Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

Le protocole de lithographie des nanosphères présenté ici pour la fabrication de guides d’ondes en mode zéro est une méthode accessible et peu coûteuse qui ne nécessite aucun outil ou installation de fabrication spécialisée. Cette méthode sera utile pour la biophysique des molécules uniques et permettra à un plus grand nombre de chercheurs d’effectuer des expériences sur des molécules uniques à des concentrations biologiquement pertinentes de réactifs fluorescents. Pour créer une surface propre pour le dépôt par évaporation des particules colloïdales, placez les lamelles en verre borosilicaté optique dans les inserts rainurés d’un pot de coloration en verre Coplin.

Remplissez le pot de coloration avec suffisamment d’acétone pour couvrir les lamelles et couvrez le pot. Sonicez le pot pendant 10 minutes à 40 degrés Celsius. Versez l’acétone et rincez les lamelles trois fois à l’eau distillée.

Après avoir répété la sonication et l’acétone, remplissez le bocal avec suffisamment d’hydroxyde de potassium pour couvrir les lamelles. Sonicez à nouveau le bocal, couvert, pendant 20 minutes à 40 degrés Celsius. Rincez les lamelles à l’eau distillée six fois, puis faites-les sioniser dans de l’éthanol pendant 10 minutes à 40 degrés Celsius.

Après avoir lavé les lamelles trois fois avec de l’eau distillée, prélevez délicatement chaque lamelles sur le bord à l’aide d’une pince. Séchez chaque lamelle avec de l’azote gazeux et placez chaque lamelle propre et sèche et sa propre boîte de Pétri. Centrifugeuse 50 microlitres de billes de polystyrène non fonctionnalisées d’un micron.

Jetez le surnageant en laissant le moins d’eau possible. Remettre les billes en suspension dans 50 microlitres de solvant, puis bien mélanger par pipetage. Pour mettre en place une chambre d’humidité pour le dépôt, disposez six boîtes de Pétri à la suite.

Placez une lamelle dans chaque boîte de Pétri et laissez les couvercles légèrement entrouverts avec les lamelles positionnées de manière à être exposées à l’environnement. Centrez un hygromètre et un petit ventilateur électrique derrière les boîtes de Pétri, puis enregistrez l’humidité relative dans le laboratoire. Remplissez un bécher de 200 millilitres avec 150 à 200 millilitres d’eau à environ 75 degrés Celsius et placez le bécher derrière le ventilateur.

Allumez le ventilateur, puis couvrez les boîtes de Pétri, le ventilateur, le bécher et l’hygromètre avec un récipient de stockage en plastique transparent renversé. Lorsque l’humidité relative atteint 70 à 75 %, soulevez légèrement le récipient de stockage en plastique et fermez rapidement les couvercles des boîtes de Pétri pour éviter de trop mouiller les lamelles. Lorsque l’humidité relative dans la chambre atteint 85 %, pipetez cinq microlitres de suspension de billes au centre de chaque lamelle.

Couvrez chaque boîte de Pétri immédiatement après le dépôt et gardez le tout couvert dans le récipient de stockage entre les dépôts. Les dépôts de billes doivent être terminés le plus rapidement possible afin de minimiser la perte d’humidité. Si les dépôts sont trop secs ou humides, l’humidité de la chambre est la variable la plus importante à optimiser.

Lorsque les six dépôts sont terminés, notez l’humidité relative dans la chambre et laissez les gouttelettes de billes se répandre et sécher pendant cinq minutes. Pour fournir une surface de température uniforme pour le recuit des billes de polystyrène, placez une plaque d’aluminium plate et fraisée sur une plaque chauffante en céramique standard et réglez la température de la plaque chauffante à 107 degrés Celsius, la température de transition vitreuse du polystyrène. Placez une lamelle contenant le gabarit de perle sur la plaque d’aluminium chaude.

Après l’avoir recuit pendant 20 secondes, retirez la lamelle de la plaque d’aluminium et placez-la rapidement sur une surface en aluminium à température ambiante pour qu’elle refroidisse. À l’aide d’un dépôt par évaporation thermique, déposer 300 nanomètres de cuivre à deux angströms par seconde sur des lamelles contenant les gabarits de billes. Cela générera des poteaux dans les interstices entre les perles.

