</ol>3. Profilage RNAseq et analyse bioinformatique
REMARQUE : L’analyse RNAseq a été effectuée commercialement (voir tableau des matériaux)pour étudier les gènes différentiels dans les tumeurs dérivées de HT29 par rapport aux cellules parentales HT29.
<ol><li>Utilisez les services commerciaux pour les étapes RNAseq, y compris la construction de bibliothèques, le contrôle de la qualité de la bibliothèque et le séquençage de l’ADN.</li>
	<li>Le rapport de données doit contenir des informations importantes, y compris les nombres de lecture, la modification de la liste2 et la valeur p. Sélectionnez les gènes différentiels selon les paramètres suivants : les gènes avec un changement de 1 log2 avec le nombre de lectures >100 dans le groupe HT29 tumorsphere, et les gènes <-1 log2 changent avec le nombre de lectures >100 dans le groupe parental HT29. Dans ce cas, une valeur p < 0,05 a été jugée acceptable et les données ont été utilisées (Tableau 1). NOTE : Ici, un nombre de gènes >100 a été utilisé comme seuil pour poursuivre l’étude d’un gène particulier et valider son expression.</li>
	<li>Utilisez un logiciel d’analysestatistique (voir tableau des matériaux), pour afficher une carte thermique et identifier les gènes surexprimés >1 et les gènes réglementés < 1 dans le changement de pli log2.</li>
	<li>Utilisez le logiciel R pour dessiner la parcelle de volcan avec x: log2 changement de pli; y: -log10 (valeur p) pour montrer les gènes différentiels.<ol>
<li>Installer la bibliothèque R install.packages(library(calibrage))</li>
		<li>Lisez les données dans RStudio avec le programme suivant : res <-read.csv(« /Users/xxx.csv », en-tête=T) tête(rés) avec(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29 », xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0 »)) avec(sous-ensemble(res, pwue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pwtore), pch=19, col="red »)) avec(sous-ensemble(res, pwue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pwe), pch=19, col="blue »)) avec(sous-ensemble(res, pwue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444 »)) abline(h=1,3, lty=2) abline(v=1, lty=2) abline(v=(-1), lty=2)</li>
		<li>Exécutez la course pour obtenir le volcan Plot.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Sélection des gènes du conducteur
<ol><li>Sélectionnez Entrée de gène unique dans NetworkAnalyst.</li>
	<li>Copier et coller les gènes surexprimés sélectionnés du tableau 1 avec « humain » spécifié comme symbole génétique officielde type organisme et ID . REMARQUE : Sinon, utilisez Ensembl Gene ID pour copier-coller.</li>
	<li>Insérez les données en cliquant sur Télécharger et procéder à l’analyse à l’aide de l’interaction protéines-protéines (PPI) suivant l’IPP génétique.</li>
	<li>Utilisez la base de données string interactome avec une coupure de score de confiance de 900 pour montrer les gènes de semences qui relient les gènes téléchargés. Les gènes des graines associés à un plus grand nombre de gènes individuels ont été choisis comme gènes moteurs qui peuvent être impliqués dans le maintien de la formation de tumeurs dérivées de HT29. REMARQUE : Il existe trois ensembles de données interactives à utiliser : IMEx, STRING et Rolland. STRING contient des preuves expérimentales de confiance plus élevées. Avec des nombres de gènes téléchargés plus faibles, IMEx peut être sélectionné pour prédire et capter les gènes du conducteur dans les réseaux interactome.</li>
	<li>Sélectionnez Procéder dans la vue d’ensemble du mappage.</li>
	<li>Sélectionnez Blanc dans l’atlas d’arrière-plan et force dans le bouton Disposition.</li>
	<li>Sélectionnez PANTHER BP pour analyser le groupe de gènes upregulation. NOTE : Ceci montre que HSPA5 était responsable de l’anti-apoptose dans les tumeurs HT29-dérivées dans cette étude (Figure 3A). Pour affiner le champ fonctionnel spécifique, la classification KEGG, GO ou PANTHER peut être utilisée alternativement pour sélectionner les gènes de pilote spécifiques.</li>
</ol>

