Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

Lors d'épidémies provoquées par des arbovirus, les mesures de lutte sont largement limitées à la réduction des populations de moustiques. Les analyses de compétence vectorielle constituent donc des stratégies préventives essentielles, car elles permettent de déterminer quelles populations et espèces de moustiques peuvent agir comme vecteurs pour un arbovirus donné, et doivent par conséquent faire l'objet de mesures ciblées. Ainsi, l'une des composantes les plus importantes de notre boîte à outils pour évaluer le rôle des moustiques, ainsi que d'autres vecteurs, dans la transmission des maladies infectieuses, est l'étude de la compétence vectorielle. Il s'agit d'expériences dans lesquelles nous pouvons contrôler très précisément non seulement l'espèce de moustique ou de tique, par exemple, mais aussi les souches géographiques, ainsi que des souches très spécifiques de virus différents ou d'autres organismes infectieux, afin d'obtenir des données très précises et rigoureusement contrôlées sur le risque que différentes espèces transmettent divers agents pathogènes dans des régions bien spécifiques du monde. Le travail avec des moustiques infectés exige des installations dédiées, une formation, une expérience et une planification minutieuse afin de minimiser les risques pour l'expérimentateur, ainsi que le risque de libération accidentelle d'un moustique infecté. Il est donc particulièrement important que les nouveaux venus dans ces installations prennent le temps de travailler avec des moustiques alimentés au sang non infecté, afin de se familiariser avec les techniques et les flux opérationnels.

Le jour de l'exposition, allumez la source d'alimentation dans une installation de contention d'arthropodes afin de préchauffer les unités d'alimentation. Mélangez du sang humain fraîchement recueilli, anticoagulé à l'oxalate ou à l'héparine, avec un stock viral selon un rapport volumétrique de un pour un, puis recouvrez une unité standard de réservoir de trois millilitres avec la peau d'une souris naïve non infectée. Placez le réservoir couvert sur du papier essuie-tout blanc, puis ajoutez environ deux millilitres de sang infectieux au réservoir, un millilitre à la fois.

Ensuite, inspectez à l’aide de serviettes en papier pour confirmer l’absence de fuite. 24 heures avant de réaliser le test infectieux, préparez des plaques de culture cellulaire de 24 puits contenant des cellules Vero, et étiquetez chaque puits avec l’identité du moustique et de l’échantillon. Le matin où les moustiques seront exposés au repas sanguin infectieux, retirez les boules de coton saturées d’eau et fixez des réservoirs contenant les repas sanguins artificiels aux embouts de l’unité d’alimentation à l’aide d’une boîte de contention en plastique transparente munie de gants.

Placer le carton contenant les moustiques affamés dans la boîte à gants située sous l'unité d'alimentation. Une fois l'alimentation terminée, retirer le réservoir et l'immerger dans une solution d'eau de Javel à 10 % fraîchement préparée. À l'intérieur de la boîte à gants, verser les moustiques anesthésiés à froid dans une boîte de Pétri posée sur de la glace, puis trier les moustiques gorgés de sang des moustiques non gorgés.

Verser les moustiques gorgés à nouveau dans le carton en papier, puis le recouvrir rapidement d'un tamis et d'un couvercle. Rogner l'excédent de grille métallique autour du carton et fixer le couvercle avec du ruban adhésif. Ajouter une boule de coton saturée de sucrose stérile filtré à 10 % sur le tamis, puis placer le carton dans un grand récipient plastique secondaire contenant une éponge humide afin de maintenir l'humidité.

Incuber le récipient secondaire à 27 degrés Celsius, en laissant les moustiques accéder librement au saccharose jusqu'à la fin des expériences. Utiliser un aspirateur mécanique pour prélever un nombre prédéterminé de moustiques incubés dans le carton, puis boucher le tube de collecte avec un tampon de coton une fois terminé. Travailler à l'intérieur de la boîte à gants, verser les moustiques anesthésiés à froid dans une boîte de Pétri posée sur de la glace.

Retirez les six pattes de chaque moustique et placez-les dans un tube microcentrifuge de deux millilitres préalablement étiqueté, contenant une bille d'acier inoxydable stérilisée et 500 microlitres de milieu de collecte des moustiques, ou MCM. Placez délicatement le moustique sur une goutte d'huile minérale, en prenant soin que l'huile ne touche ni la tête ni le proboscis du moustique. Insérez le proboscis dans une pointe de pipette microlitrique remplie de 10 microlitres de FBS inactivé par la chaleur, et laissez le moustique saliver pendant 30 minutes.

Éjectez l'embout de pipette contenant la salive dans un tube de microcentrifugeuse contenant 100 microlitres de MCM, puis placez la carcasse dans un tube distinct de deux millimètres contenant une bille d'acier stérilisée et 500 microlitres de MCM. Transportez les tubes vers un appareil d'homogénéisation tissulaire par broyage à billes situé dans une cabine de sécurité biologique, puis triturez tous les échantillons de corps et de pattes à 26 hertz pendant cinq minutes afin de libérer les particules virales dans le surnageant. Clarifiez tous les échantillons par centrifugation à 200 × g pendant cinq minutes pour former un culot contenant les débris cellulaires.

