Une approche benchtop à l’ouverture spécifique de barrière de cerveau de sang d’emplacement utilisant l’ultrason focal dans un modèle de rat

L’ultrason focal avec des agents de microbubble peut ouvrir la barrière de cerveau de sang focalement et transitoirement. Cette technique a été utilisée pour délivrer un large éventail d’agents à travers la barrière cérébrale. Cet article fournit un protocole détaillé pour la livraison localisée au cerveau de rongeur avec ou sans guidage de MRI.

Les ultrasons focalisés, en combinaison avec des microbulles circulantes, peuvent être utilisés pour fournir des ouvertures temporaires de taille millimétrique dans la barrière hémato-encéphalique. Cela permet l’administration non invasive d’agents circulants systémiques dans des régions cérébrales ciblées. Pour commencer, remplissez le bouchon du cathéter de solution saline et réchauffez la queue du rat avec une lampe en prenant soin de ne pas surchauffer l’animal.

Insérez un cathéter veineux de queue de calibre 24 qui sera utilisé pour administrer des microbulles, un colorant bleu Evans, un contraste IRM au gadobutrol si vous utilisez l’IRM et l’agent expérimental d’intérêt. Le sang remplira la gaine lorsque la veine sera touchée. Lentement, retirez l’aiguille intérieure tout en enfonçant la gaine plus loin dans la veine.

Vissez le bouchon du cathéter dans l’extrémité de l’orifice du cathéter, dès que l’orifice est rempli de sang. Enroulez soigneusement du ruban adhésif de laboratoire autour du cathéter et de la queue pour le maintenir en place, en commençant par un petit morceau en haut et en travaillant dans le sens caudal. Laissez l’extrémité du bouchon du cathéter exposée.

Branchez la ligne d’anesthésie sur le connecteur d’anesthésie sur le cadre stéréotaxique. Fixez ensuite la tête de l’animal dans le cadre en plaçant la bouche sur la barre de morsure, en guidant les barres d’oreille dans les deux conduits auditifs et en serrant les vis de réglage. Déplacez l’animal vers le lit d’IRM.

À l’aide des paramètres décrits dans le manuscrit textuel, collectez des images pondérées en T2 coronale et axiale qui capturent l’ensemble du cerveau ainsi que le repère IRM pour les mesures de coordonnées. Sur les images coronales, trouvez l’image dans laquelle le repère est le plus grand, en indiquant le centre du repère. Enregistrez la distance entre le haut du repère et la région cérébrale d’intérêt en millimètres, à la fois dans la direction médiale-latérale et dans la direction dorsale-ventrale.

Sur les images axiales, trouvez l’image qui montre tout en haut du repère et enregistrez les coordonnées X et Y pour le centre du repère et les coordonnées X et Y de la région cérébrale d’intérêt. Calculez la distance entre le centre du repère et la région cérébrale cible dans les directions rostrale-caudale et médiale-latérale. Après avoir rassemblé les coordonnées, collectez les images de pré-numérisation.

En gardant l’animal dans ce cadre stéréotaxique, transportez-le rapidement du lit d’IRM à la configuration FUS de paillasse. Veiller à ce que l’animal reste endormi sous l’effet de l’anesthésie. Faites glisser le cadre dans le support de cadre et enclenchez-le fermement en place.

Utilisez une tondeuse pour raser la tête de l’animal, puis brossez l’excès de poils et appliquez une crème décapante sur le cuir chevelu. Laissez reposer pendant trois minutes et essuyez-le avec de l’eau et de la gaze. Si vous utilisez le guidage IRM, fixez le pointeur et déplacez-le à l’emplacement du repère IRM.

Positionnez ensuite le pointeur tout en haut et au centre du repère IRM, qui est le point à partir duquel toutes les distances de l’image IRM ont été calculées. Retirez le pointeur et déplacez le positionneur vers les coordonnées médiales-latérales et les coordonnées rostrales-caudales. Léchez le bouton de position nulle et soulevez le positionneur en appuyant sur le bouton up 50, pour permettre le placement du bain-marie et du gel à ultrasons.

