Modèle de cardiopathie ischémique et comparaison vidéo de la contraction cardiomyocyte à l’aide de cardiomyocytes dérivés de hiPSC
5 mai 2020
Nous présentons un modèle de maladie cardiaque ischémique utilisant des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, avec une méthode pour l’évaluation quantitative des dommages tissulaires causés par l’ischémie. Ce modèle peut fournir une plate-forme utile pour le dépistage des médicaments et la recherche sur les maladies cardiaques ischémiques.
La recherche sur les maladies cardiaques est souvent effectuée chez les petits mammifères comme les rongeurs. Cependant, la physiologie du cœur humain diffère considérablement de celle du cœur des rongeurs. Notre protocole utilise des cardiomyocytes différenciés des cellules iPS humaines pour modéliser les cardiopathies ischémiques et quantifier les dommages et l’affaiblissement fonctionnel des cardiomyocytes ischémiques.
Ce protocole peut fournir une méthode pratique pour le dépistage personnalisé des médicaments à l’aide de cellules iPS dérivées de patients individuels, la manipulation appropriée des cellules iPS, comme dans l’utilisation d’un milieu frais, et le changement du milieu lentement et ponctuellement est essentiel pour assurer une différenciation réussie en cardiomyocytes fonctionnels. Chen Wang, doctorant d’un laboratoire, démontrera la procédure avec Yun Liu, Yin Liang et Mengxue Wang. Pour induire la différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules cardiaques, enduire d’abord les puits d’une plaque de culture de puits de 96 avec 100 microlitres de 1.675 microgrammes par millilitre de laminine dans PBS.
Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, voir trois fois 10 à la quatrième cellules souches dans 200 microlitres de milieu de maintenance IPS complété par 10 micromolaires Y27632 dans chaque puits, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, remplacer les super moyens par 200 microlitres de milieu de croissance IPS par puits, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pour deux à trois jours supplémentaires. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80%confluency.
Remplacez le milieu de chaque puits par 200 microlitres de milieu de différenciation préchauffé A et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 48 heures. À la fin de l’incubation a lentement remplacé le supernatant dans chaque puits avec 200 microlitres de préchauffé milieu de différenciation B et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après deux jours, remplacer les supernatants par 200 microlitres de milieu d’entretien des cardiomyocytes préchauffés par puits et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pour un temps jusqu’à 30 jours.
Pour évaluer la contractilité des cardiomyocytes, installez l’image de velocimétrie d’image de particule j plugin et utilisez un microscope de contraste de phase et l’objectif de fourches pour enregistrer des images vidéo des cellules à environ 20 images par seconde pendant environ 10 secondes. Enregistrez ensuite le fichier vidéo tel qu’analysé notre API et créez une structure de dossier comme indiqué. Pour analyser les champs vectoriels bidimensionnels discrets du déplacement cellulaire, lancez VG et sélectionnez des plugins, des macros et modifiez pour ouvrir l’analyse vectorielle.
ijm, puis cliquez sur exécuter l’analyse sera effectuée automatiquement. Pour le traitement ischémique, remplacer le supernatant dans chaque puits par 200 microlitres de dmem sans glucose et sérum, puis placer la plaque dans une chambre hypoxique puis infuser le gaz azoté dans la chambre, en maintenant la concentration interne d’oxygène à 2% et la concentration de dioxyde de carbone à 5% pendant 24 heures. Les cellules différenciées avec succès, démontre la contraction spontanée comme observé sous le microscope avec 50% des puits de culture présentant typiquement la contraction spontanée en moins de 20 jours.
La protéine de marqueur cardiaque peut également être employée pour confirmer une différenciation réussie Cellules du groupe ischémique montrent typiquement une viabilité inférieure dans des analyses de MTT, et une contractilité inférieure que ceux du groupe témoin normoxique. Le rapport des cellules positives d’iodure de propidium est également plus élevé dans le groupe ischémique, que dans le groupe témoin, indiquant une incidence plus élevée des dommages cellulaires. Il est important que vous localisez avec précision les régions d’intérêt dans la plaque de capture pour permettre la comparaison de la contractilité des cardiomyocytes.
Cette technique peut être utilisée pour le dépistage des médicaments, en utilisant des cellules iPS dérivées du patient. Il fournit également une plate-forme unique pour élucider davantage les mécanismes sous-jacents aux maladies cardiaques ischémiques
Aperçu
Cet article présente un protocole de modélisation de la maladie cardiaque ischémique à l'aide de cardiomyocytes différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS-CMs). La méthode permet la quantification des lésions cellulaires et des troubles fonctionnels dans des conditions ischémiques, offrant ainsi une plateforme cliniquement pertinente pour la recherche sur les maladies cardiaques et le criblage personnalisé de médicaments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Recherche cardiovasculaire
- Biologie des cellules souches
- Physiologie cellulaire
Contexte
- La maladie coronarienne est l'une des principales causes de mortalité dans le monde.
- Les modèles rongeurs sont couramment utilisés, mais diffèrent considérablement de la physiologie cardiaque humaine.
- Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines offrent un modèle plus pertinent pour l'étude des maladies cardiaques humaines.
