Traçage de lignée et analyse clonale dans le développement du cortex cérébral à l’aide de l’analyse mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM)
May 8th, 2020
Un protocole pour effectuer le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau d’une seule cellule à l’aide de l’analyse de mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM) est présenté. L’analyse clonale de MADM fournit un cadre quantitatif pour mesurer le comportement prolifératif, la sortie cellulaire, et la relation de lignée des ancêtres individuels et de leurs cellules de fille.
Mosaic Analysis avec double marqueurs technologie est une méthode puissante qui peut fournir des informations hautement quantitatives sur le comportement de prolifération et les sorties de cave des cellules souches individus. Une caractéristique unique de cette technique, c’est qu’elle permet le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau de la cellule unique. Pour induire des événements de recombinaison MADM chez des souris expérimentales, utilisez une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de calibre 25 pour livrer une seule injection de Tamoxifène Intraperitoneal dans une période jusqu’à la mère enceinte. De l’analyse clonale MADM aux points de temps postnatals. Les jours embryonnaires 18 à 19, placer une souris enceinte dans la position supine et désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol. Faire une petite incision dans la peau dans le bas-ventre au-dessus de l’utérus et faire une deuxième incision à travers les muscles et la paroi musculaire abdominale pour révéler le péritoine. Utilisez des ciseaux pour séparer l’utérus des tissus environnants et placez l’utérus intact dans un gant avec de l’eau chaude. Ensuite, utilisez des ciseaux à pointe fine et les doigts pour ouvrir soigneusement les parois utérine pour libérer les embryons. Nettoyez les chiots en appuyant doucement sur la poitrine de temps en temps pour commencer à respirer avant de transférer les animaux prénatals à une mère adoptive. Pour recueillir le tissu clone MADM neural placer un animal anesthésié dans la position supine sur un plateau de chirurgie de perfusion et désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une incision à travers la peau et une incision à travers la couche musculaire. Lorsque la cavité thoracique est visible, renifler et soulever le diaphragme pour révéler le cœur et soigneusement couper et épingler la cage thoracique au tray.insert chirurgical une aiguille reliée à un tube pompe périssaliste rempli de PBS dans le ventricule inférieur gauche du cœur et utiliser de petits ciseaux Iris pour faire une incision dans l’extrémité postérieure de l’oreillette droite. Perfuser le système cardiovasculaire avec le PBS suivi immédiatement par perfusion avec de la glace fraîchement préparée froid 4%paraformaldéhyde dans PBS. Lorsque la perfusion est terminée, enlever le cerveau par dissection soigneuse et placer l’organe récolté dans au moins cinq fois le volume cérébral de 4% de paraformaldéhyde frais pendant la nuit à 4
Aperçu
Cette étude présente un protocole pour le traçage de lignée et l'analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau de la cellule unique en utilisant l'Analyse Mosaïque avec Doubles Marqueurs (MADM). L'analyse clonale MADM permet la mesure quantitative du comportement prolifératif et de la production cellulaire des progéniteurs individuels et de leurs cellules descendantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Traçage de lignée
- Analyse génétique
- Biologie des cellules souches
Contexte
- La technologie MADM est essentielle pour comprendre la prolifération cellulaire.
- La méthode permet le traçage au niveau de la cellule unique.
- Les applications incluent l'évaluation des productions cellulaires et des relations de lignée.
Méthodes utilisées
- Analyse Mosaïque avec Doubles Marqueurs (MADM)
- Modèle expérimental : Souris
- Les techniques comprennent les injections intrapéritonéales et la perfusion des tissus.
Résultats principaux
- Permet un examen détaillé du comportement des progéniteurs.
- Fournit des informations sur les relations de lignée des cellules filles.
- Démontre une méthode fiable pour l'analyse génétique fonctionnelle.
Conclusions
- Cette étude fournit un protocole complet pour l'utilisation de MADM dans l'analyse génétique.
- Les résultats contribuent de manière significative au domaine de la biologie du développement.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
