Un système gnotobiotique pour l’étude de l’assemblage de microbiome dans la Phyllosphère et dans la fermentation végétale

À l’aide de ce protocole, nous pouvons répondre à des questions clés sur la façon dont les microbes s’assemblent et interagissent dans la phyllosphère. Il a l’avantage supplémentaire qu’en utilisant l’extrait stérile de légume, nous pouvons relier la structure des communautés de sphère de phyllo à leur fonction pendant la fermentation végétale. Ces techniques permettent aux scientifiques de tester comment les microbes interagissent dans la sphère phyllo, puis de suivre comment ces communautés de sphère phyllo peuvent avoir un impact sur la fermentation.

Pour stériliser à la surface les graines de chou, commencez par placer 100 graines dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de 70% d’éthanol au tube et le vortex pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une pipette pour jeter l’éthanol.

Ajouter un millilitre de 50% d’eau de Javel et vortexer le tube pendant cinq minutes, puis jeter l’eau de Javel. Rincer les graines quatre fois, en ajoutant un millilitre d’eau déionisée autoclavée tourbillonnant le tube, puis en jetant l’eau. Après le dernier rinçage, faire tremper les graines dans de l’eau désionisée stérilisée pendant deux à huit heures pour ramollir la couche de graines avant de la planter.

Pesez 10 grammes d’argile de calcium propre dans un tube en verre de 15 par 2,5 centimètres. Ajouter environ neuf millilitres de bouillon de SP préparé à chaque tube pour couvrir l’argile calcique. Chapeauez lâchement les tubes en verre avec des bouchons de tube à essai à deux sens de 22 millimètres.

Autoclave les tubes à 121 degrés Celsius pendant 60 minutes. Lorsque vous retirez les tubes de l’autoclave, poussez les bouchons sur les tubes de verre pour les sceller, puis refroidissez les tubes à température ambiante avant utilisation. Lorsque les tubes ont refroidi, utiliser des forceps extra longs pour placer délicatement une graine de chou stérile au centre de chaque tube.

Lacillez les tubes dans un plateau à sept voies et placez le plateau sous des supports légers avec un cycle lumineux de 16 heures à 24 degrés Celsius. Les graines développeront leur première vraie feuille au bout de cinq jours, qui est la première feuille vasculaire après la formation des cotyléons. Il a un bord froissé et est couvert de tricombs.

Pour tester la stérilité du chou exempt de germes, saisir délicatement la base de la plante avec des forceps stérilisés et le retirer. Avant d’enlever complètement le chou du tube, couper soigneusement les racines avec des ciseaux de dissection stérilisés. Ensuite, compactez les feuilles de chou dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Ajouter 400 microlitres de PBS à chaque tube de micro centrifugeuse et utiliser un micro pilon stérile pour homogénéiser le chou. Lame 100 microlitres du chou homogénéiser sur les plaques d’agar, en s’assurant d’utiliser une pointe de pipette orifice large. Pour faire des stocks de glycérol de souches inoculantes, striez doucement les colonies individuelles sur deux ou trois nouvelles plaques d’un même média.

Ramer les colonies pendant deux à cinq jours, puis les gratter des plaques dans un tube conique de 15 millilitres avec 15 millilitres de 15% glycérol. Vortex le tube à fond pour mélanger. Aliquot un millilitre du stock mixte de glycérol dans un tube de micro centrifugeuse et le stocker 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à utiliser avec les 14 millilitres restants de stock de glycérol.

Une semaine avant l’utilisation, décongeler l’aliquot d’un millilitre sur la glace et le placer à plusieurs dilutions différentes pour déterminer la concentration du stock d’inoculation. Lorsqu’il est prêt à inoculer le chou, décongeler le bouillon de glycérol sur la glace et le diluer à la concentration désirée. Ajouter 10 millilitres de bouillon dilué à la bouteille stérile de la pompe et pomper cinq pulvérisations dans un grand bécher de collecte des déchets.

Retirer le couvercle du tube de chou et incliner le chou vers le vaporisateur. Vaporiser chaque chou avec trois pompes de la solution d’inoculation, puis récolter un sous-ensemble de choux pour évaluer la concentration réelle d’inoculation des intrants. Pour récolter le chou, retirez-le du tube avec des forceps stérilisés.

Coupez les racines avec des ciseaux de dissection stériles et placez-les soigneusement dans un tube de micro centrifugeuse stérile prélouté. Enregistrez le poids du chou pour les calculs futurs. Ajouter 400 microlitres de PBS à chaque tube avec le chou et le moudre 30 fois avec un micro pilon, puis plaquer le chou homogénéisé à l’aide de larges pointes de pipette orifice.

Retirer et jeter les feuilles les plus externes du chou et hacher le reste du chou pour l’insérer dans un mélangeur. Mélangez-le à une pulpe fine et pesez l’homogénéité du chou. Ajouter deux millilitres d’eau distillée par gramme de chou.

Filtrez ensuite le lisier de chou à travers deux couches de filtres à café panier. Distribuez le lisier dans des tubes de centrifugeuse et centrifugez-le à 20 000 fois G pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que de grosses particules se déposent hors de solution. Retirer le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger les débris de chou granulés.

Pour recréer les conditions de fermentation avec des concentrations de sel standard, ajouter 2% de poids au chlorure de sodium volume à l’extrait. Bilder l’extrait de légumes avec un filtre de 0,2 micromètre attaché à un vide, le distribuer dans des tubes stériles et le congeler à moins 80 degrés Celsius. La méthode de stérilisation des graines a été testée avec plusieurs choux Napa et ils ont tous démontré des taux de croissance similaires.

Cependant, d’autres espèces de brassica ont donné un succès limité parce que les plantes ont eu des taux de germination bas après stérilisation ou la tige s’est allongée rapidement pour faire une plante épineux malsain. Les isolats microbiens ont été inoculés soit sous forme d’isolats de souche unique, soit en combinaison avec un autre isolat. Au total, 15 choux sans germes ont été testés pour chaque traitement et récoltés immédiatement, à quatre jours ou 10 jours après l’inoculation.

Les isolats ont démontré une croissance rapide dans la phyllosphère du chou Napa. Deux levures et trois bactéries ont été inoculées en trois types différents d’extrait végétal stérile ou SVE à base de chou rouge, vert et napa. La croissance des inoculats a été enregistrée sur 14 jours en placage poncant cinq microlitres de chaque traitement sur des plaques d’agar MRS ou YPD.

Les mesures du pH tout au long de la fermentation ont montré que les bactéries lactiques étaient capables d’acidifier le SVE à des niveaux inférieurs au pH quatre, ce qui indique un ferment sans danger pour la consommation. Ces méthodes ont spécifiquement appliqué au microbiome de chou mais pourraient être utiles dans d’autres systèmes végétaux. Il peut être difficile de garder le système stérile, nos protocoles de contour sont détaillés, mais nous avons trouvé chaque étape importante.