Name: Clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par CHO à l’aide d’un séparateur acoustique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez la clarification primaire des cultures cellulaires CHO par séparation acoustique. Cette méthode offre un faible risque de contamination et permet le bioprocédé continu pour la production de monoclonaux.

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Les auteurs tiennent à remercier Nilou Sarah Arden et Zhong Zhao pour leur examen constructif de ce manuscrit. Les auteurs tiennent également à remercier Lindsey Brown pour sa contribution essentielle au cours de ce projet. Un financement interne partiel et un soutien pour ce travail ont été fournis par le Programme chemin critique du CDRE (CA #1-13) et le Programme D’excellence en science de la fabrication et centre d’innovation du CDRE (Berilla-CoE-19-49). Ce projet a été soutenu en partie par le programme de participation à la recherche et à l’entreposage de l’Office of Biotechnology Products de la Food and Drug Administration des États-Unis, administré par l’Oak Ridge Institute for Science and Education dans le cadre d’un accord interagences entre le département de l’Énergie des États-Unis et la FDA.
Cette publication reflète les points de vue de l’auteur et ne doit pas être interprétée comme représentant les points de vue ou les politiques de la FDA.

1. Préparation d’AWS
NOTE: Ce protocole a été développé à l’aide d’une chambre acoustophorétique. Cependant, l’AWS à l’échelle du banc dispose de cinq sondes de turbidité qui peuvent faire fonctionner 4 chambres acoustophorétiques en série si nécessaire.
<ol><li>Connectez les câbles de turbidité à leurs ports respectifs étiquetés F, 1, 2, 3, 4 (par exemple, sonde de turbidité 1 dans la Figure 1c et port 1 dans la Figure 2a) et les câbles BNC d’alimentation de la chambre à l’arrière du système AWS étiquetés comme 1, 2, 3, 4 (Figure 2b). REMARQUE: Ne connectez pas l’autre extrémité du câble BNC d’alimentation de la chambre (Figure 3c) à l’arrière de la chambre acoustophorétique (Figure 3d) jusqu’à l’étape 2.6 lorsque la chambre est remplie de liquide. Si l’alimentation de la chambre est allumée sans fluide dans la chambre, elle endommagera le transducteur piézoélectrique dans la chambre et ne fonctionnera plus.</li>
	<li>Insérez les sondes de turbidité dans le boîtier du turbidimètre et du thermomètre et serrez les vis(Figure 1c et Figure 3).</li>
	<li>Raccorder le tuyau d’alimentation à l’entrée de l’orifice de turbidité d’alimentation (Figure 4a) via la pomped’alimentation( Figure 1b à 1c).</li>
	<li>Raccorder le tube en Y de la sortie de l’orifice de turbidité d’alimentation (Figure 4b) aux orifices d’entrée de la chambre acoustophorétique (Figure 4c).</li>
	<li>Raccorder le tube de l’étage 1 de l’orifice de décharge de la chambre acoustophorétique (Figure 4d) via la pompe de l’étage 1 à un récipient de collecte cellulaire (Figure 1d via 1e à 1f).</li>
	<li>Raccorder le tube à partir de l’orifice de perméat de la chambre acoustophorétique (Figure 4e) à l’entrée de l’orifice de turbidité de la sonde1 (Figure 4f).</li>
	<li>Raccorder le tube de récolte à l’extérieur de l’orifice de turbidité de la sonde1 (Figure 4g) à un récipient de collecte de produits (Figure 1c à 1g).</li>
</ol>2. Amorcer le système avec HCCF
REMARQUE: Ce protocole a été développé à l’aide de cellules CHO-K1 cultivées dans un milieu chimiquement défini (ActiCHO P avec 6 mM de L-glutamine) produisant le modèle d’anticorps monoclonal IgG1 VRC0113 et peut devoir être ajusté pour d’autres lignées cellulaires et produits. Le HCCF utilisé dans ce protocole a été obtenu à la fin de 7 à 8 jours de cultures CHO-K1 à partir d’une fiole agitée ou d’un procédé de bioréacteur.