<ol><li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+colorectal+cancer%3A+incidence%2C+mortality%2C+survival%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Przegl%C4%85d+Gastroenterologiczny%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li>
<li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+colorectal+cancer+in+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Intestinal+Research%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia.</a> Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+expression+of+basic+transcription+factor+3+predicts+poor+survival+of+colorectal+cancer+patients%3A+possible+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved.</a> Cell Death & Disease. 10 (7), 509(2019).</li>
<li>Slattery, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li>
<li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERBB+receptors%3A+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li>
<li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERBB+network%3A+at+last%2C+cancer+therapy+meets+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149(2017).</li>
<li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41(2017).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer%2C+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li>
<li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma%3A+Clinicopathological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cell-targeted+treatment%3A+elimination+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li>
<li>Dallas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).</li>
<li>Chang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+induces+G9a+to+exacerbate+HER3+expression+for+the+survival+of+epidermal+growth+factor+receptor-tyrosine+kinase+inhibitors+in+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers.</a> BMC Cancer. 19 (1), 959(2019).</li>
<li>Catalano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+stem+cells+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer stem cells and cell death.</a> Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).</li>
<li>Piggott, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+inhibitor+c-FLIP+selectively+eliminates+breast+cancer+stem+cell+activity+in+response+to+the+anti-cancer+agent%2C+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL.</a> Breast Cancer Research. 13 (5), 88(2011).</li>
<li>Chung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+SHP-1+agonists%2C+SC-43+and+SC-78%2C+are+more+potent+than+regorafenib+in+suppressing+the+in+vitro+stemness+of+human+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells.</a> Cell Death Discovery. 4, 25(2018).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers%3A+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60(2018).</li>
<li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li>
<li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li>
<li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133%2C+CD44%2C+CD24%3A+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621(2014).</li>
<li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+for+statistical%2C+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome Medicine. 7 (1), 80(2015).</li>
<li>Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+as+a+Tool+to+Study+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).</li>
<li>Kanehisa, M., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+Mapper+for+inferring+cellular+functions+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences.</a> Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li>
<li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gene+Ontology+Resource%3A+20+years+and+still+GOing+strong%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+in+2013%3A+modeling+the+evolution+of+gene+function%2C+and+other+gene+attributes%2C+in+the+context+of+phylogenetic+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).</li>
<li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+3.0%3A+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li>
<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas de divulgation financière pertinente.

Dans cette étude, des tumeurs de tige de cancer cultivées ont été employées comme modèle dans l’analyse des données de RNAseq avec la bioinformatique disponible. Pour un modèle de maladie, des tumeurs HT29-dérivées ont été employées. Parce que les tumeurs ont une résistance aux médicaments contre les thérapies tumorales, le modèle établi peut être utilisé pour étudier les mécanismes détaillés de la résistance en étudiant les différences dans l’expression des gènes. En outre, la technologie génomique utilisant RNAseq avec...

