Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

L’objectif global de l’expérience suivante en conception génétiquement traçable Caenorhabditis elegans est d’identifier les interactions chaperonnes spécifiques aux tissus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine des tests faciles à utiliser, tels que l’ajustement de l’IA Golan, et des lectures comportementales pour exposer de nouvelles interactions spécifiques aux tissus. Pour une synchronisation embryonnaire non stressante, utilisez un pic à vers pour déplacer environ 100 œufs d’une plaque de vers non synchronisée à une plaque NGM nouvellement installée et cultivez les animaux selon le calendrier expérimental approprié.

Lorsque les animaux atteignent le premier jour de ponte, ajoutez lentement un millilitre de tampon M9 dans la plaque, à distance de la pelouse bactérienne, et tournez la plaque de manière à ce que le tampon recouvre complètement la plaque. Inclinez la plaque d’un côté pour retirer le liquide et laver les animaux de la plaque. Lorsque tous les vers ont été lavés de la plaque, utilisez une pointe de pipette en plastique standard pour couper un carré de gélose autour de l’endroit où les œufs sont concentrés et placez le morceau de gélose sur une plaque NGM nouvellement installée.

Cultivez les œufs dans les mêmes conditions de culture. À la fin de l’incubation, la plaque doit être recouverte d’œufs synchronisés. Après avoir lavé tous les animaux de la plaque comme nous venons de le démontrer, ajoutez un millilitre de tampon M9 frais et utilisez un grattoir cellulaire pour libérer les œufs de la plaque.

Lorsque tous les œufs ont été détachés, transférez tout le volume de tampon de la plaque dans un tube conique pour la centrifugation. Centrifugez le tube et jetez le surnageant. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez jusqu’à un millilitre de tampon M9 frais dans la plaque et pipetez pour remettre les œufs en suspension.

Lavez les œufs cinq fois de plus comme il vient d’être démontré. Après le dernier lavage, la pastille d’œuf doit apparaître blanche et tous les 200 microlitres de surnageant, sauf les 200 derniers, peuvent être éliminés. Pour cultiver des nématodes synchronisés pour une expérience, placez une goutte d’environ 30 œufs près de la pelouse bactérienne et chaque plaque d’ARN d’interférence et environ 30 œufs sur une plaque contenant un vecteur vide contenant des bactéries.

Ensuite, cultivez les animaux dans les conditions de culture appropriées selon le protocole expérimental. Pour évaluer la létalité embryonnaire des animaux synchronisés, lorsque les animaux commencent à pondre des œufs, transférez environ 100 œufs dans une assiette vide et répartissez les œufs en rangées pour simplifier le comptage. Après 24 à 48 heures, notez le pourcentage d’œufs non éclos.

À titre de référence, comparez les œufs d’animaux de laboratoire aux œufs d’animaux traités avec des bactéries vides de lutte antivectorielle. Pour mettre en place un test de paralysie, cultivez des animaux synchronisés selon l’âge sur des bactéries de lutte antivectorielle vides, jusqu’à ce que les animaux atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte. À l’aide d’un marqueur fin, tracez une ligne au dos d’une assiette de gélose NGM ordinaire et placez cinq à dix animaux sur la ligne marquée.

Réglez une minuterie sur 10 minutes et notez le pourcentage d’animaux restant sur la ligne en tant que vers paralysés. À titre de référence, comparez ces données au pourcentage d’animaux mutants élevés sur des bactéries vides de lutte antivectorielle. Pour la validation de l’inactivation des protéines, placez 250 à 300 œufs synchronisés sur une plaque d’ARN interférentiel NGM de 60 millimètres assise avec l’ARN double brin correspondant exprimant ou un vecteur vide contenant des bactéries, et cultivez les œufs pendant la période expérimentale appropriée.

À la fin de l’incubation, transvaser un total de 200 jeunes animaux adultes dans le capuchon d’un tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de PBST maintenu à la température de culture des animaux. Fermez soigneusement le capuchon et centrifugez les animaux à 1000 fois G pendant 1 minute. À la fin de la centrifugation, ajoutez 800 microlitres de PBST frais dans le tube et centrifugez à nouveau les vers.

Retirez soigneusement les 900 microlitres supérieurs du surnageant et lavez les nématodes dans du PBST frais 3 fois de plus, comme nous venons de le démontrer. Après le dernier lavage, retirez tous les 100 microlitres de surnageant sauf les derniers et ajoutez 25 microlitres de tampon d’échantillon 5X aux animaux. Chauffez les échantillons pendant 10 minutes à 92 degrés Celsius et 1000 tours par minute, avant de charger 20 microlitres de chaque échantillon sur un gel de page SDS.

Effectuez ensuite une analyse par transfert Western à l’aide des anticorps appropriés pour déterminer la stabilité relative de la protéine d’intérêt, et utilisez un logiciel densitométrique pour déterminer l’intensité des interdictions. HSP6 renversé au cours du développement entraîne un fort arrêt du développement chez les animaux de type sauvage. Dans le même temps, HSP6 inactivé dans une souche d’ARN d’interférence musculaire spécifique exprimant RDE1 de type sauvage dans le tissu musculaire ne provoque pas d’arrêt du développement.

Alors que HSP6 a neutralisé une souche d’ARNAI spécifique de l’intestin exprimant le type sauvage RDE1 dans les cellules intestinales, il en résulte un fort arrêt du développement et un phénotype. Une mutation de HSP6 MG585 qui provoque un léger retard de croissance peut donc être utilisée pour dépister l’aggravation ou l’atténuation des interactions chaperonnes en croisant une souche porteuse de ce gène muté dans une souche d’ARN d’interférence intestinale spécifique et en criblant la banque d’ARN d’interférence chaperonne. L’organisation de la myosine et des animaux mutants UNC45 traités avec l’ARN interférent STI1 AHSA1 ou DAF41, est similaire à celle des vers de type sauvage au quatrième stade larvaire.

Bien que les mutants présentent des sarcomères perturbés après avoir atteint l’âge adulte. En revanche, les animaux mutants UNC45 traités avec un contrôle vectoriel vide et les animaux de type sauvage ne sont pas affectés. Les interactions génétiques ne sont pas indicatives d’une interaction physique.

Ainsi, des expériences de suivi utilisant le dépistage des interactions génétiques doivent être réalisées pour valider et examiner directement la nature des interactions identifiées.