Méthode à haut débit pour mesurer le temps de sédation de l’alcool du mélanogaster individuel de Drosophila

Drosophila fournit un excellent modèle pour étudier les fondements génétiques de la sensibilité à l’alcool parce que vous pouvez quantifier la sensibilité à l’alcool précisément dans des milieux génétiques contrôlés et des conditions environnementales. Méthodes actuelles pour mesurer la sensibilité à l’alcool chez les groupes d’essai de mouches drosophiles. Nous présentons une méthode simple, peu coûteux et à haut débit pour évaluer la sensibilité à l’alcool chez un grand nombre de mouches simples.

La variation de la sensibilité à l’alcool chez Drosophila peut se traduire par des phénotypes similaires chez l’homme parce que les mouches partagent environ 75% de leurs gènes avec des orthologs humains. L’analyse que nous avons développée peut également être appliquée pour mesurer les effets de la toxicité aiguë des substances volatiles sur d’autres insectes, y compris d’autres espèces de mouches ou vecteurs de maladies. Commencez par créer un modèle en carton d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits.

Tracez autour de la plaque et découpez la zone désignée. Ensuite, utilisez le modèle en carton pour créer un morceau de maillage petit écran d’insecte de la taille de la plaque. Placez une petite ligne de colle chaude autour du périmètre d’une plaque de culture de 24 puits, et fixez le maillage d’écran sur le dessus des puits.

Ensuite, utilisez le pistolet à colle chaude pour fixer un bâton d’artisanat en bois à trois côtés de la plaque de culture. Préparez autant d’assiettes que possible dans la salle de tournage. Pour créer la chambre de tournage, couper un trou de la taille de l’objectif de la caméra vidéo d’un côté d’une boîte en polystyrène et une fente supplémentaire sur la taille de la garniture d’éclairage sur le côté opposé.

Insérez le tampon d’éclairage dans la fente et placez l’appareil photo dans le trou de l’objectif au-dessus de la garniture d’éclairage. Placez tous les matériaux d’essai dans un environnement contrôlé, de préférence une chambre comportementale avec environ 30% d’humidité, 25 degrés Celsius de température, un débit d’air uniforme et des niveaux de bruit inférieurs à 65 décibels. Utilisez le modèle en carton précédemment fabriqué pour couper deux morceaux de toile de fromage.

Puis pipette un millilitre de 100% éthanol à travers le maillage de l’écran dans chaque puits. Séchez le maillage et placez les deux morceaux de toile à fromage sur le dessus. Coupez un petit morceau de planche à découper mince, flexible et en plastique en utilisant le modèle en carton comme guide pour agrandir la zone d’un à deux centimètres sur l’un des côtés courts.

Après la coupe, assurez-vous que le plastique s’adapte toujours entre les trois bâtons d’artisanat en bois sur l’appareil d’essai, mais se bloque d’une extrémité. Préparez un aspirateur selon les instructions manuscrites, et utilisez-le pour transférer une mouche par puits dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits, couvrant tous les puits avec des mouches précédemment aspirées avec le plastique flexible. Enregistrez la position du puits et toute information pertinente sur le génotype ou le phénotype de chaque mouche.

Maintenez la chasse d’eau en plastique flexible avec le dessus de la plaque de culture cellulaire contenant les mouches, et inverser la plaque sur le dessus de la plaque de culture cellulaire modifiée avec l’éthanol. Utilisez les bâtons d’artisanat pour aligner la plaque de culture cellulaire inversée, en s’assurant que chaque puits avec de l’éthanol s’aligne avec chaque puits contenant une mouche. Assurez-vous que le tampon d’éclairage est allumé à pleine luminosité, et commencer à enregistrer avec la caméra vidéo.

Exposez les mouches à l’éthanol en enlevant soigneusement le plastique entre les deux assiettes, en vous assurant de ne pas déloger la toile à fromage. Lorsqu’on soupçonne que toutes les mouches ont perdu le contrôle postural, tapez fermement au centre de la plaque. S’il y a du mouvement, continuez à enregistrer, en tapant toutes les une à deux minutes jusqu’à ce qu’aucun mouvement ne se produise.

Terminez l’enregistrement une fois qu’il n’y a pas de mouvement. Pour récupérer les mouches, retirez la plaque supérieure de l’appareil d’essai et aspirez les mouches individuelles dans les contenants choisis. Remplacez l’éthanol dans les plaques de culture cellulaire modifiée au moins une fois par heure pour maintenir une exposition constante à l’éthanol tout au long de l’analyse, et répétez l’expérience pour autant d’échantillons que vous le souhaitez.

Regardez l’enregistrement vidéo pour déterminer le temps de sedation à la mouche, qui est défini comme le moment où une mouche perd le contrôle postural et la capacité locomotrice. Pour assurer la précision, regardez le film à l’envers et enregistrez le temps que la mouche commence à se déplacer. Cette méthode peut être utilisée pour générer des données sur un grand nombre de mouches dans les 10 minutes.

Deux plaques de 24 puits ont été utilisées pour mesurer simultanément les temps de sedation de l’éthanol pour 48 mouches individuelles de deux lignées DGRP avec des sensibilités différentes à l’alcool. Les grandes tailles d’échantillon augmentent la précision et réduisent l’erreur à la variation environnementale. RAL_555 mouches étaient moins sensibles que les mouches RAL-177.

Les mâles et les femelles de RAL_177 n’ont montré aucun effet sexuellement dimorphique, tandis que les femelles de la lignée RAL_555 étaient moins sensibles à l’exposition à l’éthanol que les mâles. Lorsque vous essayez ce protocole, il est crucial d’effectuer l’aspiration des mouches et l’inversion de la plaque de culture cellulaire avec précision pour atteindre le résultat souhaité. Étant donné que la capacité d’évaluer les mouches individuelles évite les effets confusionnels dus aux interactions de groupe, cet essai améliore l’utilité du modèle Drosophila pour les études à haut débit sur les effets aigus de l’exposition à l’alcool.