Le cancer colorectal (CRC) est l’une des principales causes de décès avec une prévalence et une mortalité élevées dans le monde1,2. En raison de mutations et d’amplifications génétiques, les cellules cancéreuses se développent sans contrôle prolifératif, ce qui contribue à la survie cellulaire3, anti-apoptose4, et la stemness cancer5,6,7. Dans un tissu tumoral, l’hétérogénéité tumorale permet aux cellules tumorales de s’adapter et de survivre pendant les traitements thérapeutiques8. Les cellules souches cancéreuses (CSC), avec un taux plus élevé d’auto-renouvellement et de pluripotence que les types de cancer différentiel, sont principalement responsables de la récurrence tumorale9,10 et métastatique CRC11. Les CSC présentent plus de résistance aux médicaments12,13,,14 et propriétés anti-apoptose15,16, survivant ainsi les chimiothérapies tumorales.
Ici, afin d’étudier le mécanisme potentiel de stemness dans les cellules souches sélectionnées CRC, RNAseq a été exécuté pour dépister les gènes exprimés différemment dans les sphéroïdes de tumeur. Les cellules cancéreuses peuvent former des sphéroïdes (également appelés tumeurs) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de faible adhérence et stimulées par des facteurs de croissance ajoutés au milieu cultivé, y compris le FEM, le bFGF, le HGF et l’IL6. Par conséquent, nous avons sélectionné des cellules tumorales CRC HT29 qui résistent aux chimiothérapies avec une augmentation de STAT3 phosphorylé lorsqu’elles sont traitées avec de l’oxaliplatine et de l’irinotecon17. En outre, HT29 a exprimé des marqueurs de tige plus élevés lorsqu’ils sont cultivés dans les conditions de culture décrites. Le modèle CSC dérivé du HT29 exprimait des quantités plus élevées de récepteurs couplés à la protéine G riches en protéines de leucine 5 (LGR5)18, un marqueur spécifique des cellules souches CRC19,20. En outre, CD133, considéré comme un biomarqueur général pour les cellules souches cancéreuses, est également fortement exprimé dans la ligne cellulaire HT2921. Le but de ce protocole est de découvrir des groupes de gènes conducteurs dans les tumeurs de type tige du cancer établies basées sur des ensembles de données bioinformatiques plutôt que d’étudier les oncogènes individuels22. Il étudie les mécanismes moléculaires potentiels par l’analyse RNAseq suivie d’analyses bioinformatiques disponibles.
Le séquençage de prochaine génération est une méthode de séquençage de l’ADN à haut débit, facilement disponible et fiable basée sur l’aide informatique, utilisée pour examiner de manière exhaustive les gènes du conducteur pour guider les thérapies tumorales23. La technologie est également utilisée pour détecter l’expression des gènes à partir de la transcription inversée d’un échantillon d’ARN isolé24. Cependant, lors du dépistage avec RNAseq, les gènes les plus importants à cibler avec la thérapie peuvent ne pas avoir le différentiel d’expression le plus élevé entre les échantillons expérimentaux et témoins. Par conséquent, certaines bioinformatiques ont été développées pour classer et identifier les gènes basés sur des ensembles de données actuels tels que KEGG25, GO26,27, ou PANTHER28, y compris l’analyse des voies d’ingéniosité(IPA) 29 et NetworkAnalyst30. Ce protocole montre l’intégration de RNAseq et NetworkAnalyst pour découvrir rapidement un groupe de gènes dans les sphéroïdes sélectionnés dérivés de HT29 par rapport aux cellules parentales HT29. L’application de cette méthode à d’autres modèles de la maladie est également suggérée pour découvrir des différences dans les gènes importants.
Par rapport à l’étude de l’expression génique individuelle, une technique à haut débit offre des avantages pour trouver des gènes conducteurs potentiels facilement pour la médecine de précision tumorale. Avec des ensembles de données utiles tels que KEGG, GO, ou PANTHER, des gènes spécifiques peuvent être identifiés en fonction des modèles de la maladie, des voies de signalisation, ou des fonctions spécifiques, ce qui permet de se concentrer rapidement sur des gènes spécifiques et importants, ce qui permet d’économiser du temps et des coûts de recherche. Une application similaire est utilisée dans les études précédentes14,18,31. En particulier, une tumeur est plus compliquée parce que différents types de tumeurs expriment des gènes distinctifs et des voies de survie et de prolifération. Par conséquent, ce protocole peut détecter des gènes distinguant différents types de tumeurs dans des circonstances différentes. Il est possible de trouver des stratégies efficaces contre les cancers en comprenant le mécanisme de l’expression spécifique des gènes.