<ol><li>Activez AWS en allumant les interrupteurs d’alimentation à l’arrière et à l’avant de l’AWS.</li>
	<li>Allumez l’ordinateur et double-cliquez sur l’icône de bureau du logiciel associé (voir Tableau des matériaux). Dans le panneau "Lectures« , appuyez sur le bouton "Démarrerle test " pour lancer l’enregistrement des données (Figure 5). Une fois l’enregistrement des données lancé, toutes les données collectées seront enregistrées dans une feuille de calcul exportable jusqu’à ce que le test soit arrêté.</li>
	<li>Raccordez l’extrémité du tuyau d’alimentation dans le récipient HCCF agité.</li>
	<li>Démarrez la pompe d’alimentation en entrant le débit de la pompe sur l’écran "Commandes" dans l’image de lapompe d’alimentation" etappuyezsur " Entrée " sur le clavier. Assurez-vous que l’icône de flèchede directionde la pompe (dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) est correctement sélectionnée dans la case grise à droite de l’image de la pompe d’alimentation pour pomper le HCCF du récipient dans la chambre acoustophorétique. Cliquez surl’icône« Triangle » à côté des mots «Allumer» dans la case grise sous l’image de la pompe d’alimentation pour «Démarrer» la pompe (Figure 6a). REMARQUE: Le débit maximal de la pompe est de 10 L / h (167 mL / min), mais il est recommandé d’utiliser le débit nominal, 60 mL / min, pour cette étape afin de remplir rapidement le tuyau et la chambre sans risquer de surcharger la chambre avant de commencer la séparation.</li>
	<li>Surveillez les mesures de turbidité d’alimentation en observant le «Percent Reduction Panel»(Figure 5c)pendant le remplissage de la chambre acoustophorétique. Les valeurs de turbidité resteront constantes pendant le chargement de la chambre si le HCCF est suffisamment mélangé dans le récipient HCCF.</li>
	<li>Une fois que le liquide est au-dessus du transducteur piézoélectrique à l’arrière de la chambre acoustophorétique, appuyez sur "Éteindre" dans la boîte grise sous l’image de la pompe d’alimentation pour arrêter la pompe. Connectez le câble d’alimentation BNC (Figure 3c) à la chambre acoustophorétique (Figure 3d). REMARQUE: Le volume de retenue de chaque chambre acoustophorétique est d’environ 190 mL.</li>
</ol>3. Fonctionnement d’AWS
<ol><li>Une fois que la chambre acoustophorétique est remplie et que le câble d’alimentation BNC est connecté à l’arrière de la chambre acoustophorétique, modifiez le taux d’alimentation de la pompe à la vitesse de fonctionnement souhaitée(Figure 6a et Tableau 1). Plusieurs débits de pompe d’alimentation doivent être testés pour identifier les paramètres de fonctionnement idéaux pour un processus donné.</li>
	<li>Allumez la puissance piézoélectrique stage1 en faisant glisser la barre du module d’alimentation sur 10 W(Figure 6d)et en appuyant sur l’icône «Allumer» sur le côté droit de la case Stage 1(Figure 6c). Comme suggéré par le fabricant, utilisez 10 W, le réglage d’alimentation recommandé pour les cellules CHO. Cela générera une fréquence fixe de 2 MHz pour le fonctionnement. Après plusieurs secondes, les cellules commenceront à s’agglutiner visiblement au niveau des nœuds d’onde dans la chambre acoustophorétique (Figure 7a).</li>
	<li>Une fois que les cellules commencent à se déposer au fond de la chambre acoustophorétique (Figure 7b), démarrez la pompe de stade 1 avec un taux approprié basé sur la densité de la cellule et le taux de la pompe d’alimentation (Figure 6b). Sur la base de la feuille de calcul d’optimisation et de fonctionnement à l’état d’équilibre du fabricant, le débit de la pompe stage1 peut être calculé en fonction de la masse de la cellule emballée et du débit d’alimentation à l’aide de l’équation suivante <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>Pour calculer la masse de la cellule emballée, tare une balance avec un tube vide de 15 mL (ou un autre tube compatible avec la centrifugation). Remplissez le tube avec du matériel d’alimentation et enregistrez le poids total du tube avec l’aliment. Centrifuger le tube pendant 10 min à 3 700 x g. Décantez le surnageant dans un récipient séparé. Mesurez le poids du tube avec la pastille de cellule. Le pourcentage de masse de la cellule emballée de la matière première = (poids du tube décanté/poids du tube rempli) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Surveiller le profil de turbidité de la turbidité de stade 1 lorsque le débordement de la chambre acoustophorétique pénètre dans la sonde de turbidité1(Figure 8).</li>
	<li>Au fur et à mesure que la séparation des cellules se poursuit, l’efficacité de l’élimination des cellules <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> augmentera.</li>