Juste avant l'inoculation avec les échantillons, retirez le milieu des cellules Vero préparées au préalable. Répartissez soigneusement 100 microlitres de surnageants clarifiés provenant des corps ou des pattes dans chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber les débris cellulaires de moustique présents dans le culot. Incubez ensuite les plaques pendant une heure.

Après l'incubation, ajoutez un millilitre de recouvrement de méthylcellulose dans chaque puits, puis remettez les plaques dans l'incubateur pendant trois à sept jours. Retirez les plaques de recouvrement de l'incubateur et placez-les dans une cabine de sécurité biologique. Jetez le recouvrement de méthylcellulose dans un bac contenant de l'eau de javel à 10 %, puis lavez chaque puits deux fois avec du PBS, en rejetant chaque lavage dans le bac.

Éliminer le PBS et ajouter un millilitre de méthanol-acétone par puits, puis laisser les cellules s'immobiliser sur la plaque pendant 30 minutes. Ensuite, éliminer l'agent de fixation et laisser sécher les plaques. Laver chaque puits trois fois avec du PBS non stérile sur un agitateur orbital pour plaque en effectuant des lavages de 15 minutes chacun, puis ajouter un millilitre de solution de blocage dans chaque puits et agiter la plaque pendant encore 15 minutes.

Ajouter 100 microlitres d’anticorps primaire anti-virus Zika ou anti-flavivirus dans chaque puits, puis incuber la plaque avec agitation toute la nuit. Le jour suivant, retirer l’anticorps primaire et répéter les lavages avec du PBS. Après le dernier lavage, ajouter 100 microlitres d’anticorps secondaires et incuber la plaque sous agitation pendant une heure.

Répétez les lavages avec du PBS, puis ajoutez 100 microlitres de réactif de développement du substrat par puits, et agitez la plaque pendant 15 minutes. Lorsque les foyers ou les plaques apparaissent, arrêtez la réaction en rinçant la plaque avec de l’eau du robinet. Versez l’eau du robinet, laissez les plaques sécher à l’air, puis quantifiez les foyers viraux pour déterminer le nombre d’unités formant des foyers présentes dans l’échantillon donné.

Trois populations de moustiques ont été exposées à une souche épidémique du virus Zika sur une gamme de titres dans le repas sanguin. Au cours des deux semaines suivantes, des sous-ensembles de moustiques ont été analysés afin de déterminer les taux d'infection, de dissémination et de transmission potentielle. Aux titres plus faibles dans le repas sanguin, les moustiques provenant de Salvador, au Brésil, étaient infectés après 4, 10 et 14 jours d'incubation extrinsèque, sans aucune preuve d'infection disséminée observée dans les pattes analysées.

À la plus forte concentration, le virus a été détecté dans les pattes des moustiques, mais pas dans la salive. Les moustiques provenant de la République dominicaine se sont révélés les plus sensibles à l'infection et les plus compétents pour la transmission à toutes les concentrations testées du repas sanguin. Les moustiques ayant reçu les trois doses ont montré une dissémination du virus au bout de sept jours et une compétence pour la transmission à 14 jours post-infection.

Les moustiques provenant de la vallée du Rio Grande au Texas, exposés à des titres plus faibles de repas sanguin, ont été infectés dès quatre jours post-infection, tandis que des infections disséminées ont été observées après 14 jours. Dans le groupe exposé au titre le plus élevé, l'infection a été détectée à partir du deuxième jour post-infection et a atteint des pics aux jours 4, 10 et 14. Des infections disséminées ont été observées au septième jour, et un seul moustique était capable de transmission au jour 10.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de travailler en toute sécurité, plutôt que rapidement. Manipulez donc toujours les moustiques infectés ou potentiellement infectés à l’intérieur d’une boîte à gants ou d’une hotte de sécurité biologique, jusqu’à ce que leurs pattes ou leurs ailes aient été retirées. Le flux de travail de base relatif à la compétence vectorielle peut être adapté afin de produire des moustiques infectés destinés à des analyses ultérieures, telles que des études de transmission, ainsi que pour examiner les interactions entre les moustiques, le virus et le microbiome.

La compétence vectorielle a constitué un outil particulièrement important pour comprendre le rôle des moustiques dans la transmission des virus pendant les épidémies de maladies virales, et cela depuis plusieurs décennies. Mais c'est également une méthode qui a évolué au fil du temps pour intégrer de nouvelles connaissances, au fur et à mesure de leur acquisition, sur les interactions entre ces virus et les vecteurs moustiques. Pour ne citer que deux exemples, la population génétique du virus et la complexité de la population virale au sein du moustique se révèlent très importantes pour sa capacité à transmettre le virus, et nous pouvons désormais intégrer ces éléments dans les études de compétence vectorielle grâce à de nouvelles méthodes de séquençage des populations virales.

Nous savons désormais que la population de bactéries et d'autres organismes vivant dans le tube digestif du moustique peut également avoir un impact majeur sur sa capacité à transmettre des agents pathogènes, et nous pouvons désormais évaluer cette population grâce à de nouvelles méthodes de séquençage. Ainsi, la compétence vectorielle est une méthode qui a évolué et continue d'évoluer à mesure que nous approfondissons nos connaissances sur ces interactions complexes.