Name: Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Découvrez la méthode ChIP-exo pour cartographier les interactions protéine-ADN avec une résolution quasi nucléotidique dans les neurones de souris. Cette technique améliore la compréhension de la régulation génique.

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Nous remercions le membre du laboratoire Rhee d’avoir partagé des données inédites et des discussions précieuses. Ces travaux ont été appuyés par la subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CSERN) RGPIN-2018-06404 (H.R.).

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
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<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).</li>
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<li>Niu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+binding+interactions+of+mouse+and+human+constitutive+androstane+receptors+reveal+novel+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets.</a> Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).</li>
<li>Uuskula-Reimand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+beta+interacts+with+cohesin+and+CTCF+at+topological+domain+borders%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders.</a> Genome Biology. 17, (2016).</li>
<li>Rhee, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Terminal+Effector+Genes+in+Mammalian+Neurons+Is+Maintained+by+a+Dynamic+Relay+of+Transient+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers.</a> Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).</li>
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<li>Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+transcriptional+profiling+of+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer.</a> Scientific Data. 6, 190033(2019).</li>
<li>Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+ChIP-exo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Simplified ChIP-exo assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChIP-exo+Method%3A+Identifying+Protein-DNA+Interactions+with+Near+Base+Pair+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+Histone+Modifications+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li>
<li>Terranova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Platform+for+Genome-wide+Mapping+of+Chromatin+States+Using+High-throughput+ChIP-sequencing+in+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).</li>
<li>Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Parameters+for+Efficient+Sonication+and+Improved+Chromatin+Immunoprecipitation+of+High+Molecular+Weight+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins.</a> PLos One. 11 (1), (2016).</li>
<li>Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein-DNA+binding+event+subtypes+in+ChIP-exo+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data.</a> Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, le ChIP suivi de la digestion de l’exonucléase est utilisé pour obtenir des bibliothèques d’ADN pour l’identification des interactions protéine-ADN dans les cellules mammifères à une résolution cartographique ultra-élevée. De nombreuses variables contribuent à la qualité de l’expérience ChIP-exo. Les paramètres expérimentaux critiques incluent la qualité des anticorps, l’optimisation de la sonication, et le nombre de cycles LM-PCR. Ces paramètres expérimentaux critiques sont également ce qui peut limit...