Appliquez du gel à ultrasons sur le cuir chevelu de l’animal et placez le bain-marie sur l’animal, avec la fenêtre du ruban polyimide appuyée sur le gel, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le gel. Remplissez le bain-marie avec de l’eau dégazée. Si vous utilisez le transducteur haute puissance, abaissez le positionneur de manière à ce que l’aimant soit juste au-dessus de l’eau.

Fixez le transducteur au positionneur en abaissant soigneusement le transducteur dans l’eau à un angle et en connectant les aimants. Abaissez le positionneur à la coordonnée dorsale-ventrale et allumez l’amplificateur de puissance RF. Injectez un millilitre par kilogramme de colorant bleu Evans à 3 % en enfonçant une pointe d’aiguille dans le bouchon du cathéter et en injectant.

L’animal entier devrait devenir bleu en quelques secondes, indiquant que le cathéter est correctement positionné dans la veine de la queue. Laissez circuler le colorant pendant cinq minutes, puis activez les micro-bulles en les secouant violemment avec le shaker à bulles. Retournez cette seringue plusieurs fois pour obtenir une répartition uniforme des microbulles, puis fixez et remplissez le set de perfusion ailé.

Positionnez la seringue sur la pompe à perfusion et réglez la pompe à perfusion pour qu’elle délivre 0,2 millilitre à un débit de six millilitres par heure, ce qui permet une perfusion lente des microbulles pendant les deux minutes d’exposition au FUS. Insérez l’aiguille à ailettes dans le bouchon du cathéter. Faites d’abord fonctionner la pompe à perfusion, attendez trois secondes, puis démarrez le traitement FUS en appuyant sur le bouton marche et sur le générateur de fonctions.

Répétez cette opération deux fois par région avec cinq minutes entre les deux pour permettre aux microbulles de disparaître. Appuyez à nouveau sur le bouton marche du générateur de fonctions pour arrêter le traitement FUS lorsque la pompe à perfusion s’arrête au bout de deux minutes. Attendez cinq minutes que les microbulles disparaissent, puis commencez l’infusion et le deuxième traitement FUS.

Immédiatement après le deuxième traitement par FUS, injecter le gadobutrol de contraste et l’agent d’intérêt. Le volume total livré de tous les agents ne doit pas dépasser cinq millilitres par kilogramme. Pour confirmer l’ouverture de la BROCHE, replacez l’animal sur le lit d’IRM exactement au même endroit et branchez la ligne d’anesthésie.

Recueillir des post-examens IRM avec les mêmes paramètres d’imagerie que les images pré-balayage pour confirmer l’amélioration de l’IRM du gadobutrol dans la région de l’ouverture de la BHE. Ce protocole a été utilisé pour induire une ouverture localisée de la barrière hémato-encéphalique avec le transducteur d’immersion de faible puissance et le transducteur à ultrasons focalisés de haute puissance. Tout d’abord, le transducteur d’immersion de faible puissance visait l’hémisphère cérébral antérieur ou médial.

Les animaux ont été sacrifiés avec ou sans perfusion, et l’ouverture de la BHE a été visualisée via l’auto-fluorescence du colorant bleu Evans. Dans des expériences ultérieures, le transducteur FUS était ciblé soit sur l’hippocampe, soit sur le cortex cingulaire antérieur. En plus du colorant bleu d’Evans, l’agent de contraste IRM gadobutrol a été utilisé pour vérifier l’ouverture ciblée de la BHE in vivo.

Après le sacrifice des animaux, l’auto-fluorescence du colorant bleu Evans a confirmé l’emplacement de l’ouverture. Pour évaluer si cette technique pourrait être utilisée pour l’administration ciblée de gènes, l’AAV neuf exprimant la protéine fluorescente verte et le contraste gadobutrol ont été injectés immédiatement après l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique dans l’hippocampe. L’animal a été imagé pour vérifier l’ouverture avec le contraste du gadobutrol.

Ensuite, l’administration du gène a été confirmée par l’expression de la GFP. Ce protocole offre une approche de paillasse guidée par IRM pour l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique médiée par l’échographie focale, qui peut être facilement adaptée par d’autres laboratoires pour fournir une alternative translationnelle non invasive à la chirurgie stéréotaxique.