	<li>De plus, surveillez la différence de température entre l’alimentation et l’étape 1, car elle augmentera à mesure que la séparation des cellules se poursuivra (Figure 9). La température peut augmenter lorsque des aliments à densité cellulaire plus élevée sont utilisés, mais peut généralement être réduite en modifiant le débit d’alimentation. REMARQUE: Lors de l’utilisation de plusieurs chambres acoustophorétiques, on peut connecter séquentiellement le tube de la chambre acoustophorétique précédente via des sondes de turbidité à l’entrée de la chambre acoustophorétique actuelle. En outre, on peut connecter des tubes d’étage du fond des chambres acoustophorétiques via des pompes d’étage à des récipients de collecte de cellules. Au total, quatre chambres acoustophorétiques peuvent être connectées en série pour une efficacité optimale d’élimination des cellules si nécessaire.</li>
</ol>4. Fin d’AWS
<ol><li>Lorsque l’exécution est terminée, arrêtez l’alimentation et la pompe stage1 en appuyant sur Éteindre dans la boîte grise sous les images de la pompe d’alimentation et de la pompe stage1, respectivement, pour arrêter les pompes.</li>
	<li>Coupez l’alimentation de la chambre en appuyant sur Éteindre sur le côté droit du boîtier Stage 1 et débranchez le câble d’alimentation BNC.</li>
	<li>Prenez le matériel de récolte du produit collecté pour d’autres procédures de clarification et de purification, telles que les méthodes de filtration en profondeur et de chromatographie. Jetez le matériel de récolte cellulaire.</li>
	<li>Égoutter le liquide restant dans la chambre acoustophorétique en plaçant le tuyau de déchets dans un récipient vide, en déconnectant le tube des orifices d’entrée et de pénétration de la chambre acoustophorétique et en libérant le tuyau de déchets de la tête de pompe.</li>
	<li>Reconnectez le tube, replacez le tube de déchets dans la tête de la pompe et faites couler de l’eau DI à partir de l’extrémité du tube d’alimentation à l’aide d’un débit de pompe d’alimentation de 60 mL / min et d’un débit de pompe de stade 1 de 60 mL / min. Continuer pendant 15–20 min. Jetez le flux à travers.</li>
	<li>Pomper 70% d’alcool isopropylique (IPA) à travers le tube et la chambre à l’aide de la pompe d’alimentation pendant 15 à 20 min. Jetez le flux à travers.</li>
	<li>Répétez la procédure de nettoyage avec de l’eau DI pour dégager les tubes et la chambre en utilisant la pompe d’alimentation pendant 15 à 20 minutes. Jetez le flux à travers.</li>
	<li>Démontez le tube des sondes de turbidité et des chambres acoustophorétiques et nettoyez la zone avec 70% d’IPA.</li>
	<li>Démontez les sondes de turbidité et nettoyez l’intérieur des sondes de turbidité avec 70% d’IPA. Laissez toutes les pièces sécher à l’air libre, puis remontez-les pour la prochaine utilisation. REMARQUE: Les chambres acoustophorétiques sont fabriquées pour un usage unique, mais peuvent être réutilisées si elles sont manipulées et nettoyées correctement comme décrit dans ce protocole.</li>
</ol>

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<li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722(2019).</li>
<li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li>
<li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier dans les produits décrits dans ce manuscrit et n’ont rien d’autre à divulguer.

Décrit est un protocole étape par étape pour la mise en œuvre d’un AWS à l’échelle du banc dans la clarification primaire d’un modèle d’anticorps monoclonal de HCCF d’une lignée cellulaire CHO. Comme le montrent les résultats représentatifs, l’utilisation de l’AWS dans la clarification primaire a permis une clarification efficace des cellules et une récupération du produit. En outre, le faible niveau de maintenance et d’exigences opérationnelles et la capacité de mise à l’échelle permettent un potentiel d’application plus large dans la clarification primaire.
Il est important de noter que les résultats représentatifs suggèrent que le débit de la pompe d’alimentation est essentiel pour la séparation des cellules. En outre, en raison des limites de la détection d’une densité cellulaire élevée dans la mesure de la turbidité, la densité de cellule de travail est un autre facteur à prendre en compte lors de l’utilisation d’un système AWS. Étant donné que la sonde de turbidité sera saturée lors de l’utilisation de matières premières à haute densité cellulaire, il peut être préférable de calculer l’efficacité de la séparation cellulaire en mesurant les densités cellulaires de la matière première et du fluide de culture cellulaire clarifié hors ligne. Avec une mesure précise de la clarification hors ligne, une stratégie de processus qui peut être envisagée pour résoudre ces problèmes consiste à utiliser plusieurs chambres en série. Bien que ce protocole soit principalement axé sur l’utilisation d’une seule chambre, ce système peut faire fonctionner trois chambres supplémentaires pour la clarification séquentielle des cellules qui peuvent avoir un impact minimal sur l’état des cellules et entraîner une récupération élevée du produit. En outre, d’autres paramètres, tels que l’alimentation d’AWS et les débits de suppression de cellules, peuvent être optimisés pour des types de cellules ou des modes de fonctionnement spécifiques. Dans l’ensemble, une optimisation des paramètres d’opération et de la stratégie à l’aide de ces considérations est recommandée avant la mise en œuvre d’AWS.
