Modèle alvéolaire humain multicellulaire composé de cellules épithéliales et de cellules immunitaires primaires pour l’évaluation des risques

Ces modèles audio humains individuels utilisent les cellules immunitaires pertinentes comme un outil puissant pour prédire la réponse immunitaire aiguë des substances, y compris les nanomatériaux et les médicaments de connaissance. Ces cellules médicales combinent les cellules épithéliales humaines et les cellules immunitaires primaires humaines pour évaluer ces réactions spécifiques. L’utilisation de monocytes frais et congelés offre une flexibilité pour le plan d’expérimentation.

De nombreuses études ont montré que ce modèle peut fournir un aperçu de la communication interstellaire entre un sens du comportement et le sens immunitaire. Comme cette démonstration comprend tous les détails importants pour studing le modèle un trait personnel dans la culture cellulaire, des instructions visuelles pour reproduire des expériences. Plusieurs étapes du protocole de la vessie sont complexes et nécessitent une manipulation spéciale.

Par conséquent, ils sont démontrés avec tous les détails requis qu’ils peuvent être facilement suivis. Pour l’isolement des monocytes sanguins périphériques des manteaux buffy humains, diviser la récolte Buffy contenu sac manteau, uniformément entre 250 millilitres tubes coniques. Apportez soigneusement le volume total dans chaque tube de 250 millilitres avec PBS et mélangez les tubes avec trois inversions douces.

Ensuite, divisez la solution PBS manteau Buffy également entre quatre nouveaux tubes de 50 millilitres, puis ajouter 10 microlitres de CD 14 perles magnétiques positives les septièmes cellules totales au tube et bien mélanger par pipetting. Au moment du remplissage, détachez la pipette du pipetter et branchez immédiatement l’ouverture supérieure de la pipette avec un pouce, puis placez la pipette remplie au bas d’un tube et débranchez l’ouverture de la pipette pour permettre au gradient de densité moyen de circuler lentement sous le mélange de PBS de manteau bouffi, jusqu’à ce qu’un millilitre du milieu de gradient de densité soit laissé à l’intérieur de la pipette. Lorsque le milieu de gradient de densité a été ajouté à chaque tube de la même manière séparer les cellules par centrifugation gradient de densité et utiliser une pipette sérologique pour recueillir le blanc de deux à trois millimètres d’épaisseur couche cellulaire mononucléaire périphérique de sang entre le plasma et le gradient de densité couches moyennes.

La meilleure façon de connecter la couche est d’enlever le plasma d’abord, puis vous supprimez nos pipettes logiques pour recueillir les cellules. Tirez les cellules mononucléaires périphériques de sang de chaque ensemble de deux tubes dans un nouveau tube de 50 millilitres et lavez les cellules deux fois avec un volume total de 50 millilitres de PBS frais par lavage. Puis jeter supernatant et resuspendre la pipette dans chacun en cinq millilitres de PBS frais et mettre en commun les suspensions cellulaires dans un seul tube pour le comptage.

Après comptage, centrifugez les cellules à nouveau et résuspendez la pelette à 80 millilitres de tampon de séparation magnétique par s’occuper des septièmes cellules. Ajoutez ensuite 10 microlitres de perles magnétiques positives CD 14 par présence des septièmes cellules totales au tube et mélangez bien par pipetting. Après une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius rincer une colonne magnétique avec trois millilitres de tampon de séparation magnétique et ajouter les cellules à la colonne.

Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon par lavage et transférez la colonne dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de tampon de séparation magnétique frais. Ensuite, utilisez le piston et cinq millilitres de tampon pour rincer les cellules CD 14 positives dans le tube. Induisez la différenciation de la perle magnétique isolée CD 14 cellules positives.

Tout d’abord, resuspendre les cellules à une fois assister à la concentration de six cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire. Ou la différenciation mddc, ajouter 10 nanogrammes par millilitre de et de granula site macrophage colonie facteur stimulant au tube et ajouter trois millilitres de cellules à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits, ou différenciation MDM ajouter 10 nanogrammes par millilitre de macrophage colonie facteur stimulant pour les cellules et plaquer les cellules comme vient de le démontrer. Pour mettre en place un modèle de co-culture de cellules épithéliales alvéoles humaines, transférez d’abord 1,5 millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffée dans le nombre approprié de puits d’une plaque de puits de 12 puits et placez un insert de culture cellulaire dans chaque puits.

Ajouter ensuite 500 microlitres de suspension cellulaire épithéliale à une densité de cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans le côté apical de chaque insert et couvrir la plaque pour une incubation de quatre jours dans l’incubateur de culture cellulaire. Ou l’ensemencement MDDC remplace le supernatant des puits de six plaques de puits utilisées pour la différenciation mddc, par un millilitre de milieu de culture cellulaire chaude fraîche et utiliser un grattoir cellulaire pour détacher les cellules d’adhérence de chaque puits. Lavez chaque puits trois fois avec le superné et dans chaque puits et combinez toutes les solutions cellulaires en un seul tube de centrifugeuse.

Le MDDC récolté par centrifugation et pinces stériles pour placer les inserts des 12 plaques de puits à l’envers dans une boîte de Pétri stérile. Gratter les cellules épithéliales du côté basal de l’insert et résuspendre les MDDC dans le milieu de culture cellulaire fraîche faire une concentration de 4,2 fois 10 de ces cellules par millilitre. Ajouter ensuite 150 microlitres de cellules sur chaque insert afin que toute la surface basale de l’insert soit également recouverte du liquide sans bulles.

Pour l’ensemencement mddm après la récolte des MDDM différenciés comme démontré pour les MDDC, diluer les cellules à un 2,5 fois 10 aux quatre cellules par millilitre de concentration moyenne de culture cellulaire fraîche et ajouter 500 microlitres de cellules sur la paroi de chaque cellule épithéliale et MDDC contenant insert culture cellulaire, puis placer le couvercle sur la plaque et placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain aspirer le surnatant à la fois des zones apical et basales de chaque insert de culture cellulaire et Wells. Ensuite, vous stérilisez les pinces à épiler pour soulever les inserts des puits et ajouter 600 microlitres d’avant-guerre frais à la culture cellulaire moyenne à chaque puits.

Après six jours de différenciation, les MDM apparaissent de forme ronde tandis que les MDDC forment des grappes composées de cellules à forme plus allongée et de saillies observables. Après trois jours de croissance sur les inserts membranaires, les cellules épithéliales forment une augmentation dense Une augmentation significative de la libération de déshydrogénase lactate est observée dans le milieu de culture cellulaire du compartiment basal lors de l’exposition à un contrôle positif de la rupture de la membrane, prouvant la réactivité du modèle à une substance cytotoxique. Aucune augmentation de la libération de déshydrogénase de lactate comme mesurée sur la stimulation apical avec TNF alpha ou LPS.

Des augmentations statistiquement significatives de la libération d’IL6 et d’IL8 sont observées dans les échantillons traités par alpha LPS et TNF par rapport aux cellules non traitées témoins. Aucune différence dans la morphologie cellulaire n’est observée entre les modèles de co-culture utilisant des MDDM et des MDDC des monocytes sanguins périphériques frais comparés à ceux utilisant des cellules décongelées dans la co-culture exposée alpha de LPS et de TNF, une couche épithéliale perturbée a été observée. Il est possible d’utiliser d’autres types de cellules humaines telles que les voies respiratoires ou les cellules bronchiolar, d’autres points finaux peuvent également être analysés.

Principalement les chercheurs ont été inspirés par cette technique en utilisant un similaire à mettre en place, mais avec différents types de cellules.