Name: Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez un dosage fluorométrique sensible pour caractériser l'activité de l'apolipoprotéine N-acyltransférase bactérienne. Cette méthode par chimie clic permet le criblage à haut débit d'inhibiteurs enzymatiques potentiels.

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Nous remercions Fabrice Agou et Alix Boucharlat de la Plateforme de Criblage Chimiogénomique et Biologique du Centre de Ressources Technologiques et de Recherche (C2RT) de l’Institut Pasteur Paris pour leurs suggestions utiles sur le protocole, tous les membres de l’Unité BGPB pour le soutien et les discussions scientifiques, et Simon Legood pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux ont été financés par Global Care Initiatives de l’Institut Carnot Maladies infectieuses et de l’Institut Carnot Microbes et Santé (15 CARN 0017-01 et 16 CARN 0023-01).

1. Préparation d’enzymes et de substrats
<ol><li>Purification de l’enzyme
	<ol><li>Produire et purifier l’enzyme Lnt à partir de membranes solubilisées détergentes comme décrit précédemment 4,8. Brièvement, induire l’expression du gène lnt-streptocoque, codant pour Lnt avec un marqueur streptococcique C-terminal, à OD 600 de 0,6 avec de la tétracycline anhydre (200 ng/mL) à 37 °C pendant 16 h.</li>
		<li>Récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Resuspendre la pastille de cellule dans le tampon WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) à 100 OD600 unités par mL.</li>
		<li>Casser les cellules par deux passages à travers une presse à cellule de pression française à 10 000 psi.</li>
		<li>Enlevez les cellules intactes et les débris par centrifugation à 13 000 x g pendant 20 min. Conserver le surnageant et jeter la pastille.</li>
		<li>Centrifuger le surnageant à 120 000 x g pendant 60 min et recueillir les vésicules membranaires (pastille de couleur brune translucide). Jetez le surnageant.</li>
		<li>Solubiliser les protéines membranaires intégrales de la pastille membranaire avec 1% (p/v) de n-dodécyl β-D-maltoside (DDM) dans le tampon WA pendant 30 min à température ambiante (RT). Centrifuger et éliminer les matières insolubilisées à 120 000 x g pendant 30 min. Utilisez la fraction surnageante pour la purification.</li>
		<li>Purifier le streptocoque Lnt sur une colonne de chromatographie d’affinité (voir le tableau des matériaux) et une colonne de filtration sur gel S400 (voir le tableau des matériaux) comme décrit par Nozeret et coll.8.</li>
		<li>Conserver l’enzyme purifiée dans un tampon WA contenant 0,05 % de DDM et 10 % de glycérol à -80 °C. NOTE: L’enzyme est stable pendant plus de 5 ans.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de substrats d’alcyne-phospholipides et de ligands stimulant les fibroblastes biotinylés (FSL-1-biotine)
	<ol><li>Aliquote 100 μL d’alcyne-POPE synthétisé sur mesure (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, voir le tableau des matières) solubilisé dans le chloroforme en tubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Percer les tubes avec une seringue et évaporer le chloroforme dans un speed-vac à TA pendant 2 h. Conserver les échantillons secs de phospholipides à -20 °C.</li>
		<li>Dissoudre l’alcyne-POPE dans du Triton X-100 à 0,1 % à 500 μM avant utilisation. Ajouter une étape de sonication de 3 minutes dans un bain-marie à ultrasons à RT pour solubiliser l’alcyne-POPE si nécessaire.</li>
		<li>Resuspendre le FSL-1-biotine dans l’eau à 445 μM. REMARQUE: Les deux solutions peuvent être conservées à -20 ° C pendant au moins 2 mois.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Essai en tube
REMARQUE : Le jour 1, mettre en place la réaction Lnt dans des tubes de 1,5 mL (étape 2.1) et enduire 96 plaques de puits de streptavidine (étape 2.2).