Les emplacements des interactions protéine-ADN donnent un aperçu des mécanismes de régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est utilisée depuis une décennie pour examiner les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome dans les cellulesvivantes 1,2. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par l’hétérogénéité dans la fragmentation de l’ADN et la contamination non lié de l’ADN qui conduisent à une faible résolution cartographique, de faux positifs, des appels manqués et un signal d’arrière-plan non spécifique. La combinaison du ChIP avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) améliore la méthode de ChIP-seq en coupant l’ADN de ChIP aux points de croisement de protéine-ADN, fournissant la résolution proche de base-paire et un signal bas de fond3,4,5. La résolution cartographique grandement améliorée et le faible fond fourni par ChIP-exo permettent de déterminer des emplacements précis et complets de liaison protéine-ADN dans l’ensemble du génome. ChIP-exo est capable de révéler des motifs fonctionnellement distincts liant l’ADN, des interactions coopératives entre les facteurs de transcription (TF), et de multiples sites de liaison protéine-ADN dans un certain endroit de liaison génomique, non détectable par d’autres méthodes de cartographiegénomique 3,4,6,7.
ChIP-exo a d’abord été utilisé dans la levure naissante pour examiner la liaison spécifique à l’ADN des TF, pour étudier l’organisation précise du complexe de transcription pré-initiation, et la structure sous-nucléosomale des histones individuelles à traversle génome 4,8,9. Depuis son introduction en 20114, ChIP-exo a été utilisé avec succès dans de nombreux autres organismes, y compris les bactéries, les souris etles cellules humaines 7,10,11,12,13,14,15,16,17. En 2016, Rhee et coll.14 ont utilisé chIP-exo dans les neurones mammifères pour la première fois pour comprendre comment l’expression neuronale des gènes a été maintenue après la downregulation de la programmation TF Lhx3, qui forme un complexe d’heterodimer avec une autre programmation TF Isl1. Cette étude a montré qu’en l’absence de Lhx3, Isl1 est recruté à de nouveaux exhausteurs neuronaux liés par Onecut1 TF pour maintenir l’expression génétique des gènes effecteurs neuronaux. Dans cette étude, ChIP-exo a révélé comment plusieurs TF reconnaissent dynamiquement le type cellulaire et les éléments de régulation de l’ADN spécifiques au stade cellulaire d’une manière combinatoire à la résolution de cartographie quasi nucléotide. D’autres études ont également utilisé la méthode ChIP-exo pour comprendre l’interaction entre les protéines et l’ADN dans d’autres lignées cellulaires de mammifères. Han et coll.7 ont utilisé ChIP-exo pour examiner l’organisation à l’échelle du génome des TF GATA1 et TAL1 dans les cellules érythroïdes de souris à l’aide de ChIP-exo. Cette étude a révélé que TAL1 est directement recruté à l’ADN plutôt qu’indirectement par des interactions protéine-protéine avec GATA1 tout au long de la différenciation érythroïde. Des études récentes ont également utilisé ChIP-exo pour profiler les emplacements de liaison à l’échelle du génome de CTCF, RNA Polymerase II, et les marques d’histone pour étudier les mécanismes épigénomiques et transcriptionnels dans les lignéescellulaires humaines 18,19.
Il existe plusieurs versions du protocole ChIP-exo disponibles3,5,20. Cependant, ces protocoles ChIP-exo sont difficiles à suivre pour les recherches qui ne sont pas familiers avec la préparation de la bibliothèque de séquençage de prochaine génération. Une excellente version du protocole ChIP-exo a été publiée avec des instructions faciles à suivre et une vidéo21, mais contenait de nombreuses étapes enzymatiques qui nécessitent beaucoup de temps pour terminer. Ici, nous rapportons une nouvelle version du protocole ChIP-exo contenant des étapes enzymatiques réduites et les temps d’incubation, et des explications pour chaque étape enzymatique21. Les réactions de réparation d’extrémité et de dA-tailing sont combinées en une seule étape utilisant l’enzyme de préparation d’extrémité. Les temps d’incubation des étapes de ligature de l’index et de l’adaptateur universel sont réduits de 2 h à 15 min à l’aide d’un exhausteur de ligature. La réaction de kinase après l’étape de ligature d’adaptateur d’index décrite dans le protocole précédent de ChIP-exo est enlevée. Au lieu de cela, un groupe de phosphate est ajouté lors de la synthèse de l’ADN oligo à l’une des extrémités de 5' de l’adaptateur de l’index (tableau 1), qui sera utilisé pour l’étape de digestion de l’exonucléase lambda. Alors que le protocole chip-exo précédent utilisait la digestion de l’exonucléase RecJf pour éliminer les contaminants de l’ADN échoués, cette étape de digestion est enlevée ici parce qu’elle n’est pas critique pour la qualité de la bibliothèque ChIP-exo. En outre, pour purifier l’ADN inversé-croisé après elution de ChIP, une méthode magnétique de purification de perles est employée au lieu du phénol : chloroforme : méthode d’extraction d’alcool d’isoamyl (PCIA). Cela réduit le temps d’incubation de l’extraction de l’ADN. Fait important, il supprime la majorité des dimers adaptateurs formés lors de la ligature de l’adaptateur d’index, ce qui peut avoir un impact sur l’efficacité de la ligature médiée PCR.
Le protocole ChIP-exo présenté ici est optimisé pour la détection d’interactions protéines-ADN précises chez les neurones mammifères différenciés des cellules souches embryonnaires de souris (ES). En bref, les cellules neuronales récoltées et reliées entre elles sont lysées, afin de permettre à la chromatine d’être exposée à la sonication, puis sonnée de sorte que des fragments d’ADN de taille appropriée soient obtenus (figure 1). Les perles enduites d’anticorps sont ensuite utilisées pour immunoprécipifier sélectivement la chromatine fragmentée et soluble à la protéine d’intérêt. Tandis que l’ADN immunoprécipité est toujours sur les perles, la réparation finale, la ligature des adaptateurs de séquençage, la réaction de remplissage et les étapes de digestion d’exonuclease de lambda de 5' à 3' sont exécutées. L’étape de digestion de l’exonucléase est ce qui donne à ChIP-exo sa très haute résolution et son rapport signal-bruit élevé. Lambda exonuclease coupe l’ADN immunoprécipité quelques paires de base (bp) du site de liaison croisée, causant ainsi la contamination de l’ADN à dégrader. L’ADN chip traité à l’exonucléase est éludé des perles enduites d’anticorps, les liens croisés protéine-ADN sont inversés et les protéines sont dégradées. L’ADN est extrait et dénaturé à l’ADN de ChIP simple brin, suivi de l’annealing d’amorce et de l’extension pour faire l’ADN double-échoué (DsDNA). Ensuite, la ligature d’un adaptateur universel aux extrémités traitées par l’exonucléase est effectuée. L’ADN qui en résulte est purifié, puis amplifié par PCR, purifié en gel et soumis au séquençage de la prochaine génération.
Le protocole ChIP-exo est plus long que le protocole ChIP-seq, mais n’est pas très techniquement difficile. N’importe quel ADN immunoprécipité avec succès de ChIP peut être soumis au ChIP-exo, avec plusieurs étapes enzymatiques additionnables. Les avantages notables du ChIP-exo, tels que la résolution de cartographie ultra-élevée, un signal de fond réduit, et la diminution des faux positifs et négatifs, en ce qui concerne les sites de liaison génomique, l’emportent sur le coût du temps.

