Un test électrochimiluminescence 7-plex à haut débit dépistant simultanément le diabète de type 1 et de multiples maladies auto-immunes
29 mai 2020
Nous modélisons un test ECL multiplexé simple qui combine 7 tests d’auto-anticorps. Le test est capable de dépister le DT1 et plusieurs autres maladies auto-immunes, simultanément, y compris la maladie cœliaque, la maladie thyroïdienne auto-immune et le syndrome polyglandulaire auto-immun 1.
Le test d’électrochimiluminescence peut dépister simultanément le diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes pertinentes, y compris la cryomaladie auto-immune, la maladie cœliaque et le syndrome polyglandulaire auto-immun-1. Le test ECR, très complexe, combine jusqu’à 10 tests d’anticorps multiples dans un seul puits, ce qui permet d’obtenir un débit élevé, moins de banques et un test moins coûteux qui nécessite un volume moins large. La démonstration de la procédure sera faite par Xiaofan Jia, un article de mon laboratoire.
Pour préparer une solution d’antigène couplé à un linker mixte, il faut d’abord sélectionner la concentration optimale pour chaque antigène, sur la base du test en damier, et diluer l’antigène marqué à la biotine et au ruthénium à la concentration de travail rationnelle. Pour lier différents agents de liaison à chacun des antigènes biotinylés uniques, pour un test de 96 fois bien joué, on a mélangé 240 microlitres d’un agent de liaison conjugué à la STREPTAVIDINE approprié avec 4 microlitres de protéines biotinylées d’intérêt. Ajoutez ensuite 156 microlitres de 1 % BSA par tube et incubez le mélange à température ambiante pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, ajoutez 160 microlitres de solution d’arrêt dans chaque tube et incubez les tubes à température ambiante pendant 30 minutes supplémentaires. À la fin de l’incubation, retirez 400 microlitres d’antigène couplé à un linker de chaque tube et tirez les sept suspensions d’antigène dans un seul tube. Ensuite, ajoutez 1,2 millilitre de solution stop et 4 microlitres de GAD65, TPO, tTg, ThG, Proinsuline, interféron-alpha et antigène IA-2 marqués au mélange.
Avant d’incuber des échantillons de sérum avec le mélange d’antigènes marqué, ajoutez 15 microlitres de sérum par puits d’une plaque PCR à 96 puits et mélangez 18 microlitres d’acide acide 0,5 molaire avec chaque puits de sérum pour une incubation de 45 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, ajoutez 35 microlitres d’antigène et 13 microlitres d’un tampon molaire Tris par puits d’une nouvelle plaque PCR à 96 puits. À la fin de l’incubation, transférez immédiatement 25 microlitres de sérum traité à l’acide dans chaque puits de la plaque d’antigène.
Couvrez la plaque d’une feuille de plafond PCR et placez la plaque sur un agitateur à basse vitesse à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, placez la plaque à 4 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. Sortez la plaque du réfrigérateur et laissez-la revenir à température ambiante.
Ajoutez ensuite 150 microlitres de tampon A bloqueur à 3 % dans chaque puits. Lorsque tous les puits ont été traités, couvrez la plaque d’une feuille de plafond et placez la plaque dans un réfrigérateur à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, retournez la plaque et lavez les échantillons trois fois avec 150 microlitres de PBS-T par puits, par lavage.
Tapotez la plaque jusqu’à ce qu’il ne reste plus de tampon dans l’un des puits. Ajoutez 30 microlitres d’incubation d’antigène sérique dans chaque puits. Lorsque tous les incubés ont été ajoutés, couvrez l’assiette de papier d’aluminium et placez l’assiette sur un shaker à basse vitesse pendant une heure, à température ambiante.
À la fin de l’incubation, retirez les incubés en effleurant et lavez les puits trois fois avec 150 microlitres de PBS-T par puits, comme démontré. Après le dernier lavage, ajoutez 150 microlitres de tampon de lecture dans chaque puits et lisez la plaque sur un lecteur de plaques, en comptages par seconde. Dans cette analyse d’une vaste cohorte d’échantillons provenant de 1026 patients atteints de diabète de type 1 nouvellement diagnostiqués, les niveaux d’anticorps automatiques d’un test d’électroluminescence de plus de sept ont été comparés aux niveaux de chaque test d’électroluminescence unique établi correspondant et de chaque test de liaison radio standard et ELISA correspondants.
Les spécificités des tests étaient identiques au 99e percentile pour tous les tests d’auto-anticorps, à l’exception des auto-anticorps thyroïdiens, pour lesquels le 95e percentile a été utilisé. Un petit nombre d’échantillons discordants pour chacun des sept anticorps automatiques a été trouvé autour de la limite des seuils pour chaque test. Ici, les données correspondantes pour 1022 témoins sains pour chaque essai peuvent être observées.
La chose la plus importante à retenir est de trouver un agent de liaison différent pour chacun des antigènes biotinylés uniques, et de mélanger chaque antigène avec les propriétés de fournir un agent de liaison conjugué. Cette technique de dosage permettra aux chercheurs de planifier le dépistage simultané de plusieurs maladies auto-immunes dans des populations à grande échelle et aux cliniques de dépister facilement plusieurs maladies pertinentes avec le diabète de type 1.
Aperçu
Cette étude présente un dosage électrochimiluminescent (ECL) multiplexé permettant le dépistage simultané du diabète de type 1 et de diverses maladies auto-immunes. Ce dosage combine plusieurs tests d'auto-anticorps dans un seul puits, augmentant ainsi l'efficacité et réduisant les coûts.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Auto-immunité
- Diagnostic
- Dosages par électrochimiluminescence
Contexte
- Le diabète de type 1 (DT1) est souvent associé à d'autres maladies auto-immunes.