<ol><li>Préparation du mélange de réactifs et réaction enzymatique
	<ol><li>Pour un test Lnt standard, mélanger l’alcyne-POPE (50 μM final à partir d’un stock de 500 μM) et la biotine FSL-1 (concentration finale de 50 μM à partir d’un stock de 445 μM) dans un tampon de réaction Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contenant 1% BSA) à un volume final de 18 μL dans des tubes de 1,5 mL. Effectuez toutes les conditions en trois exemplaires.</li>
		<li>Soniquer le mélange de substrat (préparé à l’étape 2.1.1) pendant 3 min dans un bain-marie à ultrasons et incuber à 37 °C pendant 5 min avant l’ajout de l’enzyme Lnt (étape 2.1.3). REMARQUE: MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate), un réactif spécifique du thiol, inhibe le Lnt8. Ajouter 10 mM de MTSES (solution mère de 100 mM dans du DMSO à 100 %) dans les tubes de réaction (étape 2.1.1) pour être utilisés comme échantillons témoins négatifs. Ajustez le volume du tampon de réaction Lnt de sorte que le volume total soit de 18 μL.</li>
		<li>Ajouter du Lnt actif (1 ng/μL, correspondant à 17,2 nM) ou inactif (C387S) (2 μL de 10 ng/μL de stock dans un tampon WA contenant 0,05 % de DDM) et mélanger avec les substrats (étape 2.1.2) en pipetant de haut en bas.</li>
		<li>Incuber la réaction à 37 °C pendant 16 h dans un thermomélangeur avec couvercle chauffant.</li>
	</ol></li>
	<li>Revêtement de streptavidine de 96 plaques de puits
	<ol><li>Préparer une solution mère de streptavidine à 2 mg/mL dansH2O. REMARQUE: Cette solution peut être conservée à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
		<li>À partir de la solution mère, préparer 10 μg/mL de streptavidine dans de l’eau comme solution de travail. Ajouter 100 μL de la solution à chaque puits de la plaque de 96 puits. Lier la streptavidine à la plaque en incubant à 37 °C pendant une nuit sans couvercle pour sécher les puits à l’air.</li>
	</ol></li>
</ol>REMARQUE: Le jour 2, effectuez la chimie de clic (étape 2.3), liez le mélange réactionnel Lnt aux plaques recouvertes de streptavidine (étape 2.4), détectez la fluorescence et analysez les résultats (étape 2.5).
<ol start="3"><li>Réaction de chimie de clic
	<ol><li>Préparer des solutions mères d’Azido-FAM (5 mM dans du DMSO), de TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine; 50 mM préparé dans l’eau), de TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine; 2 mM dans du tert-butanol:DMSO (4:1)), et de CuSO4∙5H2O(50 mM fraîchement préparé dansH2O).</li>
		<li>Dans les tubes de 1,5 mL contenant le mélange réactionnel Lnt préparé à l’étape 2.1.4, effectuer la chimie par clic en ajoutant les réactifs dans l’ordre suivant : 0,2 μL d’Azido-FAM brut (concentration finale 50 μM), 0,4 μL de TCEP mère (concentration finale 1 mM), 0,2 μL de TBTA mère (concentration finale 0,02 mM).</li>
		<li>Vortex la solution pendant 5 s. Ajouter ensuite 0,4 μL de CuSO4 mère (concentration finale 1 mM). Vortex à nouveau pendant 5 s. Incuber les échantillons dans l’obscurité à TA pendant 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Liaison du mélange réactionnel Lnt à des plaques recouvertes de streptavidine
	<ol><li>Laver les puits des plaques recouvertes de streptavidine après l’incubation nocturne de l’étape 2.2.2 3x avec 200 μL de PBS-T1 (PBS contenant 0,05 % de Tween-20). NOTE: Les plaques de streptavidine peuvent être utilisées immédiatement ou stockées au sec à 4 ° C.</li>
		<li>Transférer 18 μL du mélange click-chimie de l’étape 2.3.3 vers un puits dans une plaque recouverte de streptavidine à 96 puits et ajouter 100 μL de PBS-T1 pour lier le produit N-acyl-FSL-1-biotine-FAM aux plaques de streptavidine.</li>
		<li>Utiliser la biotine-fluorescéine (0,26 μM à partir d’un stock de 3,1 mM dans le DMSO) comme témoin positif pour la liaison à la streptavidine et la lecture de la fluorescence.</li>