<table><tbody><tr><td>Agarose, UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td>Vérification de la sonication (Section 4.3.6) et purification sur gel de l’ADN amplifié LM-PCR (Section 19.1)</td></tr><tr><td>Albumine, sérum bovin (BSA), sans protéase, isolation par choc thermique, Min. 98 %</td> <td>BioShop</td><td>ALB003</td><td>Solution bloquante</td></tr><tr><td>Anticorps contre Isl1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>Incuetion d’anticorps avec des billes (Section 5.6)</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico& nbsp ;</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>Chromatine sonicante (Section 3.3)</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA), Biologie moléculaire New</td><td>England BioLabs</td><td>B9000S</td><td>Réaction de remplissage sur billes (Section 10.2) et Dénaturation, Recuit d’amorce et Extension d’amorce (Section 14.2)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td>Chromatine sonicante (Section 3.5), Vérification de la sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 et 4.3.4)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5804</td><td>R Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.3), Lyse cellulaire (Section 2.2 et 2.3), Chromatine sonicante (Section 3.1)</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Ajouté à tous les tampons, à l’exception du tampon Proteinase K et du tampon d’élution</td></tr><tr><td>ChIP Solution dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440S</td><td>dA-Tailing Reaction (Section 15.1)</td></tr><tr><td>Sel de sodium d’acide désoxycholique</td><td>Fisher scientific</td><td>BP349</td><td>Tampon de lyse 3, tampon de lavage à haute teneur en sel et tampon de lavage LiCl</td></tr><tr><td>dNTP Mix, biologie moléculaire grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Réaction de remplissage sur billes (section 10.2) et dénaturation, recuit d’amorce et extension d’amorce (section 14.2)</td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td>PCR médiée par ligature (Section 18.1)</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, Solution stérile, pH 8,0</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td>Tampon de lyse 1-3, Vérification de la sonication (Section 4.1), Tampon de lavage à haute teneur en sel, Tampon de lavage LiCl et Tampon d’élution ChIP</td></tr><tr><td>Alcool éthylique anhydre, 100</td> % <td>Alcools commerciaux</td><td>P006EAAN</td><td>Vérification de la sonication (Section 4.3.3)</td></tr><tr><td>Formaldéhyde, 36,5-38 %, contient 10-15 % méthanol</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.1)</td></tr><tr><td>Glycérol, qualité réactif, min 99,5</td> %<td>BioShop</td><td>GLY002</td><td>Tampon de lyse 1</td></tr><tr><td>Glycine, qualité biotechnologique, min. 99 %</td><td>BioShop</td><td>GLN001</td><td>Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.2)</td></tr><tr><td>Glycogène, qualité ARN</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td>Vérification de la sonication (Section 4.3.3)</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M de solution stérile filtrée, pH 7,3</td><td>BioShop</td><td>HEP003</td><td>Tampon de lyse 1, tampon de lavage au sel élevé</td></tr><tr><td>Fragment de Klenow (3->5 exo-)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>dA-Tailing Reaction (Section 15.1)</td></tr><tr><td>Exonucléase Lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262S</td><td>Exonucléase Lambda Digestion sur billes (Section 11.2)</td></tr><tr><td>Amplificateur de ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>Kit de bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra II. Ligature de l’adaptateur d’index sur billes (section 9.1) et ligature de l’adaptateur universel (section 16.1)</td></tr><tr><td>Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Ligature de l’adaptateur d’index sur billes (Section 9.1) et ligature de l’adaptateur universel (Section 16.1)</td></tr><tr><td>Chlorure de lithium (LiCl), qualité réactif</td><td>Bioshop</td><td>LIT704</td><td>LiCl</td></tr><tr><td>Wash Buffer Perles magnétiques pour ChIP (Dynabeads Protein G)</td><td>Dynabeads Protein G (billes magnétiques pour ChIP)</td><td>Dynabeads Protein G (billes magnétiques pour ChIP)</td><td>Incubation d’anticorps avec des billes (Section 5)</td></tr><tr><td>Perles magnétiques pour la purification de l’ADN (billes AMPure XP)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Extraction