Pour retirer l’excès de cuivre des perles, appuyez doucement un morceau de ruban adhésif sur la surface, puis décollez lentement le ruban. Dissoudre les billes de polystyrène en plaçant les lamelles dans du toleune et en les laissant reposer toute la nuit. En manipulant les lamelles avec soin, rincez-les une fois avec du chloroforme et deux fois avec de l’éthanol.

Séchez les gabarits avec de l’azote. Placez-les dans un nettoyeur plasma à oxygène pendant 30 minutes pour éliminer les polymères résiduels et les contaminants. À l’aide d’un dépôt par évaporation thermique, déposez trois nanomètres d’une couche d’adhérence en titane à un angström par seconde, puis déposez 100 à 150 nanomètres d’aluminium à quatre angströms par seconde autour et au-dessus des poteaux en cuivre.

Assurez-vous que les échantillons ne tournent pas pendant le dépôt, comme cela se fait automatiquement dans certaines unités de dépôt. Pour dissoudre les tenons en cuivre, trempez les lamelles dans un décapant au cuivre pendant deux heures. Après avoir rincé les lamelles à l’eau distillée, séchez-les avec de l’azote, puis polissez doucement la surface avec du papier pour lentilles pour exposer les poteaux encore recouverts de revêtement.

Faites tremper les lamelles dans un décapant au cuivre pendant encore deux heures, puis rincez-les à nouveau à l’eau distillée et séchez-les avec de l’azote. Après la passivation de surface, les lamelles de guidage d’ondes en mode zéro peuvent être associées à des lames de quartz à l’aide de ruban adhésif double face pour fabriquer des chambres d’écoulement microfluidique pour l’imagerie de molécules uniques. Le succès de l’auto-assemblage du modèle colloïdal dépend essentiellement de l’humidité relative.

Dans un modèle bien formé, la région des perles est circulaire avec des bordures définies par un anneau multicouche opaque. Dans les modèles bien formés, la plupart des modèles doivent contenir des billes hexagonalement serrées. Il y aura quelques défauts entre les grains en raison du coincement lors de la sédimentation par évaporation.

Après le dépôt de cuivre et la dissolution des billes de polystyrène, les poteaux de cuivre doivent avoir un diamètre inférieur à 150 nanomètres. Pour une profondeur de dépôt de cuivre de 300 nanomètres, les poteaux mesurent environ 250 nanomètres de haut. Après le dépôt de la gaine d’aluminium et la dissolution ultérieure des poteaux de cuivre, les guides d’ondes doivent être visibles par microscopie à force atomique et être espacés d’environ 550 nanomètres.

Le recuit des modèles en polystyrène pendant 20 secondes a produit des guides d’ondes en aluminium d’un diamètre de 118 nanomètres, suffisamment petits pour couper la propagation de la lumière visible. Un champ typique de ZMW pour l’imagerie contient 3 000 guides d’ondes dans un champ de vision de 40 x 80 microns. Une FRET à molécule unique a été réalisée pour tester la fonctionnalité ZMW.

Des traces de FRET à molécule unique étaient détectables à toutes les concentrations de fluorphore Cy5 ambiant testées. En comparaison, les molécules uniques ne seraient détectables que dans l’éclairage TERF avec des concentrations picomolaires à nanomolaires faibles. Après la fabrication d’un guide d’ondes en mode zéro, les dispositifs peuvent être passivés avec des polymères pour réduire les interactions non spécifiques lors de l’imagerie de molécules uniques.

Les fonds en verre des guides d’ondes en mode zéro peuvent également être légèrement gravés pour améliorer l’émission d’une molécule unique. Dans l’ensemble, cette nouvelle méthode de fabrication de guides d’ondes en mode zéro permettra aux chercheurs d’étudier plus facilement les processus biochimiques dynamiques, tels que la transcription ou la traduction, à des concentrations et des taux plus proches de ceux de la cellule.