<table><tbody><tr><td>Système d’imagerie cellulaire numérique iRiS</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>pour l’observation de la formation des sphères tumorales</td></tr><tr><td>Cytométrie en flux</td><td>BD biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>pour la détection du LGR5 et du CD133 dans les sphères tumorales</td></tr><tr><td>Anti-LGR5-PE</td><td>Biolegend</td><td>373803</td><td>Réactif de détection LGR5</td></tr><tr><td>Anti-CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>Détection CD133 réactif</td></tr><tr><td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td><td>pour la culture de sphères tumorales</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td><td>pour la culture de sphères tumorales</td></tr><tr><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td><td>pour la culture de sphères tumorales</td></tr><tr><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td><td>pour la culture de sphères tumorales Kit d’extraction d’ARN</td></tr><tr><td>PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>12183025</td><td>isolat ARN total pour l’analyse RNAseq</td></tr><tr><td>Performance RNAseq</td><td>Biotools, Taiwan</td><td></td><td>L’analyse RNAseq est effectuée commétralement par Biotools, Ttaiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, Université McGill, Montréal, Québec, Canada</td><td></td><td>http://www.networkanalyst.ca/</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>un logiciel d’analyse statistique</td></tr></tbody></table>

découverte des gènes conducteurs dans les tumeurs de tige de tige de cancer de ht29-dérivées

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Les cellules souches cancéreuses jouent un rôle vital contre les thérapies cliniques, contribuant à la rechute tumorale. Il y a beaucoup d’oncogènes impliqués dans la tumorigenèse et l’initiation des propriétés de tige de cancer. Puisque l’expression de gène dans la formation des tumeurs cancéreuses côloresphères cancéreuses côlores est peu claire, il faut du temps pour découvrir les mécanismes fonctionnant sur un gène à la fois. Cette étude démontre une méthode pour découvrir rapidement les gènes moteurs impliqués dans la survie des cellules souches du cancer colorectal in vitro. Les cellules cancéreuses colorectales HT29 qui expriment le LGR5 lorsqu’elles sont cultivées sous forme de sphéroïdes et accompagnent une augmentation des marqueurs de stemness CD133 ont été sélectionnées et utilisées dans cette étude. Le protocole présenté est utilisé pour effectuer RNAseq avec la bioinformatique disponible pour découvrir rapidement les gènes conducteurs surexprimés dans la formation de tumeurs côlores de tige HT29-dérivées. La méthodologie peut rapidement dépister et découvrir les gènes conducteurs potentiels dans d’autres modèles de maladies.

Pour établir le modèle d’étude du mécanisme dans les cellules souches cancéreuses, des cellules ht29 colorectales ont été employées pour la culture des tumeurs de tige-comme de cancer in vitro dans une plaque à faible attachement contenant B27, EGF, bFGF, HGF, et IL6. Les tumeursphères &gt;100 μm de diamètre ont été formées en 7 jours (Figure 1A). Les tumeursphéres ont été trypsinized aux cellules simples et analysées utilisant la cytométrie de flux pour détecter l’expression de LGR5 et DE C...

Présenté ici est un protocole pour découvrir les gènes conducteurs surexprimés maintenant les cellules souches du cancer établies dérivées des cellules HT29 colorectal. RNAseq avec la bioinformatique disponible a été exécutée pour étudier et examiner des réseaux d’expression de gène pour élucider un mécanisme potentiel impliqué dans la survie des cellules de tumeur ciblées.

