Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Le principal avantage de notre méthode ChIP-exo est l’amélioration de la résolution cartographique des interactions protéine-ADN dans la cellule par rapport à la méthode conventionnelle d’immunoprécipitation de la chromatine. Pour préparer des billes magnétiques de protéine G pour ChIP, mélangez les billes magnétiques jusqu’à ce qu’elles soient homogènes. Ajoutez ensuite 25 microlitres de billes magnétiques dans un tube de protéines à faible liaison de deux millilitres.

Ajoutez un millilitre de solution de blocage aux billes. Mélangez bien en pipetant, puis placez le tube sur une grille magnétique pendant une minute. Une fois que le surnageant est clair, retirez-le.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de blocage aux billes. Placez le tube sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius et balancez-le pendant 10 minutes, puis faites tourner brièvement le tube. Placez le tube sur la grille magnétique et retirez le surnageant.

Ajoutez 500 microlitres de solution de blocage aux billes magnétiques. Faites tourner brièvement l’anticorps contre l’îlot-1, puis ajoutez quatre microgrammes de l’anticorps dans le tube contenant les billes magnétiques. Placez le tube contenant les billes magnétiques et l’anticorps Islet-1 sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius et bercez-le pendant six à 24 heures.

Pour commencer l’immunoprécipitation de la chromatine, lavez les billes enrobées d’anticorps dans un millilitre de solution bloquante. Placez le tube contenant les billes enrobées d’anticorps sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir brièvement essoré, placez le tube sur une grille magnétique et retirez le surnageant.

Remettez en suspension les billes enrobées d’anticorps dans 50 microlitres de solution de blocage. Ajoutez un millilitre de lysats soniqués aux billes enrobées d’anticorps, puis incubez l’échantillon sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir laissé l’échantillon incuber pendant la nuit, prélevez le liquide du capuchon en faisant tourner brièvement le tube, puis placez le tube sur un support magnétique.

Et au bout d’une minute, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, effectuez une série de lavages comme suit. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage à froid contenant de l’IPC à l’échantillon.

Mélangez l’échantillon sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourner brièvement le tube d’échantillon, puis placez-le sur une grille magnétique. Au bout d’une minute, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.

Pour la première réaction enzymatique et la réparation et le résidu DA, ajoutez 38 microlitres d’eau double distillée autoclavée à l’échantillon, puis ajoutez le mélange de réaction de préparation finale et le mélange d’enzymes de préparation finale. Mélangez le contenu du tube par pipetage, puis incubez l’échantillon à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les billes d’échantillon avec un tampon de lavage à haute teneur en sel, un tampon de lavage au chlorure de lithium et un tampon de chlorure d’hydrogène Tris de 10 millimolaires comme décrit précédemment.

Pour effectuer la ligature de l’adaptateur d’index, ajoutez 27 microlitres de tampon de chlorure d’hydrogène Tris froid 10 millimolaires à l’échantillon. Ajoutez ensuite l’adaptateur d’index, l’amplificateur de ligature et le master mix ligase. Incuber l’échantillon à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Encore une fois, lavez les billes d’échantillon avec un tampon de lavage à haute teneur en sel, un tampon de lavage au chlorure de lithium et un tampon de chlorure d’hydrogène Tris de 10 millimolaires. Ajoutez ensuite 47 microlitres de tampon de chlorure d’hydrogène Tris froid de 10 millimolaires à l’échantillon. Pour réparer l’entaille dans l’ADN résultant de l’absence de liaison phosphodiester, ajoutez 11,1 microlitres du mélange de remplissage à l’échantillon.

Incuber l’échantillon à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après une série de lavages, ajoutez 50 microlitres d’eau froide autoclavée double distillée à l’échantillon. Pour digérer l’ADN ChIP dans la direction cinq premiers à trois premiers, ajoutez un tampon d’exonucléase lambda et une exonucléase lambda et mélangez l’échantillon par pipetage.

Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois la digestion terminée, répétez les trois lavages une dernière fois. Pour éluer l’échantillon de ChIP des billes, remettre l’échantillon en suspension dans 75 microlitres de tampon d’élution ChIP et d’incubateur à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes à 130 fois G.Ajoutez 2,5 microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K à l’échantillon.

Vortex brièvement l’échantillon, puis incubez toute la nuit à 65 degrés Celsius. Faites tourner brièvement l’échantillon et placez-le sur un support magnétique. Au bout d’une minute, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Purifier et éluer l’ADN. Après avoir purifié l’ADN élué, transférez 16 microlitres de l’échantillon d’ADN extrait dans un tube PCR. Ajoutez 1,2 microlitre de mélange de dénaturation et de recuit d’apprêt à l’échantillon.

À l’aide du programme décrit dans le tableau six du manuscrit, la dénature et le recuit ajoutent des amorces à l’ADN modèle. Ajoutez trois microlitres de mélange d’extension d’amorce à l’échantillon et exécutez le programme de PCR décrit dans le tableau sept du manuscrit. Ajoutez 4,1 microlitres de mélange de résidus DA à l’échantillon et analysez l’échantillon à l’aide du programme PCR du tableau huit du manuscrit.

Ajoutez ensuite 21,5 microlitres de mélange de ligature d’adaptateur universel à l’échantillon et incubez pendant 15 minutes à 20 degrés Celsius. Ajoutez 29 microlitres de mélange LM-PCR à l’échantillon, puis analysez l’échantillon à l’aide du programme du tableau 10 du manuscrit. Après 18 cycles de LM-PCR, des échantillons de ChIP-exo provenant de motoneurones de souris ont été électrophorestisés sur un gel d’agarose à 1,5 %.

Les résultats pour ChIP-exo Islet-1 ont montré des banques d’ADN amplifiées autour de 200 à 400 paires de bases, indiquant que les banques ChIP-exo ont été amplifiées avec succès par LM-PCR. La bande autour de 100 paires de bases représente des artefacts provenant d’adaptateurs et d’amorces PCR. Le contrôle sans anticorps démontre que l’ADN de fond non spécifique a été digéré par le traitement à l’exonucléase lambda.

À l’aide de ChIP-exo et de ChIP-seq, les emplacements liés à Islet-1 ont été identifiés. Le signal ChIP-exo était fortement focalisé sur les sites de liaison d’Islet-1, détectant plusieurs modèles de liaison de facteur de transcription Islet-1 groupés. Le signal ChIP-seq a montré des signaux plus larges, indiquant que ChIP-exo avait une résolution de cartographie plus élevée que ChIP-seq pour Islet-1.

Plusieurs facteurs de transcription lient souvent l’ADN les uns à côté des autres sous la forme d’un complexe protéine-ADN. ChIP-exo nous permet d’étudier comment plusieurs facteurs de transcription reconnaissent et régulent l’ADN cible.