de l’ADN (Section 13.3) et nettoyage de l’ADN (Section 17.1)</td></tr><tr><td>Rack magnétique (Aimant DynaMag-2)</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Utilisé dans de nombreuses étapes dans les Sections : 5 - 11, 13</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel MinElute</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>28604</td><td>Purification sur gel d’ADN amplifié par PCR (Section 19.2)</td></tr><tr><td>Solution de sel de sodium N-Lauroylsarcosine, solution aqueuse à 30 %, &ge ; 97.0 % (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>61747</td><td>Tampon de lyse 3</td></tr><tr><td>Éthoxylate d’octylphénol (IGEPAL CA630)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Tampon de lyse 1 et tampon de lavage LiCl</td></tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique, qualité biotechnologie (25:24:1)</td><td>BioShop</td><td>PHE512</td><td>Vérification de la sonication (Section 4.3.1)</td></tr><tr><td>phi29 ADN polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269L</td><td>Réaction de remplissage sur billes (Section 10.2) et Dénaturation, Recuit d’Amorce et Extension d’Apprêt (Section 14.3 et 14.4)</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td>Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.3) et chromatine sonicante (Section 3.1), Incuetion d’anticorps avec des billes (Section 5.1)</td></tr><tr><td>Alimentation de base</td><td>PowerPac BioRad</td><td>1645050</td><td>Vérification de la sonication (Section 4.3.6) et purification sur gel de l’ADN amplifié LM-PCR (Section 19.1)</td></tr><tr><td>Système PCR ProFlex</td><td>Système</td><td>PCR</td> <td>ProFlexUtilisé dans les sections : 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 et 18.2</td></tr><tr><td>Tube LoBind protéique, 2,0 mL&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Incubation d’anticorps avec billes (Section 5.2) et immunoprécipitation de la chromatine (Section 6.3)</td></tr><tr><td>Solution de protéinase K,</td><td>Invitrogen</td><td>de</td> qualité ARN 25530049 <td>vérification de la sonication (Section 4.2) et élution et réticulation inverse (Section 12.3)</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 4.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Purification sur gel de l’ADN amplifié par PCR (Section 19.3)</td></tr><tr><td>Dosage Quibit dsDNA BR kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Purification sur gel de l’ADN amplifié par PCR (Section 19.3)</td></tr><tr><td>Rnase A, Dnase et Protéase sans</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td> Vérification de la <td>sonication (Section 4.3.2) et de l’extraction de l’ADN (Section 13.2)</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl), BioReagent&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Tampon de lyse 1-3, tampon de lavage au sel élevé</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS), bioShop</td><td></td><td>SDS001</td> de qualité électrophorèse <td>Sonication (section 4.1), tampon de lavage au sel élevé et tampon à élution ChIP</td></tr><tr><td>billes de sonication et tubes Bioruptor de 15 mL</td><td>diagénode</td><td>C01020031</td><td>chromatine sonicante (sections 3.1 et 3.2)</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 et 16.2</td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de Trizma (Tris-HCl), certifiée BioPerformance, 1 M, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>T2194</td><td>10 mM Tampon Tris-HCl</td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de Trizma (Tris-HCl), certifiée BioPerformance, 1 M, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>T2694</td><td>Tampon de lyse 2, tampon de lyse 3, vérification de la sonication (section 4.1), tampon de lavage LiCl et tampon d’élution ChIP</td></tr><tr><td>Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546S</td><td>Mélange de réaction de préparation d’extrémité et mélange d’enzyme de préparation d’extrémité. Réparation en bout et réaction de résidus dA sur les billes (section 8.2)</td></tr><tr><td>VWR Mini Tube Rocker, vitesse variable</td><td>VWR</td><td>10159-752</td><td>Utilisé dans de nombreuses étapes dans les sections : 1, 2, 5, 6 et 7</td></tr><tr><td>2-[4-(2,4,4-triméthylpentan-2-yl)phénoxy]éthanol, Triton X-100,</td> tampon de lyse <td>BioShop</td><td>TRX506</td> de qualité réactif <td>1, chromatine sonicante (section 3.4) et tampon de lavage au sel élevé</td></tr></tbody></table>