- Les dosages traditionnels peuvent nécessiter plusieurs tests, ce qui augmente le temps et les coûts.
- Les dosages multiplexés peuvent simplifier le processus diagnostique.
- La chimiluminescence électrochimique offre une sensibilité et une spécificité élevées.
Objectif de l'étude
- Développer un dosage ECL multiplexé pour le dépistage du DT1 et des maladies auto-immunes associées.
- Comparer les performances du dosage multiplexé à celles des dosages uniplexés établis.
- Faciliter le dépistage à grande échelle dans les environnements cliniques.
Méthodes utilisées
- Préparation de solutions d'antigènes couplés à des linkers mixtes.
- Incubation des échantillons de sérum avec des antigènes marqués.
- Utilisation d'un format de plaque 96 puits pour le criblage à haut débit.
- Comparaison des niveaux d'autoanticorps chez des patients atteints de DT1 et des témoins sains.
Résultats principaux
- Le test multiplexé a démontré une spécificité comparable à celle des tests individuels.
- Identification d'un petit nombre d'échantillons discordants près des seuils de coupure.
- Fourni des données pour une grande cohorte de patients nouvellement diagnostiqués avec un DT1.
- Permis un dépistage efficace de plusieurs maladies auto-immunes.
Conclusions
- Le test ECL multiplexé est un outil viable pour le dépistage simultané.
- Cette méthode peut améliorer l'efficacité diagnostique en pratique clinique.
- Une validation supplémentaire auprès de populations plus importantes est recommandée.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La détection simultanée de plusieurs auto-anticorps dans un seul puits permet de surmonter un goulot d'étranglement critique dans le dépistage à grande échelle des maladies auto-immunes, en réduisant la complexité des tests et la consommation de ressources. Cette approche multiplexée par électrochimiluminescence améliore la confiance prédictive dans l'identification précoce des maladies en fournissant des lectures corrélées de biomarqueurs dans le diabète de type 1 et les affections auto-immunes concomitantes. Le test facilite le tri du portefeuille et la réduction des risques mécanistiques dans le développement d'immunothérapies, en permettant une stratification efficace des patients selon leurs profils multi-auto-anticorps.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en corrélant des groupes d'auto-anticorps avec des endotypes de maladie dans des modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Soutient la réduction du risque biologique grâce à la validation fonctionnelle de réponses immunitaires spécifiques aux antigènes dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans le choix des cibles en identifiant des sous-groupes de patients présentant des signatures convergentes d'auto-anticorps.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des panels normalisés et quantitatifs de biomarqueurs destinés à des campagnes de criblage en aval nécessitant une forte reproductibilité.
- Valeur opérationnelle : Assure la prêts-à-utiliser des tests grâce à des complexes antigène-liant immobilisés qui garantissent une liaison en phase fluide constante entre les puits.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme pour le criblage jusqu'à 10 auto-anticorps par puit, augmentant ainsi le débit sans nécessiter de reformater les expériences.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : S'aligne sur les systèmes pertinents pour la maladie en détectant les auto-anticorps associés à la progression clinique du diabète de type 1 et des troubles auto-immuns concomitants.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en identifiant les patients présentant des profils d'auto-anticorps à forte pénétrance prédictifs d'une auto-immunité multi-organes.
- Réduction du risque mécanistique : Réduit l'ambiguïté dans l'interprétation des mécanismes immunitaires grâce à la mesure simultanée des auto-anticorps dirigés contre les îlots, la thyroïde, l'intestin et les voies de l'interféron.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test joue le rôle de pont entre la découverte et la translation, permettant un phénotypage immunitaire précoce qui oriente l'identification des candidats prometteurs et les étapes de validation préclinique grâce à un profilage multiplexé des auto-anticorps.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en reliant les profils de co-expression des auto-anticorps aux voies pathogènes dans la pathogenèse auto-immune.
- Dépistage : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles permettant la comparaison des réponses immunitaires entre différentes conditions de traitement ou fonds génétiques.
- Analyse : Fournit des lectures normalisées en nombre de coups par seconde, permettant la comparaison statistique des niveaux d'auto-anticorps entre cohortes de patients et cohortes témoins.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en validant des panels de biomarqueurs sur des échantillons humains reflétant une dysrégulation immunitaire associée à la maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme d'immunodosage réutilisable, adaptable à d'autres panels de maladies auto-immunes ou inflammatoires au-delà de la configuration initiale en 7-plex.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant les faux négatifs grâce à la mesure concomitante des auto-anticorps.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité en éliminant la variabilité entre puits par une présentation de l'antigène immobilisé.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en regroupant sept tests diagnostiques en une seule étape de procédure.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques selon des populations de patients définies par des biomarqueurs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception de dosages immunologiques et en chimie des linkers pour l'immobilisation de l'antigène.
- Suppose l'utilisation d'un lecteur de plaques capable de détection par électrochimiluminescence en format 96 puits.
- Exige une standardisation des protocoles de blocage et de lavage entre les différents sites pour les études multicentriques.
- Requiert l'adaptation des concentrations d'antigènes lors de l'extension à de nouvelles cibles d'autoanticorps autres que les sept initiales.
- Est limité par la nécessité d'associer des paires linker-antigène optimisées afin d'éviter les réactions croisées en format multiplex.