Parmi les nombreux potentiels d’application, l’utilisation d’AWS dans le biotraitement continu est prometteuse. Étant donné qu’AWS peut remplacer la centrifugation et réduire considérablement la surface du filtre14,l’utilisation d’AWS permettrait un flux constant de matériaux sans cellules pour les processus de filtration et de chromatographie ultérieurs compatibles avec la biofabrication continue. En raison de cette compatibilité et de la disponibilité de la technologie de perfusion pour une densité cellulaire élevée (par exemple, >50 x10 6 cellules / mL) et une durée de culture plus longue (par exemple, >14 jours), AWS a le potentiel de développer une nouvelle stratégie de saignement cellulaire continu en plus de la clarification primaire.
Dans certains cas, jusqu’à 30% de la protéine thérapeutique produite est éliminée pendant le fonctionnement à l’état d’équilibre dans le matériau de saignement cellulaire15,16. De plus, pour que les anticorps monoclonaux retirés soient regroupés avec le matériel standard récolté, certains attributs de qualité doivent être respectés. Lorsque ces spécifications ne sont pas respectées, le résultat peut être un rejet de matériau qui peut avoir un impact sur le rendement du produit. Pour compenser une telle perte de produit, une clarification continue du matériau de purge cellulaire à l’aide d’AWS peut être mise en œuvre à l’état d’équilibre au cours d’un processus de perfusion à long terme17. Cette stratégie peut réduire la perte de produit dans le matériau de saignement et utiliser davantage de protéines produites. En outre, les cellules après la clarification continue à l’aide d’AWS pourraient potentiellement être ajoutées au bioréacteur si vous le souhaitez pour une densité cellulaire et une productivité plus élevées. Ainsi, la clarification continue du matériau de purge cellulaire avec AWS peut offrir une opportunité d’augmenter le rendement et/ou de diminuer la surface du filtre secondaire dans un processus donné.
En résumé, l’utilité d’AWS ne se limite pas à une simple clarification primaire, mais peut avoir une utilité pour les applications de biotraitement continu susceptibles d’améliorer le taux de fabrication et la flexibilité opérationnelle.

Une étape critique d’un processus de biofabrication impliquant des protéines thérapeutiques sécrétées est l’élimination de la biomasse du liquide de culture cellulaire récolté (HCCF). Traditionnellement, les biofabricants ont adopté la centrifugation suivie de la filtration en profondeur comme principales méthodes de clarification dans la production d’anticorps monoclonaux1. Cependant, la centrifugation peut entraîner un stress de cisaillement élevé sur les cellules, entraînant une augmentation des débris cellulaires dans le HCCF. Cela peut potentiellement entraîner un encrassement du filtre pendant la filtration et entraîner une postfiltration supplémentaire des contaminants qui peuvent ensuite réduire l’efficacité de la chromatographie en aval1,2,3. En outre, la personnalisation des centrifugeuses pour un certain processus peut être coûteuse et peut nécessiter des connexions supplémentaires aux systèmes de nettoyage en place et de stérilisation en place, ce qui peut également être un facteur limitant pour l’évolutivité. L’utilisation de filtres de profondeur peut compenser les limites de la centrifugation et également tirer parti de la technologie à usage unique4. Cependant, les filtres de profondeur sont principalement utilisés comme clarification secondaire car ils ne peuvent pas résister à des densités de culture cellulaire élevées5. Alternativement, des dispositifs de rétention cellulaire par filtration à flux tangentiel (TFF) ont été utilisés pour atténuer les contraintes de cisaillement, mais peuvent rencontrer des défis tels que la polarisation de la membrane et les faibles rendements de récolte6. Les problèmes ci-dessus découlant de l’utilisation de la centrifugation plus filtration en profondeur ou TFF créent une opportunité pour l’amélioration du processus de clarification primaire du HCCF.
La séparation acoustique a été introduite en tant que technologie pouvant être utilisée pour récolter des protéines sécrétées à partir de cultures cellulaires avec des produits protéiques de haute qualité7,8. La séparation acoustique est réalisée par la propagation et la réflexion d’ondes stationnaires multidimensionnelles qui interagissent avec les fluides en suspension et les particules retenues9,10. Ces particules subissent trois forces : la traînée du fluide, la gravité et le rayonnement acoustique. Lorsque chacune des forces est également opposée l’une à l’autre, atteignant l’équilibre, les particules sont suspendues et piégées dans l’onde stationnaire ultrasonore10. Dans une suspension de culture cellulaire, les cellules sont maintenues dans ce plan de nœud de pression des ondes stationnaires, le nœud se développe à mesure que les cellules fusionnent, et finalement ces groupes de nœuds cellulaires tombent de la forcegravitationnelle 9. Ces cellules sédimentées sont ensuite retirées du milieu, ce qui permet de pomper le milieu clarifié pour un traitement ultérieur en aval. L’utilisation des ondes ultrasonores comme méthode de séparation a commencé à se traduire par des applications biologiques allant de la séparation des particules lipidiques et des globules rouges11 à la culture de cellules de perfusion chez les mammifères12. Avec ses capacités relatives à réduire les coûts, la main-d’œuvre et le stress cellulaire en évitant la centrifugation, la filtration en profondeur ou TFF, les biofabricants explorent les applications potentielles de l’utilisation de la séparation acoustique.