		<li>Incuber les plaques à TA pendant 1 h dans l’obscurité dans un thermomélangeur, en agitant à 300 tr / min.</li>
		<li>Effectuer les étapes de lavage manuel des 96 plaques de puits avec une pipette électronique multicanal comme suit : six lavages avec 200 μL de PBS-T2 (PBS contenant 1% de Tween-20), trois rinçages avec une pipette, trois lavages avec 200 μL de PBS, trois rinçages avec une pipette.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection et analyse de fluorescence
	<ol><li>Ajouter 200 μL de PBS et enregistrer la fluorescence à 520 nm dans un lecteur de microplaques à fluorescence. Enregistrez les résultats dans un tableur. REMARQUE: La biotine-fluorescéine est utilisée comme témoin positif pour la liaison à la streptavidine et la détection de fluorescence à 520 nm. Une lecture reproductible de 30 000 à 40 000 U.A. avec 0,26 μM de biotine-fluorescéine est attendue. Tous les échantillons sont analysés en trois exemplaires, y compris les témoins.</li>
		<li>Calculer l’écart-type pour chaque réaction et calculer les valeurs P pour les témoins négatifs et les échantillons positifs à l’aide du test t non apparié à l’aide d’un logiciel statistique.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Dosage sur plaque multipuits
REMARQUE : Le jour 1, mettre en place la réaction Lnt dans 384 plaques de puits (étape 3.1) et enduire 384 plaques de puits de streptavidine (étape 3.2).
<ol><li>Préparation du mélange de réactifs et réaction enzymatique NOTE: La quantité de réactifs et d’enzymes est réduite par rapport au test en tube et la réaction Lnt est effectuée directement dans 384 plaques de puits. Cela permet d’utiliser moins de matériel et une réduction des étapes qui peuvent être davantage automatisées.<ol><li>Mélanger les substrats comme suit : alcyne-POPE (concentration finale de 50 μM à partir d’un stock de 500 μM) et FSL-1-biotine (50 μM final à partir de 500 μM stock) dans un tampon réactionnel Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contenant 1% BSA) à un volume de 13,5 μL par réaction par puits dans un format de plaque de 384 puits. Effectuez toutes les conditions en trois exemplaires. Calculer la quantité totale de réactifs requis pour le nombre de réactions à effectuer (c.-à-d. 5 184 μL pour une plaque de 384 puits).</li>
		<li>Soniquer le mélange de substrat pendant 3 min dans un bain-marie à ultrasons.</li>
		<li>Aliquote 13,5 μL du mélange de substrat par puits dans une plaque de 384 puits. REMARQUE: En tant que témoin négatif, 10 mM de MTSES (solution mère de 625 mM dans 100% DMSO) peuvent être ajoutés par puits. Ajuster le volume du tampon Lnt (étape 3.1.1) pour atteindre un volume de réaction final de 13,5 μL.</li>
		<li>Incuber à 37 °C pendant 5 minutes avant l’ajout de l’enzyme Lnt (étape 3.1.5).</li>
		<li>Ajouter 0,5 ng/μL (correspondant à 8,6 nM) d’enzyme Lnt active, ou variante inactive (C387S) (1,5 μL à partir d’un stock de 5 ng/μL dans un tampon WA contenant 0,05 % de DDM) dans un tampon réactionnel Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA) à chaque puits contenant le mélange réactionnel de l’étape 3.1.3. Mélanger les réactifs en les pipetant de haut en bas. Le volume total de réaction est de 15 μL.</li>
		<li>Scellez la plaque avec une feuille de plastique pour les plaques multipuits.</li>
		<li>Incuber à 37 °C pendant 16 h dans un thermomélangeur avec couvercle chauffant.</li>
	</ol></li>
	<li>Revêtement de streptavidine 384 plaques de puits<ol><li>Utiliser 75 μL de streptavidine (10 μg/mL dansH2O) de l’étape 2.2.2 pour enduire les puits d’une plaque de 384 puits. Laisser la streptavidine se lier à la plaque en incubant à 37 °C pendant la nuit sans couvercle pour sécher les puits à l’air.</li>
	</ol></li>
</ol>REMARQUE: Le jour 2, effectuez la chimie de clic (étape 3.3), liez le mélange réactionnel Lnt aux plaques recouvertes de streptavidine (étape 3.4), détectez la fluorescence et analysez les résultats (étape 3.5).