- Il existe un besoin de plateformes permettant à la fois la modélisation des maladies et le criblage de médicaments dans un contexte humain.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole pour différencier les cellules iPS humaines en cardiomyocytes.
- Modéliser la maladie cardiaque ischémique in vitro à l'aide de CM-iPS-h.
- Quantifier les lésions cellulaires et l'altération fonctionnelle dans des conditions ischémiques.
Méthodes utilisées
- Différenciation de cellules iPS humaines en cardiomyocytes à l'aide de milieux de culture séquentiels et de plaques revêtues de laminine.
- Induction d'un état d'ischémie en exposant les CM-iPS-h à 2 % d'oxygène et à un milieu sans glucose ni sérum pendant 24 heures dans une chambre hypoxique.
- Évaluation de la viabilité cellulaire par des tests au MTT et une coloration à l'iodure de propidium.
- Mesure de la contractilité par analyse du champ vectoriel de déplacement à l'aide de la microscopie de contraste de phase et d'un logiciel de vélocimétrie par images de particules.
Résultats principaux
- Les conditions ischémiques ont augmenté le pourcentage de cellules lésées, comme en témoigne une coloration plus intense par l'iodure de propidium.
- La viabilité cellulaire a diminué dans le groupe ischémique par rapport aux témoins.
- La contractilité des CM-iPS-h a été réduite dans des conditions ischémiques.
- Environ 50 % des puits de culture ont présenté une contraction spontanée dans les 20 jours suivant la différenciation.
Conclusions
- Le protocole fournit un modèle in vitro robuste de la maladie cardiaque ischémique utilisant des cardiomyocytes d'origine humaine.
- Ce système permet la quantification des lésions cellulaires et des troubles fonctionnels.
- Le modèle est adapté au criblage personnalisé de médicaments ainsi qu'à des études mécanistiques approfondies de la maladie cardiaque ischémique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les modèles de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines comblent l'écart translationnel entre les études sur rongeurs et les maladies cardiaques humaines, permettant une découverte plus prédictive en phase précoce pour les maladies coronariennes. L'analyse quantitative de la contractilité par vidéo et les tests de viabilité fournissent des données exploitables pour la validation des cibles et l'évaluation mécanistique des risques. Cette plateforme soutient les décisions de portefeuille ajustées au risque et les stratégies de criblage personnalisé de médicaments en recherche et développement cardiovasculaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier les mécanismes des lésions ischémiques dans un système pertinent pour l'humain.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles grâce à des mesures quantitatives de la contractilité et de la viabilité.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en modélisant les réponses cellulaires pertinentes pour la maladie.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le tri précoce des portefeuilles dans les programmes cardiovasculaires.
Développement de tests et de criblages
- Propose une plateforme normalisée de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines pour une évaluation reproductible de composés.
- Fournit des paramètres quantitatifs de contractilité grâce à l'analyse du champ vectoriel de déplacement.
- Permet un criblage évolutif fondé sur la vidéométrie pour détecter un dysfonctionnement dans des conditions ischémiques.
- Facilite la préparation des tests en vue de criblages pharmacologiques et d'études mécanistiques ultérieures.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec la biologie des maladies humaines pour assurer une continuité translationnelle.
- Permet l'utilisation de cellules dérivées de patients pour l'analyse personnalisée de la réponse aux médicaments.
- Réduit la dépendance aux modèles non humains, améliorant ainsi la pertinence des données précliniques par rapport à la maladie.
- Facilite la découverte et la validation de biomarqueurs dans un contexte cliniquement pertinent.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce modèle d'ischémie à base de cardiomyocytes dérivés de CIPSh comble le fossé entre la découverte précoce, l'identification de candidats thérapeutiques et la recherche translationnelle en fournissant des critères d'évaluation fonctionnels et de viabilité spécifiques aux humains.
- Biologie de la découverte : Quantifie les lésions ischémiques et le dysfonctionnement contractile pour les tests d'hypothèses et l'analyse de voies biologiques.
- Tri de composés : Fournit des mesures reproductibles et quantitatives de la contractilité et de la viabilité pour le tri de composés.
- Analytique : Intègre l'analyse de déplacement basée sur la vidéo et les tests de viabilité pour des comparaisons statistiques robustes.
- Recherche translationnelle : Permet la modélisation personnalisée selon les patients et soutient l'alignement des biomarqueurs avec les critères cliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable et évolutible pour la découverte de médicaments cardiovasculaires et les études mécanistiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Normalise les tests fonctionnels et soutient des flux de travail évolutifs et reproductibles.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon et améliore l'efficacité du capital en réduisant les risques biologiques en phase tardive.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une progression des actifs cardiovasculaires ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la culture des hiPSC, la différenciation et la validation des marqueurs cardiaques.
- Exige un accès à des chambres hypoxiques, à une microscopie en contraste de phase et à un logiciel d'analyse vidéo.
- Implique une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité des tests et la comparabilité des données.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les lignées d'iPSC dérivées de patients ou les sous-types de maladies.
- Une sélection rigoureuse de la région d'intérêt est essentielle pour une comparaison précise de la contractilité.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