Cette étude fournit un protocole général pour l’utilisation d’un séparateur d’ondes acoustiques de paillasse (AWS) pour clarifier la culture cellulaire CHO, présente des données représentatives et démontre comment obtenir une clarification cellulaire efficace et une récupération du produit.

<table><tbody><tr><td>Chambre acoustophorectique</td><td>Pall</td><td>CAS-AC-K1 Kit</td><td></td>de chambre acoustique</tr><tr><td>Cadence ActiCHO P</td><td>GE</td><td>SH31025.01</td><td>poudre moyenne</td></tr><tr><td>AWS</td><td>Pall</td><td>CAS-SYS (60500101-SP)</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de séparateur acoustique Cadence</td><td>Pall</td><td>Interface de séparateur acoustique Cadence Ver. 1.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Cellules CHO-K1</td><td>VRC</td><td>VRC01</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Dell</td><td>Latitude 3470</td><td>Windows 7, 64 bits OS</td></tr><tr><td>Isopropanol (70 %)</td><td>LabChem</td><td>LC157605</td><td>20L préparé 70 %</td></tr><tr><td>IPA L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td>200 mM solution mère</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 14 tube</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>tube en silicone durci au peroxyde, 25ft</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 tube</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-16</td><td>Tube en silicone durci au peroxyde, 25ft</td></tr><tr><td>Jeu de tubes</td><td>Pall</td><td>CAS-FP-K1 Jeu de tubes</td> Sonde de <td></td></tr><tr><td>turbidité</td><td>Pall</td><td>CAS-TS-S1 (60500106)</td><td></td></tr></tbody></table>

clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par cho à l’aide d’un séparateur acoustique

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

La clarification primaire est une étape essentielle d’un processus de biofabrication pour l’élimination initiale des cellules des produits thérapeutiques dans le fluide de culture cellulaire récolté. Alors que les méthodes traditionnelles telles que la centrifugation ou la filtration sont largement mises en œuvre pour l’élimination des cellules, l’équipement pour ces processus a une grande empreinte et le fonctionnement peut impliquer des risques de contamination et d’encrassement du filtre. En outre, les méthodes traditionnelles peuvent ne pas être idéales pour les schémas de biotraitement continu pour la clarification primaire. Ainsi, une autre application utilisant des ondes acoustiques (sonores) a été étudiée pour séparer en permanence les cellules du fluide de culture cellulaire. Présenté dans cette étude est un protocole détaillé pour l’utilisation d’un séparateur d’ondes acoustiques (AWS) à l’échelle du banc pour la séparation primaire du fluide de culture contenant un anticorps IgG1 monoclonal provenant d’une récolte de bioréacteur de cellules CHO. Des données représentatives sont présentées à partir d’AWS et montrent comment obtenir une clarification efficace des cellules et une récupération du produit. Enfin, les applications potentielles d’AWS dans le biotraitement continu sont discutées. Dans l’ensemble, cette étude fournit un protocole pratique et général pour la mise en œuvre de l’AWS dans la clarification primaire pour les cultures cellulaires CHO et décrit plus en détail son potentiel d’application dans le biotraitement continu.

Comme décrit dans le protocole, l’AWS a été utilisé pour clarifier HCCF à une densité de 12,4 x 106 cellules/mL, comme le montre la figure 1. La pompe d’alimentation a été réglée à 3,5 mL/min (5 L/jour), ce qui représente un taux de purge cellulaire dans la plage présumée appropriée pour une culture de 10 à 20 L. Lorsque le HCCF est entré dans la chambre AWS, les mesures de turbidité de la sonde de turbidité d’alimentation sont restées cohérentes, environ 1 000 à 1 100 UTN, et les mesures de la sonde1 sont restées autour de 40 à 50 UTN(Figure 8). En utilisant les deux mesures, efficacité d’élimination des cellules
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
a été calculé et calculé en moyenne à 95 %. Il a été constaté qu’une mesure de turbidité de 40 à 50 UTN était le niveau de turbidité minimum réalisable et qu’aucune autre séparation d’une chambre AWS supplémentaire en série n’était donc possible.