<ol start="3"><li>Réaction de chimie de clic<ol><li>Préparer des solutions mères d’Azido-FAM (1,2 mM dans du DMSO), de TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine ; 24 mM préparé dans H2O), de TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine ; 0,48 mM dans du tert-butanol:DMSO (4:1)) et de CuSO4∙5H2O(24 mM fraîchement préparé dansH2O).</li>
		<li>Combinez les trois réactifs de chimie de clic : un mélange d’Azido-FAM (concentration finale de 50 μM), de TCEP (1 mM final) et de TBTA (0,02 mM final), chacun à 0,75 μL dans un volume final de 2,25 μL par puits. Calculer le volume requis par plaque de 384 puits (c.-à-d. utiliser 864 μL lorsque tous les puits de la plaque de 384 puits sont utilisés). Mélanger vigoureusement.</li>
		<li>Ajouter 2,25 μL de la solution de réactif par puits directement à la réaction Lnt terminée dans la plaque de 384 puits de l’étape 3.1.7.</li>
		<li>Mélanger en pipetant de haut en bas avec une pipette électronique multicanal.</li>
		<li>Ajouter CuSO4 (0,75 μL à partir d’un stock de 24 mM pour une concentration finale de 1 mM) et mélanger en pipetant de haut en bas avec une pipette électronique multicanal.</li>
		<li>Incuber à TA pendant 1 h dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Liaison du mélange réactionnel Lnt à 384 plaques de puits recouvertes de streptavidine
	<ol><li>Laver les puits des plaques recouvertes de streptavidine après l’incubation nocturne de l’étape 3.2.1 1x avec 85 μL PBS-T1.</li>
		<li>Transférer 11 μL de la réaction de chimie de clic de chaque puits de la plaque d’incubation de l’étape 3.3.6 à la plaque recouverte de streptavidine de l’étape 3.4.1 pour lier le produit N-acyl-FSL-1-biotine-FAM aux plaques de streptavidine.</li>
		<li>Ajouter 64 μL de tampon PBS-T1.</li>
		<li>Inclure la biotine-fluorescéine (0,19 μM à partir d’un stock de 3,1 mM dans le DMSO) comme témoin de la liaison aux puits recouverts de streptavidine.</li>
		<li>Incuber les 384 plaques de puits à TA pendant 1 h dans l’obscurité dans un thermomélangeur, en agitant à 300 tr/min.</li>
		<li>Lavez les assiettes à l’aide d’un laveur de plaques automatisé comme suit : 10 lavages avec 85 μL de PBS-T2, les plaques sont agitées entre les lavages; 5 lavages avec 85 μL PBS, les plaques sont agitées entre les lavages.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection et analyse de fluorescence
	<ol><li>Ajouter du PBS (85 μL) et enregistrer la fluorescence dans un lecteur de microplaques à fluorescence à 535 nm.</li>
		<li>Analyser les données comme décrit (étape 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole du test Lnt décrit ici, basé sur la détection par fluorescence du produit triacylé, est sensible et reproductible. La liaison spécifique et efficace de la biotine à la streptavidine est un élément clé du test. Le substrat alcyne-POPE laissé après l’achèvement de la réaction Lnt est également marqué par fluorescence avec FAM, mais est efficacement éliminé après s’être lié aux plaques de streptavidine par plusieurs étapes de lavage. De plus, l’ajout de DMSO n’affecte pas l’activité du Lnt et n’a aucun impact s...

Les lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par des acides gras liés par covalence au niveau de leurs amino-terminus à travers lesquels elles sont ancrées dans les membranes 1,2. La partie mature de la protéine est très diversifiée dans sa structure et sa fonction, ce qui explique le rôle des lipoprotéines dans divers processus biologiques dans l’enveloppe cellulaire bactérienne.
