Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Ce protocole aborde deux aspects importants, la caractérisation d’une membrane intégrale essentielle, l’apolipoprotéine acyltransférase des bactéries, et le développement du test au format HDS pour dépister les inhibiteurs de l’enzyme. La méthode est très sensible et adaptée à des fins de dépistage. Il peut contribuer au développement de nouveaux antibiotiques potentiels.

Cette vidéo aidera à mettre en évidence les étapes critiques de ce protocole, telles que le mélange, le vortex, la sonication, tout en travaillant avec des suspensions contenant des lipides et des détergents non homogènes. Karine Nozeret, Aurelia Pernin, toutes deux sont boursières dans mon groupe. Commencez par préparer le mélange de réactifs pour le dosage de l’apolipoprotéine et de l’acyltransférase ou LNT.

Mélangez l’alcyne POPE et la biotine FSL-1 avec un tampon de réaction LNT dans des tubes de 1,5 millilitre à un volume final de 18 microlitres. Préparez des mélanges de réactifs en trois exemplaires pour toutes les conditions testées. Sonicez les mélanges de réactifs pendant trois minutes dans un bain d’eau à ultrasons et incuberez-les à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ajoutez ensuite du LNT actif ou inactif à une concentration finale d’un nanogramme par microlitre, et pipetez de haut en bas pour mélanger. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un mélangeur thermique avec un couvercle chauffant. Pendant ce temps, préparez une solution mère de deux milligrammes par millilitre de streptavidine.

Et diluez-le à 10 microgrammes par millilitre pour créer une solution efficace. Ajouter 100 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, séchez les puits à l’air libre pendant la nuit en incubant la plaque à 37 degrés Celsius sans couvercle.

Le lendemain, préparez des solutions mères de cinq millimolaires d’Azido-FAM, de 50 millimolaires de TCEP, de deux millimolaires de TBTA et de 50 millimolaires de sulfate de cuivre pentahydraté. Effectuez une chimie click en ajoutant 0,2 microlitre d’Azido-FAM d’origine, 0,4 microlitre de TCE d’origine et 0,2 microlitre de TBTA d’origine aux tubes de réaction LNT de 1,5 millilitre. Vortex la solution pendant cinq secondes.

Ajoutez ensuite 0,4 microlitre de sulfate de cuivre. Vortex pendant encore cinq secondes et incuber la réaction pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Pendant que le mélange de chimie click est en incubation, laver trois fois les puits des plaques recouvertes de streptavidine avec 200 microlitres de PBST1.

Transférez 18 microlitres du mélange de chimie click dans un puits enrobé de streptavidine et ajoutez 100 microlitres de PBST1 pour lier le produit N-acyl-FSL-1-biotine FAM à la plaque. Ajoutez de la biotine, de la fluorescéine à la plaque comme contrôle positif de la liaison à la streptavidine et de la lecture de la fluorescence. Ensuite, incubez la plaque à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité, tout en secouant à 300 tr/min.

Après l’incubation, utilisez une pipette électronique multicanaux pour laver manuellement la plaque six fois avec 200 microlitres de PBST2. Rincez-le trois fois avec la pipette. Lavez-le trois fois avec 200 microlitres de PBS et rincez-le trois fois de plus.

Ajoutez 200 microlitres de PBS dans chaque puits et détectez la fluorescence à 520 nanomètres dans un lecteur de microplaques. Enregistrez tous les résultats dans une feuille de calcul, puis calculez l’écart-type pour chaque réaction ainsi que les valeurs P pour les témoins négatifs et les échantillons positifs avec un test T non apparié. Le test LNT in vitro décrit ici utilise des phospholipides contenant un acide gras alcyne et la biotine FSL-1 comme substrats pour former l’alcyne FSL-1-biotine.

Lors d’une réaction chimique click avec Azido-FAM, ce produit devient marqué par fluorescence et détectable par spectrométrie de fluorescence. Les conditions de réaction ont été optimisées pour une lecture maximale de la fluorescence à 520 nanomètres. Les témoins négatifs comprenaient des réactions sans enzyme, avec une variante inactive de l’enzyme ou avec un inhibiteur spécifique des thiols, MTSES.

La biotine fluorescéine a été utilisée comme contrôle interne pour un signal de fluorescence maximal. Afin de développer un test de criblage à haut débit, les réactions ont été effectuées directement dans des plaques de 384 puits. Les étapes de lavage ont été automatisées et la quantité de réactifs a été réduite.

La réaction était sensible et reproductible, avec une différence significative du signal fluorescent entre le contrôle négatif et l’enzyme active. Pour le criblage à haut débit, le facteur premier Z détermine si une réponse dans un test est suffisamment importante à des fins de criblage. Le facteur premier Z moyen était supérieur à 0,6 pour le test LNT effectué dans un format de 384 puits, ce qui suggère qu’il était exceptionnel.

Le test en tube dans cette vidéo a été développé dans un format multi-plaques compatible avec HDS. Il peut être utilisé pour étudier d’autres acyltransférases provenant de divers organismes.