Alors que l’AWS pouvait se séparer avec une efficacité élevée à des débits plus faibles, le maintien du HCCF plus longtemps dans la chambre entraînait des augmentations de température, ce qui devrait être pris en compte lors de la sélection de débits plus faibles. La figure 9 est un exemple de la différence de température du HCCF avant d’entrer dans la chambre acoustophorétique et après séparation acoustique à un débit d’alimentation de 3,5 mL/min, ce qui a montré une augmentation de &gt;6 °C de la température due à un temps prolongé dans la chambre acoustique.
Une autre considération importante lors de l’exécution de récoltes à haute densité cellulaire (c.-à-d. &gt;20 x10 6 cellules / mL) est la saturation des sondes de turbidité. Les mesures de turbidité pour la sonde de turbidité d’alimentation sont devenues saturées de plus de 4 400 UTN(figure 10),ce qui peut entraîner une sous-estimation dans le calcul de l’efficacité d’élimination des cellules.
Pour tester l’effet de différentes vitesses d’alimentation sur la clarification des cellules, l’efficacité de l’élimination des cellules a été mesurée à différentes vitesses d’alimentation. Comme le montre la figure 11,l’efficacité d’élimination des cellules a considérablement diminué, passant d’environ 100 % à 57 % à mesure que le taux de la pompe d’alimentation augmentait. En général, plus le débit de la pompe d’alimentation est lent, meilleure est la clarification de la cellule. Cependant, l’optimisation de la vitesse d’alimentation est recommandée pour chaque application.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration d’AWS. Une fois les pompes allumées avec le logiciel (a), le HCCF a été acheminé via une pompe d’alimentation (b) à travers la sonde de turbidité d’alimentation (c) puis vers la chambre AWS (d). À l’intérieur de la chambre, les forces acoustiques ont piégé les cellules de l’écoulement dans des nœuds d’ondes et ont provoqué l’agglutination. La diminution de la flottabilité a provoqué la chute des cellules par la force gravitationnelle, et les cellules ont été retirées du port de déchets de la chambre acoustophorétique via une pompe de stade 1 (e) vers une bouteille de récolte de cellules (f) tandis que le matériau clarifié est sorti de la sonde1 sonde de turbidité (c) par le port de perméat de la chambre vers une bouteille de récolte de produit (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figure 2 : Arrière du système AWS. Les sondes de turbidité et les chambres sont connectées à leurs ports respectifs à l’arrière du système AWS via des câbles Ethernet de sonde de turbidité (a) et BNC d’alimentation de chambre (b). En outre, l’ordinateur est connecté via un câble Ethernet PC (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figure 3 : Sondes de turbidité et boîtier. Chaque sonde de turbidité (a) doit être correctement insérée dans le turbidimètre et le boîtier du thermomètre respectifs (b) et serrée avec les vis. Le câble BNC d’alimentation de la chambre (c) ne doit être connecté à l’arrière de la chambre acoustophorétique (d) qu’après que le transducteur piézoélectrique de la chambre est rempli de liquide. Les sondes sont indiquées comme suit : F = turbidité d’alimentation, 1 = turbidité de sonde1 et 2, 3 et 4 sont des sondes inutilisées (ou peuvent être utilisées pour sérialiser la procédure). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figure 4 : Connexion entre le boîtier de turbidité et la chambre acoustophorétique. Le tuyau d’alimentation est connecté à l’entrée de l’orifice de turbiditéd’alimentation( a ) via la pompe d’alimentation. La sortie de l’orifice de turbidité d’alimentation (b) est reliée aux orifices d’entrée de la chambre acoustophorétique (c) via un tube en Y. Le tube stage1 est relié de l’orifice de décharge de la chambre acoustophorétique (d) via la pompe stage1 à un récipient de collecte de cellules. L’orifice de pénétration de la chambre acoustophorétique (e) est connecté à l’entrée de l’orifice de turbidité de la sonde1 (f). Le tube de récolte est relié à partir de l’orifice de turbidité (g) de la sonde1 à un récipient de collecte de produits. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figure 5 : panneau Lectures dans le logiciel Acoustic Separator. Le programme dispose de deux panneaux, "Lectures" et "Contrôles« . Dans le panneau "Lectures« , la turbidité (a), la température (b) et la réduction en pourcentage (c) sont surveillées. Pour lancer l’enregistrement des données, il faut cliquer sur le bouton " Démarrer letest"(d),ce qui changera la couleur du bouton en vert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figure 6 : Panneau de configuration du programme. Dans le panneau "Commandes« , les pompes peuvent être allumées ou éteintes, et le taux de pompage peut être modifié pour l’alimentation (a) et d’autres étapes (b). En outre, l’alimentation de la chambre sur le transducteur piézoélectrique peut être activée ou désactivée (c) et être changée avec une barre coulissante (d). Les expériences ont utilisé 10 W, car c’est le réglage de puissance