Les lipoprotéines sont modifiées par les acides gras dérivés des phospholipides après insertion dans la membrane cytoplasmique. Les prolipoprotéines contiennent un motif de signature, la lipobox, qui contient un résidu de cystéine invariant qui devient acylé et le premier acide aminé dans la protéine mature. La première étape de cette voie est catalysée par la prolipoprotéine phosphatidylglycérol::d iacylglycéryl transférase (Lgt), qui transfère le groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine via un lien thioéther entre le diacylglycéryle et la cystéine. La peptidase signal II (Lsp) clive le peptide signal de la prolipoprotéine diacylglycéryle, ce qui donne une apolipoprotéine qui est ancrée dans la membrane par sa fraction diacylglycéryle. La troisième et dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt), qui ajoute un acide gras de la position sn-1 du phospholipide sur l’apolipoprotéine, ce qui donne des lipoprotéines matures triacylées (Figure 1)3. La réaction Lnt est une réaction de ping-pong en deux étapes où un intermédiaire de l’enzyme acyle thioester stable est formé. Le sous-produit lysophospholipide est libéré avant l’acylation du substrat de l’apolipoprotéine dans la deuxième étape de la réaction.
La spécificité du substrat phospholipide est déterminée dans un test Lnt basé sur le décalage de mobilité du peptide N-acyl diacylglycéryle sur un pourcentage élevé de tris-tricine urée SDS-PAGE4. Les phospholipides avec de petits groupes de tête polaires, saturés [sn-1] et non saturés [sn-2], étaient des substrats préférés 4. Le test de décalage de gel n’est pas approprié pour des études cinétiques approfondies de l’apolipoprotéine N-acyltransférase ni pour que HTS identifie des molécules inhibitrices. La chimie du clic utilisant des acides gras alcynes a été utilisée avec succès pour étudier la modification des lipoprotéines chez les bactéries5 et le métabolisme des acides gras chez les eucaryotes6. Récemment, un essai in vitro de Ras palmitoylation a été signalé pour identifier les inhibiteurs7.
Dans la méthode décrite ici, le Lnt actif purifié dans le détergent est incubé avec des substrats dans des micelles mixtes pour former un peptide alcyne-triacylé qui est ensuite détecté par spectrométrie de fluorescence.

<table><tbody><tr><td>&Auml ; kta Purificateur système FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Pureté : NA Lnt purification</td></tr><tr><td>alcyne-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Pureté : >99 % Substrat Lnt</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Pureté : 100 % (pur) Réactif Click</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pureté : NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select laveuse de plaques</td><td>BioTek</td><td>N&deg ; serie 115800, n&deg ; materiel 405 Select</td><td>Purity : NA Étapes de lavage</td></tr><tr><td>biotine-fluorescéine</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Purity : &ge ; 90 % Contrôle de fluorescence</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II) pentahydraté</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Pureté : &ge ; 98 % Réactif Click</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Pureté : &ge ; 99 % &beta ;+&alpha ;; < 15 % &alpha ; Détergent pour la purification</td></tr> du <tr><td>Lnt Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Pureté : anhydre Solbilisation Click réactif Pipette</td></tr><tr><td>électronique Voyager 8 canaux 0,5-12,5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Pureté : NA Réactifs de manipulation</td></tr> French <tr><td>Pressure Cell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purity : NA Rupture cellulaire</td></tr><tr><td>FSL-1-biotine</td><td>Microcollections EMC</td><td>L7030</td><td>Pureté : NA Substrat Lnt</td></tr><tr><td>Microplaque en polystyrène CELLSTAR standard à 384 puits</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Pureté : NA Noir avec fond transparent (lecture vers le haut ou par le bas)</td></tr><tr><td>Plaque de polystyrène stérile à 96 puits Greiner Bio-One, 655097 à haute liaison</td><td>Greiner</td><td></td><td>Pureté : NA Noir avec fond transparent (lecture vers le haut ou par le bas)</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Pureté : NA