Découverte des gènes conducteurs dans les tumeurs de tige de tige de cancer de HT29-dérivées

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Notre protocole a utilisé l’ARN-Seq et les outils bioinformatiques pour découvrir rapidement les gènes conducteurs surexprimés qui contribuent à la formation de tumeurs colorectales en forme de tige. Ce protocole est utilisé pour dépister un gène et des voies de signal exprimés différemment afin d’étudier un mécanisme moléculaire de la stemness du cancer dans un cancer colorectal sélectif. Le septième jour de la culture, utilisez un microscope inversé avec un système d’imagerie cellulaire numérique pour observer et mesurer le diamètre des tumorsphère.Lorsque les tumorspheres atteignent un diamètre supérieur à 100 micromètres, traiter la culture avec 0,25% trypsine. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, neutraliser la trypsine avec deux fois le volume du milieu de croissance et compter les cellules à l’aide d’un hémomètre. Recueillir les cellules par centrifugation.Et résuspendez la pastille à cinq fois 10 aux quatre cellules pour 100 microlitres de concentration moyenne. Ajouter deux microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt à chaque tube et incuber les cellules pendant 30 minutes à température ambiante et 200 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, laver chaque tube avec 900 microlitres de PBS et analyser les cellules pour l’expression de la protéine d’intérêt par cytométrie de flux selon les protocoles standard.Pour l’isolement d’ARN après la collection de trypsine comme juste démontré, résuspendez les cellules à deux fois 10 aux cinquièmes cellules par 50 microlitres de concentration de PBS et lyse chaque échantillon avec 200 microlitres de tampon de lyse complétés avec deux microlitres de bêta mercaptoethanol par tube. Après un bref vortex et une incubation de cinq minutes à température ambiante, recueillir les lysates par centrifugation et ajouter 200 microlitres de 70% d’éthanol à chaque tube. Transférer les échantillons dans des colonnes rapides et retirer le solvant par centrifugation.Lavez les échantillons avec 400 microlitres de solution de lavage une et 600 microlitres de solution de lavage deux pour éliminer complètement tout non-ARN par centrifugation, suivie d’une centrifugation supplémentaire de deux minutes dans les mêmes conditions de centrifugeuse pour éliminer tout éthanol résiduel. Puis resuspendez les granulés dans 50 microlitres d’eau distillée par tube et centrifugez l’échantillon pendant une minute avant de recueillir l’ARN contenant des supernatants. Étudier l’expression différentielle du gène entre les cellules tumorales par rapport aux cellules tumorales parentales après analyse du séquençage de l’ARN.Sélectionnez les gènes avec un changement de pli de plus d’un à moins un log2 avec des comptes de lecture supérieurs à 100 dans la tumorsphère et les groupes parentaux. Et utilisez les commandes comme indiqué. Pour obtenir une parcelle volcanique des données pour déterminer l’expression différentielle du gène.Pour la sélection des gènes d’entraînement chez l’analyste réseau, sélectionnez l’entrée unique du gène et copiez et coller les gènes surexprimés sélectionnés avec l’homme spécifié comme l’organisme et le symbole génétique officiel comme type d’identification. Cliquez sur Télécharger et procéder. Pour insérer et analyser les données à l’aide de l’interaction protéine-protéine, après interaction protéine-protéine génétique, utilisez la base de données interactome STRING avec un score de confiance coupé de 900 pour montrer les gènes des graines.Relier les gènes téléchargés. Les gènes de semence s’associant à des gènes plus individuels peuvent être sélectionnés comme gènes conducteurs qui peuvent être impliqués dans le maintien de la formation de la tumorsphère. Sélectionnez Procéder dans la vue d’ensemble de cartographie blanc dans l’arrière-plan et l’atlas de force dans le bouton Mise en page.Sélectionnez ensuite la paire de base PANTHER pour analyser le groupe génétique d’upregulation. Tumorspheres de plus de 100 micromètres de diamètre se forment dans les sept jours de la culture. L’analyse cytométrique de flux indique une augmentation de l’expression de LGR5 et de CD133 dans les tumeurs HT29-dérivées comparées aux cellules parentales de HT29.Après séquençage de l’ARN, les gènes ayant un changement plus important d’un pli log2 dans leur réglementation à la hausse ou à la baisse avec une valeur P inférieure à 0,05 déterminée par la carte thermique peuvent être tracés pour distinguer les gènes significatifs entre les tumeurs dérivées de HT29 et les cellules parentales HT29. Dans cette expérience représentative, l’analyse des gènes upregulated avec plus d’un pli log2 a abouti à 10 gènes de semences, reliant les réseaux génétiques. L’analyse de paire de base panther a indiqué que deux gènes ont été associés à la régulation négative de l’apoptose.En outre, les gènes choisis ont été par conséquent validés par PCR quantitatif confirmant leur expression accrue dans les tumeurs HT29-dérivées. La sélection différentielle des gènes est l’étape la plus importante des procédures. N’oubliez pas d’utiliser un changement de pli log2 supérieur à un avec des recomptages supérieurs à 100 comme critères.En utilisant ce protocole, les gènes sélectionnés parmi les tumeurs dérivées du colorectal peuvent être renversés ou surexprimés pour découvrir leurs rôles potentiels dans la formation de tumorsphère.