cartographie à haute résolution des interactions protéine-adn dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (chip-exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

L’identification d’interactions protéine-ADN spécifiques sur le génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est largement utilisée pour identifier les emplacements de liaison à l’échelle du génome des protéines liant l’ADN. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par son hétérogénéité dans la longueur des fragments d’ADN sonicated et de l’ADN de fond non spécifique, ayant pour résultat la résolution de cartographie basse et l’incertitude dans les emplacements ADN-liants. Pour surmonter ces limitations, la combinaison du ChIP avec la digestion d’exonucléase (ChIP-exo) utilise la digestion d’exonuclease de 5' à 3' pour couper l’ADN immunoprécipité de taille hétérogène au site de liaison croisée protéine-ADN. Le traitement d’exonucléase élimine également l’ADN non spécifique de fond. L’ADN préparé par la bibliothèque et digéré par l’exonucléase peut être envoyé pour le séquençage à haut débit. La méthode ChIP-exo permet une résolution cartographique proche de la paire de base avec une plus grande sensibilité de détection et un signal d’arrière-plan réduit. Un protocole ChIP-exo optimisé pour les cellules mammifères et le séquençage de prochaine génération sont décrits ci-dessous.

La figure 2A illustre les résultats de sonication après la lyse cellulaire et la sonication, avec divers cycles, des cellules de neurones moteurs différenciées des cellules ES de souris. Le nombre optimal de cycles de sonication (par exemple, 12 cycles de la figure 2A) agénéré une forte intensité d’ADN dans des fragments d’ADN de 100 à 400 pb. Les bibliothèques ChIP-exo de haute qualité sont basées sur la taille et la quantité d’ADN chromatine fragmenté. Ainsi, ...

La détermination précise des emplacements liant les protéines dans l’ensemble du génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. Ici nous décrivons une méthode génomique de cartographie qui traite l’ADN chromatin-immunoprécipité avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) suivie du séquençage à haut débit. Cette méthode détecte les interactions protéine-ADN avec une résolution cartographique proche de la paire de base et un rapport signal-bruit élevé chez les neurones mammifères.