Détection de fluorescence</td></tr><tr><td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Pureté : ~100 % Inhibiteur spécifique du thiol</td></tr><tr><td>Feuilles d’étanchéité adhésives optiquement transparentes</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Pureté : NA Feuille pour sceller plaque multipuits</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel colonne de filtration</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Pureté : NA Lnt purification</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnology</td><td>2-1201-010</td><td>Pureté : NA Lnt purification</td></tr><tr><td>streptavidine</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Pureté : &ge ; 13 unités/mg protéine Liaison à la biotine</td></tr><tr><td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Pureté : 97 % Réactif Click</td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyéthyl)chlorhydrate de phosphine</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Pureté : &ge ; 98 % Réactif à clic</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Pureté : NA Détection de fluorescence</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Pureté : NA Détection de fluorescence</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Pureté : NA Couvercle chauffant</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Pureté : 10 % en H2O Tampon de réaction Lnt</td></tr><tr><td>Ultra centrifugeuse</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Pureté : NA Fractionnement cellulaire</td></tr></tbody></table>

dosage fluorométrique basé sur la chimie clic pour l’apolipoprotéine n-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Les lipoprotéines des protéobactéries sont modifiées post-traductionnellement par des acides gras dérivés des phospholipides membranaires par l’action de trois enzymes membranaires intégrales, ce qui donne des protéines triacylées. La première étape de la voie de modification des lipoprotéines implique le transfert d’un groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine, ce qui entraîne la prolipoprotéine diacylglycéryle. Dans la deuxième étape, le peptide signal de la prolipoprotéine est clivé, formant une apolipoprotéine, qui à son tour est modifiée par un troisième acide gras dérivé d’un phospholipide. Cette dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt). La voie de modification des lipoprotéines est essentielle dans la plupart des γ-protéobactéries, ce qui en fait une cible potentielle pour le développement de nouveaux agents antibactériens. Décrit ici est un test sensible pour le Lnt qui est compatible avec le criblage à haut débit de petites molécules inhibitrices. L’enzyme et les substrats sont des molécules enfouies dans la membrane; Par conséquent, le développement d’un test in vitro n’est pas simple. Cela comprend la purification de l’enzyme active en présence de détergent, la disponibilité d’alcynes-phospholipides et de substrats peptidiques diacylglycéryliques, et les conditions de réaction dans des micelles mixtes. De plus, afin d’utiliser le test d’activité dans une configuration de criblage à haut débit (HTS), la lecture directe du produit de réaction est préférable aux réactions enzymatiques couplées. Dans ce dosage enzymatique fluorométrique, le produit peptidique alcyne-triacylé est rendu fluorescent par une réaction de chimie de clic et détecté dans un format de plaque multipuits. Cette méthode est applicable à d’autres acyltransférases qui utilisent des substrats contenant des acides gras, y compris les phospholipides et l’acyl-CoA.

Dans la réaction Lnt, l’acide gras sn-1 des phospholipides est transféré sur un peptide diacylglycéryle, ce qui donne un peptide triacylé8 mature. Le test Lnt in vitro décrit ici est conçu pour utiliser des phospholipides contenant un acide gras alcyne (alcyne-POPE) et FSL-1-biotine comme substrats, entraînant la formation d’alcyne-FSL-1-biotine. Lors d’une réaction de chimie de clic avec l’azido-FAM, ce produit doit être marqué par fluorescence et détecté par spectrométrie de fluorescenc...

Présenté ici est un test de fluorescence sensible pour surveiller l’activité de l’apolipoprotéine N-acyltransférase en utilisant le peptide diacylglycéryle et les alcyne-phospholipides comme substrats avec la chimie click.

Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Ce protocole aborde deux aspects importants, la caractérisation d’une membrane intégrale essentielle, l’apolipoprotéine acyltransférase des bactéries, et le développement du test au format HDS pour dépister les inhibiteurs de l’enzyme. La méthode est très sensible et adaptée à des fins de dépistage. Il peut contribuer au développement de nouveaux antibiotiques potentiels.Cette vidéo aidera à mettre en évidence les étapes critiques de ce protocole, telles que le mélange, le vortex, la sonication, tout en travaillant avec des suspensions contenant des lipides et des détergents non homogènes. Karine Nozeret, Aurelia Pernin, toutes deux sont boursières dans mon groupe. Commencez par préparer le mélange de réactifs pour le dosage de l’apolipoprotéine et de l’acyltransférase ou LNT.Mélangez l’alcyne POPE et la biotine FSL-1 avec un tampon de réaction LNT dans des tubes de 1,5 millilitre à un volume final de 18 microlitres. Préparez des mélanges de réactifs en trois exemplaires pour toutes les conditions testées. Sonicez les mélanges de réactifs pendant trois minutes dans un bain d’eau à ultrasons et incuberez-les à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ajoutez ensuite du LNT actif ou inactif à une concentration finale d’un nanogramme par microlitre, et pipetez de haut en bas pour mélanger. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un mélangeur thermique avec un couvercle chauffant. Pendant ce temps, préparez une solution mère de deux milligrammes par millilitre de streptavidine.Et diluez-le à 10 microgrammes par millilitre pour créer une solution efficace. Ajouter 100 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, séchez les puits à l’air libre pendant la nuit en incubant la plaque à 37 degrés Celsius sans couvercle.Le lendemain, préparez des solutions mères de cinq millimolaires d’Azido-FAM, de 50 millimolaires de TCEP, de deux millimolaires de TBTA et de 50 millimolaires de sulfate de cuivre pentahydraté. Effectuez une chimie click en ajoutant 0,2 microlitre d’Azido-FAM d’origine, 0,4 microlitre de TCE d’origine et 0,2 microlitre de TBTA d’origine aux tubes de réaction LNT de 1,5 millilitre. Vortex la solution pendant cinq secondes.Ajoutez ensuite 0,4 microlitre de sulfate de cuivre. Vortex pendant encore cinq secondes et incuber la réaction pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Pendant que le mélange de chimie click est en incubation, laver trois fois les puits des plaques recouvertes de streptavidine avec 200 microlitres de PBST1.Transférez 18 microlitres du mélange de chimie click dans un puits enrobé de streptavidine et ajoutez 100 microlitres de PBST1 pour lier le produit N-acyl-FSL-1-biotine FAM à la plaque. Ajoutez de la biotine, de la fluorescéine à la plaque comme contrôle positif de la liaison à la streptavidine et de la lecture de la fluorescence. Ensuite, incubez la plaque à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité, tout en secouant à 300 tr/min.Après l’incubation, utilisez une pipette électronique multicanaux pour laver manuellement la plaque six fois avec 200 microlitres de PBST2. Rincez-le trois fois avec la pipette. Lavez-le trois fois avec 200 microlitres de PBS et rincez-le trois fois de plus.Ajoutez 200 microlitres de PBS dans chaque puits et détectez la fluorescence à 520 nanomètres dans un lecteur de microplaques. Enregistrez tous les résultats dans une feuille de calcul, puis calculez l’écart-type pour chaque réaction ainsi que les valeurs P pour les témoins négatifs et les échantillons positifs avec un test T non apparié. Le test LNT in vitro décrit ici utilise des phospholipides contenant un acide gras alcyne et la biotine FSL-1 comme substrats pour former l’alcyne FSL-1-biotine.Lors d’une réaction chimique click avec Azido-FAM, ce produit devient marqué par fluorescence et détectable par spectrométrie de fluorescence. Les conditions de réaction ont été optimisées pour une lecture maximale de la fluorescence à 520 nanomètres. Les témoins négatifs comprenaient des réactions sans enzyme, avec une variante inactive de l’enzyme ou avec un inhibiteur spécifique des thiols, MTSES.La biotine fluorescéine a été utilisée comme contrôle interne pour un signal de fluorescence maximal. Afin de développer un test de criblage à haut débit, les réactions ont été effectuées directement dans des plaques de 384 puits. Les étapes de lavage ont été automatisées et la quantité de réactifs a été réduite.La réaction était sensible et reproductible, avec une différence significative du signal fluorescent entre le contrôle négatif et l’enzyme active. Pour le criblage à haut débit, le facteur premier Z détermine si une réponse dans un test est suffisamment importante à des fins de criblage. Le facteur premier Z moyen était supérieur à 0,6 pour le test LNT effectué dans un format de 384 puits, ce qui suggère qu’il était exceptionnel.Le test en tube dans cette vidéo a été développé dans un format multi-plaques compatible avec HDS. Il peut être utilisé pour étudier d’autres acyltransférases provenant de divers organismes.

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