recommandé pour les cellules CHO tel que recommandé par le fabricant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figure 7 : Chambre AWS. Une fois que les cellules étaient à l’intérieur de la chambre, les forces acoustiques piégeaient les cellules dans des nœuds d’ondes et provoquaient l’agrégation des cellules (a). Ces amas cellulaires ont augmenté en taille jusqu’à ce qu’ils perdent leur flottabilité et finissent par se stabiliser par la force gravitationnelle (b). Ensuite, les cellules décantées ont été retirées de l’orifice de déchets de la chambre acoustophorétique via une pompe de stade 1 vers une bouteille de récolte de cellules (c). Le produit est sorti de la chambre par l’orifice de pénétration (d) tandis que le HCCF remplissait continuellement la chambre par des orifices d’entrée (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figure 8 : Mesures de turbidité pour une culture de cellules CHO 12 x10 6 cellules/mL avec un débit de pompe d’alimentation de 3,5 mL/min. La turbidité alimentaire (bleu) était d’environ 1 000 UTN et la perméat sortant du turbidimètre de stade 1 (orange) était de 40 à 60 UTN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figure 9 : Mesures de température pour une culture de cellules CHO 12 x10 6 cellules/mL avec un débit de pompe d’alimentation de 3,5 mL/min. La température d’alimentation (bleu) était d’environ 21 °C et la perméat sortant du turbidimètre de stade 1 (orange) était d’environ 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figure 10 : Exemple de mesure de turbidité pour un échantillon à haute densité cellulaire. Lorsque la densité cellulaire était &gt;20 x 106 cellules/mL, la mesure de la turbidité alimentaire était saturée à la valeur maximale de 4 400 UTN, ce qui entraînait une sous-estimation de l’efficacité d’élimination des cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figure 11 : Comparaison de l’efficacité d’élimination des cellules. Au fur et à mesure que la vitesse d’alimentation augmentait, la séparation cellulaire diminuait. Par conséquent, à mesure que la vitesse d’alimentation augmentait, l’efficacité de la clarification cellulaire diminuait. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paramètre</td>
			<td>Spécification</td>
		</tr>
<tr>
<td>Débit</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plage de pression</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Température du fluide d’alimentation</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Température de fonctionnement</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Conditions d’exploitation. Les conditions de fonctionnement recommandées par le fabricant AWS pour le débit, la plage de pression, le fluide d’alimentation et la température de fonctionnement.

Présenté ici est un protocole pour la clarification primaire de la culture cellulaire CHO à l’aide d’un séparateur acoustique. Ce protocole peut être utilisé pour la clarification primaire des cultures de flacons agités ou des récoltes de bioréacteurs et a le potentiel d’application pour la clarification continue du matériau de saignement cellulaire pendant les opérations de bioréacteur de perfusion.

Clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par CHO à l’aide d’un séparateur acoustique

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Notre protocole démontre comment utiliser un séparateur d’ondes acoustiques à l’échelle du banc d’essai pour la séparation primaire des cellules CHO à partir d’un fluide de culture récolté contenant un anticorps monoclonal modèle. La séparation par ondes acoustiques offre certains avantages par rapport aux méthodes de clarification primaire traditionnelles, telles que la centrifugation et la filtration, tels qu’un faible encombrement, un faible risque de contamination et une réduction du risque d’encrassement du filtre. Étant donné que la séparation par ondes acoustiques fournit un flux continu de matériau acellulaire pour les processus de filtration et de chromatographie ultérieurs, il existe un potentiel pour son application dans les bioprocédés continus.Pour préparer le séparateur d’ondes acoustiques, connectez les câbles de turbidité à leurs ports respectifs et connectez les câbles BNC d’alimentation de la chambre à l’arrière du système de séparateur d’ondes acoustiques. Insérez les sondes de turbidité dans le turbidimètre et le boîtier du thermomètre et serrez les vis. Connectez la tubulure d’alimentation à l’entrée de l’orifice de turbidité d’alimentation via la pompe d’alimentation.Et connectez le tube en Y de la sortie de l’orifice de turbidité d’alimentation à l’orifice d’entrée de la chambre acoustophorétique. Connectez le tube de l’étape 1 de l’orifice de déchets de la chambre acoustophorétique à un récipient de collecte de cellules via la pompe de l’étape 1, et connectez le tube de l’orifice de perméat de la chambre acoustophorétique à l’entrée de l’orifice de turbidité de la sonde 1. Ensuite, connectez le tube de récolte à partir de l’orifice de turbidité de la sonde 1 à un récipient de