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Le principal avantage de notre méthode ChIP-exo est l’amélioration de la résolution cartographique des interactions protéine-ADN dans la cellule par rapport à la méthode conventionnelle d’immunoprécipitation de la chromatine. Pour préparer des billes magnétiques de protéine G pour ChIP, mélangez les billes magnétiques jusqu’à ce qu’elles soient homogènes. Ajoutez ensuite 25 microlitres de billes magnétiques dans un tube de protéines à faible liaison de deux millilitres.Ajoutez un millilitre de solution de blocage aux billes. Mélangez bien en pipetant, puis placez le tube sur une grille magnétique pendant une minute. Une fois que le surnageant est clair, retirez-le.Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de blocage aux billes. Placez le tube sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius et balancez-le pendant 10 minutes, puis faites tourner brièvement le tube. Placez le tube sur la grille magnétique et retirez le surnageant.Ajoutez 500 microlitres de solution de blocage aux billes magnétiques. Faites tourner brièvement l’anticorps contre l’îlot-1, puis ajoutez quatre microgrammes de l’anticorps dans le tube contenant les billes magnétiques. Placez le tube contenant les billes magnétiques et l’anticorps Islet-1 sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius et bercez-le pendant six à 24 heures.Pour commencer l’immunoprécipitation de la chromatine, lavez les billes enrobées d’anticorps dans un millilitre de solution bloquante. Placez le tube contenant les billes enrobées d’anticorps sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir brièvement essoré, placez le tube sur une grille magnétique et retirez le surnageant.Remettez en suspension les billes enrobées d’anticorps dans 50 microlitres de solution de blocage. Ajoutez un millilitre de lysats soniqués aux billes enrobées d’anticorps, puis incubez l’échantillon sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir laissé l’échantillon incuber pendant la nuit, prélevez le liquide du capuchon en faisant tourner brièvement le tube, puis placez le tube sur un support magnétique.Et au bout d’une minute, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, effectuez une série de lavages comme suit. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage à froid contenant de l’IPC à l’échantillon.Mélangez l’échantillon sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourner brièvement le tube d’échantillon, puis placez-le sur une grille magnétique. Au bout d’une minute, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.Pour la première réaction enzymatique et la réparation et le résidu DA, ajoutez 38 microlitres d’eau double distillée autoclavée à l’échantillon, puis ajoutez le mélange de réaction de préparation finale et le mélange d’enzymes de préparation finale. Mélangez le contenu du tube par pipetage, puis incubez l’échantillon à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les billes d’échantillon avec un tampon de lavage à haute teneur en sel, un tampon de lavage au chlorure de lithium et un tampon de chlorure d’hydrogène Tris de 10 millimolaires comme décrit précédemment.Pour effectuer la ligature de l’adaptateur d’index, ajoutez 27 microlitres de tampon de chlorure d’hydrogène Tris froid 10 millimolaires à l’échantillon. Ajoutez ensuite l’adaptateur d’index, l’amplificateur de ligature et le master mix ligase. Incuber l’échantillon à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes.Encore une fois, lavez les billes d’échantillon avec un tampon de lavage à haute teneur en sel, un tampon de lavage au chlorure de lithium et un tampon de chlorure d’hydrogène Tris de 10 millimolaires. Ajoutez ensuite 47 microlitres de tampon de chlorure d’hydrogène Tris froid de 10 millimolaires à l’échantillon. Pour réparer l’entaille dans l’ADN résultant de l’absence de liaison phosphodiester, ajoutez 11,1 microlitres du mélange de remplissage à l’échantillon.Incuber l’échantillon à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après une série de lavages, ajoutez 50 microlitres d’eau froide autoclavée double distillée à l’échantillon. Pour digérer l’ADN ChIP dans la direction cinq premiers à trois premiers, ajoutez un tampon d’exonucléase lambda et une exonucléase lambda et mélangez l’échantillon par pipetage.Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois la digestion terminée, répétez les trois lavages une dernière fois. Pour éluer l’échantillon de ChIP des billes, remettre l’échantillon en suspension dans 75 microlitres de tampon d’élution ChIP et d’incubateur à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes à 130 fois G.Ajoutez 2,5 microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K à l’échantillon.Vortex brièvement l’échantillon, puis incubez toute la nuit à 65 degrés Celsius. Faites tourner brièvement l’échantillon et placez-le sur un support magnétique. Au bout d’une minute, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.Purifier et éluer l’ADN. Après avoir purifié l’ADN élué, transférez 16 microlitres de l’échantillon d’ADN extrait dans un tube PCR. Ajoutez 1,2 microlitre de mélange de dénaturation et de recuit d’apprêt à l’échantillon.À l’aide du programme décrit dans le tableau six du manuscrit, la dénature et le recuit ajoutent des amorces à l’ADN modèle. Ajoutez trois microlitres de mélange d’extension d’amorce à l’échantillon et exécutez le programme de PCR décrit dans le tableau sept du manuscrit. Ajoutez 4,1 microlitres de mélange de résidus DA à l’échantillon et analysez l’échantillon à l’aide du programme PCR du tableau huit du manuscrit.Ajoutez ensuite 21,5 microlitres de mélange de ligature d’adaptateur universel à l’échantillon et incubez pendant 15 minutes à 20 degrés Celsius. Ajoutez 29 microlitres de mélange LM-PCR à l’échantillon, puis analysez l’échantillon à l’aide du programme du tableau 10 du manuscrit. Après 18 cycles de LM-PCR, des échantillons de ChIP-exo provenant de motoneurones de souris ont été électrophorestisés sur un gel d’agarose à 1,5 %.Les résultats pour ChIP-exo Islet-1 ont montré des banques d’ADN amplifiées autour de 200 à 400 paires de bases, indiquant que les banques ChIP-exo ont été amplifiées avec succès par LM-PCR. La bande autour de 100 paires de bases représente des artefacts provenant d’adaptateurs et d’amorces PCR. Le contrôle sans anticorps démontre que l’ADN de fond non spécifique a été digéré par le traitement à l’exonucléase lambda.À l’aide de ChIP-exo et de ChIP-seq, les emplacements liés à Islet-1 ont été identifiés. Le signal ChIP-exo était fortement focalisé sur les sites de liaison d’Islet-1, détectant plusieurs modèles de liaison de facteur de transcription Islet-1 groupés. Le signal ChIP-seq a montré des signaux plus larges, indiquant que ChIP-exo avait une résolution de cartographie plus élevée que ChIP-seq pour Islet-1.Plusieurs facteurs de transcription lient souvent l’ADN les uns à côté des autres sous la forme d’un complexe protéine-ADN. ChIP-exo nous permet d’étudier comment plusieurs facteurs de transcription reconnaissent et régulent l’ADN cible.

