Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Ce modèle Hep G2 fournit un système de test in vitro alternatif pertinent pour évaluer de manière plus fiable l’induction potentielle de dommages fixes à l’ADN après une exposition à long terme à des nanomatériaux dans le but de minimiser le besoin de tests chez les animaux. Le modèle sphéroïde de l’hépatite G2 possède la capacité de rester viable et fonctionnel sur une période de 14 jours, ainsi que de maintenir un niveau approprié de prolifération. Cela permet d’analyser une gamme de paramètres biochimiques et de génotoxicité, y compris l’essai du micronoyau.

Avant d’essayer ce protocole, je vous suggère d’abord de faire quelques essais pratiques. Soyez prudent lors de l’ensemencement cellulaire ou du changement de support, car cela nécessite une approche délicate. Commencez par ajouter 100 microlitres de PBS stérile à température ambiante dans les puits d’une plaque de culture à 96 puits.

Retournez le couvercle de la plaque et pipetez soigneusement des gouttes de 20 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque rainure de puits du couvercle. Utilisez une pipette multicanaux, en ajoutant deux à quatre gouttes à la fois, pour assurer la précision du placement. N’ensemencez que quatre stéroïdes à la fois et assurez-vous que les pointes de la pipette sont toutes alignées avant de commencer.

L’angle auquel vous tenez le multicanal fera une différence dans la façon dont les sphéroïdes sont formés. Assurez-vous que les gouttes sont centrées dans les rainures des puits sur le couvercle, puis retournez doucement le couvercle sur le dessus de la plaque pour que les gouttes pendent au-dessus des puits avec du PBS. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours avant le transfert du sphéroïde sur l’agarose.

Après l’incubation, retirez la plaque de l’incubateur et soulevez délicatement le couvercle de la plaque, jetez le PBS, tapotez la plaque pour éliminer tout liquide résiduel et laissez les plaques sécher à l’air libre pendant deux à trois minutes. Après avoir fait fondre l’agarose, remuez-la doucement pour éliminer les bulles et ajoutez 50 microlitres dans la base de chaque puits. Laissez la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis ajoutez 100 microlitres de DMEM préchauffé sur la couche d’agarose solide dans chaque puits.

Replacez le couvercle avec ces gouttelettes de sphéroïdes sur le dessus de la plaque de sorte que les sphéroïdes soient à nouveau suspendus, puis centrifugez la plaque pendant trois minutes à 200 fois G pour transférer les sphéroïdes dans les puits individuels de la plaque. Incuber la plaque pendant encore 24 heures pour permettre aux sphéroïdes de se déposer. Après dispersion des nanomatériaux manufacturés, ou ENM, diluez-les à la concentration finale souhaitée avec du DMEM préchauffé.

Aspirez 50 microlitres de milieu de chaque puits avec les sphéroïdes et remplacez-le par 50 microlitres de milieu avec l’ENM. Pour récolter les sphéroïdes, utilisez une pipette de 200 microlitres pour aspirer les 100 microlitres de milieu de culture cellulaire avec le tissu sphéroïde de chaque puits, en prenant soin d’éviter tout contact avec l’agarose. Recueillir les sphéroïdes dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres.

Centrifugez la suspension sphéroïde à 230 fois G pendant cinq minutes, puis retirez le surnageant et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Lavez la pastille de sphéroïdes dans un millilitre de PBS stérile à température ambiante, puis centrifugez-les à 230 fois G pendant trois minutes et jetez le surnageant. Remettez les sphéroïdes en suspension dans 500 microlitres d’une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez-les pendant six à huit minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après l’incubation, pipetez doucement les cellules d’hépatite G2 trypsinzées de haut en bas pour les dissocier complètement et les remettre en suspension avant de les neutraliser avec un millilitre de DMEM. Centrifugez la suspension cellulaire à 230 fois G pendant cinq minutes, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de PBS. Pour créer une installation d’entonnoir de cuvette, placez la lame de microscope préparée dans le support métallique, placez une carte de filtre sur la lame, puis fixez l’entonnoir de cuvette sur le dessus.

Disposez les entonnoirs de la cuvette dans la cytocentrifugeuse avec l’entonnoir vers le haut de manière à ce que 100 microlitres de suspension cellulaire puissent être ajoutés directement dans chacun d’eux. Procédez ensuite à la fixation des lames selon les instructions du manuscrit. Préparez une solution de coloration Giemsa à 20 % diluée dans un tampon de phosphatase.

Pipetez doucement la solution de haut en bas pour la mélanger, puis filtrez-la avec du papier filtre plié dans un entonnoir. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez trois à cinq gouttes de la solution filtrée de Giemsa au cytodot de chaque lame et laissez-la pendant huit à 10 minutes à température ambiante. Lavez les lames en deux lavages successifs de tampon phosphatase.

Ensuite, rincez-les brièvement à l’eau froide pour éliminer toute tache en excès et laissez-les sécher à l’air. Avant toute évaluation toxicologique in vitro, il est important de vérifier que les sphéroïdes 3D HepG2 se sont correctement formés. Quatre jours après l’ensemencement, des sphéroïdes compacts de forme sphérique avec une surface lisse et sans projections visuelles devraient se former.

Des sphéroïdes de bonne qualité et de mauvaise qualité quatre jours après l’ensemencement sont démontrés ici. En règle générale, 90 à 95 % des sphéroïdes formés par plaque se formeront correctement et seront viables pour d’autres expérimentations. La viabilité et la fonctionnalité hépatique ont été évaluées sur une période de culture de 14 jours afin de déterminer la longévité du modèle de sphéroïde hépatique et d’établir s’il pouvait soutenir une évaluation à long terme de l’ENM ou des dangers chimiques.

La concentration d’albumine est demeurée constante pendant toute la durée de la période de culture, tandis que la production d’urée par sphéroïde a augmenté avant de commencer à diminuer au jour 14. Pour l’évaluation de la génotoxicité, l’essai des micronoyaux a été utilisé pour déterminer la présence de micronoyaux à la suite d’expositions aiguës et à long terme à l’ENM. Les sphéroïdes ont été exposés à deux ENM, le dioxyde de titane et l’argent.

Une tendance similaire à la génotoxicité a été observée après une exposition aiguë aux deux NME, mais la réponse élevée à la génotoxicité n’était pas évidente après une exposition à long terme de cinq jours. En suivant cette méthode, le surnageant et les sphéroïdes peuvent être récoltés pour une multitude de paramètres biochimiques. Il s’agit notamment de la viabilité cellulaire, des tests de la fonction hépatique, de l’analyse de la SID 450, des marqueurs inflammatoires médiocres et de l’expression génique.

Cette technique est actuellement testée dans un certain nombre de laboratoires de recherche contractuels qui souhaitent l’appliquer aux tests de géotoxicité de routine de produits chimiques et de nanomatériaux. Cela pourrait réduire le recours aux approches d’essai in vivo.