collecte de produit.Pour amorcer le système avec le liquide de culture cellulaire récolté, allumez le séparateur d’ondes acoustiques et ouvrez le logiciel associé. Dans le panneau Lectures, cliquez sur Démarrer le test pour lancer l’enregistrement des données. Et connectez l’extrémité du tube d’alimentation dans le récipient de liquide de culture cellulaire récolté en cours d’agitation.Pour démarrer la pompe d’alimentation, entrez le débit de la pompe et appuyez sur Entrée. Vérifiez que la flèche de direction de la pompe est correctement orientée pour garantir que le fluide de la cellule est pompé du récipient dans la chambre acoustophorétique, puis cliquez sur l’icône en forme de triangle pour démarrer. Surveillez les mesures de turbidité des aliments dans le panneau de réduction du pourcentage pendant le remplissage de la chambre acoustophorétique.Si le liquide de culture cellulaire récolté est suffisamment mélangé dans le vaisseau du liquide cellulaire, les valeurs de turbidité seront constantes pendant le chargement de la chambre. Une fois que le liquide se trouve au-dessus du transducteur piézoélectrique à l’arrière de la chambre acoustophorétique, cliquez sur Éteindre pour arrêter la pompe. Et connectez l’autre extrémité du câble d’alimentation BNC à la chambre acoustophorétique.Une fois la chambre acoustophorétique remplie et mise sous tension, modifiez le débit de la pompe d’alimentation au taux de fonctionnement souhaité. Pour activer l’alimentation piézoélectrique de l’étage 1, faites glisser la barre dans le module d’alimentation à 10 watts et cliquez sur Activer.Une fois que les cellules commencent à se déposer au fond de la chambre acoustophorétique, démarrez la pompe de l’étape 1 avec un débit approprié basé sur la densité des cellules et le débit de la pompe d’alimentation, tout en surveillant de près les chambres de séparation des ondes acoustiques et en ajustant les débits de la pompe si nécessaire. Pour calculer la masse de la cellule emballée, tarez une balance avec un tube vide de 15 millilitres et remplissez le tube avec du matériau d’alimentation.Après avoir enregistré le poids total du tube avec l’alimentation, centrifugez le tube et décantez le surnageant dans un nouveau récipient. Mesurez le poids du tube avec la pastille de cellule. Ensuite, surveillez le profil de turbidité de la turbidité de stade 1 lorsque le débordement de la chambre acoustophorétique pénètre dans la sonde de turbidité 1.Une fois le cycle terminé, arrêtez l’alimentation et les pompes de l’étape 1, puis coupez l’alimentation de la chambre. Débranchez le câble d’alimentation BNC et récupérez le matériau de récolte du produit pour l’analyse en aval. Pour drainer le liquide restant de la chambre acoustophorétique, placez le tube de vidange dans un récipient vide.Débranchez le tube de l’entrée de la chambre acoustophorétique et des orifices de perméat, et libérez le tube de vidange de la tête de pompe. Lorsque la chambre est vide, rebranchez le tube, remettez le tube de vidange dans la tête de pompe et utilisez un débit de pompe d’alimentation et de pompe de l’étape 1 de 60 millilitres par minute pour rincer l’eau désionisée de l’extrémité du tube d’alimentation pendant 15 à 20 minutes. À la fin du rinçage à l’eau, pompez de l’alcool isopropylique à 70 % dans le tube et la chambre pendant 15 à 20 minutes, suivi d’un rinçage supplémentaire à l’eau désionisée de 15 à 20 minutes.Dans cette analyse représentative, lorsque le fluide cellulaire récolté est entré dans la chambre de séparation à ondes acoustiques, les mesures de turbidité de la sonde de turbidité d’alimentation sont restées constantes, autour de 1000 à 1100 UTN. Et les mesures de la sonde 1 sont restées autour de 40 à 50 NTU. Le fait de garder le liquide cellulaire récolté à l’intérieur de la chambre pendant de plus longues périodes entraîne une augmentation de la température, comme dans cet exemple d’une différence de température de plus de six degrés Celsius du liquide cellulaire récolté avant d’entrer dans la chambre acoustophorétique et après la séparation acoustique.Une autre considération importante lors de l’exécution de récoltes à haute densité cellulaire est la saturation des sondes de turbidité, car les mesures de turbidité de la sonde de turbidité d’alimentation deviennent saturées au-delà de 4600 UTN, ce qui entraîne probablement une sous-estimation dans le calcul de l’efficacité d’élimination des cellules. De plus, l’efficacité d’élimination des cellules diminue considérablement, passant d’environ 100 % à 57 %, à mesure que le taux de la pompe d’alimentation augmente, un débit de pompe d’alimentation plus lent étant généralement en corrélation directe avec une meilleure clarification des cellules. À mesure que les fabricants de produits biotechnologiques s’orientent vers la fabrication continue, l’utilisation de la technologie des ondes acoustiques peut avoir des applications supplémentaires pour le biotraitement continu et les opérations de bioréacteur à profusion.

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