discovery-driver-genes-colorectal-ht29-derived-cancer-stem-like

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment...

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Les dosages de sphères in vitro sont couramment utilisés pour identifier les cellules souches cancéreuses. Ici, nous comparons les dosages à sphère unique et à plusieurs cellules. Les tests basés sur des cellules uniques plus laborieux ou la supplémentation en méthylcellulose donnent des résultats plus précis, tandis que les tests multicellulaires effectués en milieu liquide peuvent être fortement influencés par la densité cellulaire.

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Comprendre le rôle des cellules souches cancéreuses dans la récidive tumorale et la résistance aux thérapies est devenu un sujet de grand intérêt au cours de la dernière décennie. Cet article décrit l’isolement et la caractérisation de la sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC).

Isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Utilisant des tumeurs provenant de patients dans un modèle préclinique sous-cutanée est une excellente façon d'étudier l'efficacité de nouvelles thérapies, la découverte de biomarqueurs prédictifs et les voies résistantes aux médicaments. Ce modèle, dans le processus de développement de médicaments, est essentielle pour déterminer le sort de nombreuses thérapies anticancéreuses avant investigation clinique.

Développement et maintenance d&#39;une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l&#39;enquête de Novel Anti-Cancer Therapies

Nous décrivons l'établissement de tumeurs colorectales orthotopiques par injection de cellules tumorales ou organoïdes dans le cécum des souris et l'isolement subséquent des cellules tumorales circulantes (CTC) de ce modèle.

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Un protocole pour l'établissement d'un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal par une infection segmentaire adeno-cre et sa surveillance par coloscopie à haute résolution est présentée.

Un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal sporadique

Nous décrivons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules tumeur-initiatrices des xénogreffes patient-dérivées humaines par le tri de cellules fluorescence-activé, utilisant l'antigène humain de leucocyte-1 (HLA-1) comme marqueur négatif, et pour la validation plus loin et caractérisation de ces cellules HLA-1-négatives de tumeur-initiateur.

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

Pour permettre une détection très sensible de la diffusion du cancer colorectal humain cellules (CRC) qui colonisent les tissus, nous montrons ici un protocole pour la transduction efficace des Particules Lentivirales protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules organoïde CRC PDX-dérivés avant leur injection à des souris bénéficiaires, avec l’observation au microscope stéréo-fluorescence.

Haute sensibilité détection des micrométastases générés par GFP Lentivirus-transduites organoïdes cultivé à partir d’une tumeur du côlon dérivé de Patient

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.

Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient

Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Découvrez l'identification des gènes conducteurs surexprimés dans les cellules souches cancéreuses colorectales HT29 par RNA-Seq et bioinformatique. Cette méthode révèle les mécanismes moléculaires de la tumorigénèse.

Découverte des gènes conducteurs dans les tumeurs de tige de tige de cancer de HT29-dérivées

Explorer plus de vidéos