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Cette vidéo démontre l’immunoprécipitation de fragments d’ADN réticulés avec la protéine cible à partir de lysats de motoneurones dérivés de cellules souches à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’anticorps spécifiques à la protéine cible.

Immunoprécipitation de complexes protéine-ADN cibles à partir d’un lysat de motoneurone

Source : Mendez, F. M. et al., Immunoprécipitation native de la chromatine à l’aide de neurosphères de tumeurs cérébrales murines. J. Vis. Exp. (2018). Cette vidéo démontre l’isolement de complexes protéine-ADN à partir de cellules de la neurosphère dérivées d’une tumeur cérébrale de souris à l’aide de l’immunoprécipitation native de la chromatine. Il détaille les étapes de préparation de la chromatine, d’immunoprécipitation, de lavage et de digestion des protéines afin de libérer l’ADN pour...

Immunoprécipitation de la chromatine native des cellules de la neurosphère

La question de savoir comment les organismes de réglementation et des états de la chromatine chromatine affecte le génome in vivo est essentielle à notre compréhension de la façon dont les premières décisions du destin cellulaire sont faites dans l'embryon en développement. ChIP-Seq-la méthode la plus populaire pour étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau-est globale définie ici pour les embryons de xénope.

Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons par Chip-Seq

Ici, nous présentons un protocole permettant d’obtenir une résolution proche de la paire de bases des interactions protéine-ADN. Ceci est obtenu par un traitement à l’exonucléase de fragments d’ADN enrichis sélectivement par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-exo) suivi d’un séquençage à haut débit.

La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ce travail décrit un protocole pour l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) en utilisant une ligne de cellules T mûres de souris. Ce protocole est approprié pour étudier la répartition des marques d'histones spécifiques sur des sites promoteurs spécifiques ou génométriques.

Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Ce protocole décrit la méthode Capture Hi-C utilisée pour caractériser l’organisation 3D de régions génomiques ciblées de taille mégamétrique à haute résolution, y compris les limites des domaines topologiquement associés (TAD) et les interactions chromatines à longue distance entre les éléments de séquence d’ADN régulateurs et autres.

Déchiffrer l’organisation de la chromatine 3D haute résolution via Capture Hi-C

Un protocole de cartographie de l’organisation tridimensionnelle du génome avec la résolution des nucléosomes à l’aide de la méthode de capture de conformation chromosomique à l’échelle du génome Micro-C-XL est présenté ici.

Cartographie des interactions du génome 3D des mammifères avec Micro-C-XL

Découvrez la méthode ChIP-exo pour cartographier les interactions protéine-ADN avec une résolution quasi nucléotidique dans les neurones de souris. Cette technique améliore la compréhension de la régulation génique.

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo) (Vidéo) | JoVE Journal

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

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