Imagerie en temps réel de la migration induite par CCL5 de cellules souches squelettiques périostées chez la souris

Ce protocole décrit la détection de la migration des cellules souches squelettiques périostées médiées par CCL5 en temps réel à l’aide de la microscopie intravitale d’animaux vivants.

Le protocole standardisé peut être utilisé pour évaluer la migration cellulaire endogène et peut être appliqué à plusieurs types de cellules ainsi qu’aux phénotypes squelettiques. L’avantage de cette technique est qu’elle permet de suivre la migration cellulaire in vivo pour des cellules individuelles plutôt que pour une population de cellules en réponse à une blessure et/ou à un traitement par cytokines. Avant de commencer la procédure, confirmez l’absence de réponse au pincement des orteils chez la souris anesthésiée et appliquez une pommade sur les yeux de l’animal.

Ensuite, faites une incision transversale de moins d’un centimètre de l’oreille droite vers l’oreille gauche et faites une deuxième incision de l’incision initiale, environ deux à trois millimètres au-delà de l’œil droit vers le nez. Utilisez des pinces pour séparer la peau du périoste et utilisez des ciseaux pour couper doucement le tissu conjonctif afin de séparer la peau du périmètre calvaria. À l’aide d’un coton-tige stérile, appliquez une pommade ophtalmique sur le haut du lambeau cutané et repliez doucement le rabat sur l’œil gauche.

L’intersection des sutures sagittale et coronale doit être clairement exposée. Rincez la surface ouverte avec du PBS stérile pour nettoyer la zone de tout sang et cheveux résiduels et placez la pointe d’un biseau d’une à deux largeurs d’aiguille vers le nez à partir de la suture coronale et d’une à deux largeurs d’aiguille à droite de la suture sagittale. En utilisant une très petite quantité de pression vers le bas, tournez soigneusement la seringue dans le sens des aiguilles d’une montre une fois et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre plusieurs fois.

Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 27 pour élargir la microfracture à environ 40 micromètres. S’il reste des fragments d’os, rincer la microfracture avec du PBS. S’il reste encore des fragments d’os, utilisez une aiguille de calibre 29 pour les retirer délicatement.

Pour le traitement par CCL5, utilisez une solution mère de CCL5 de 100 nanogrammes par millilitre et une matrice de membrane basale pour obtenir une solution chimioattractante de travail de 10 nanogrammes par millilitre. Pour traiter la blessure, chargez une pipette de 220 microlitres avec cinq microlitres de solution et appliquez deux microlitres de chimiokine sur la suture. Laissez ensuite la matrice se solidifier et recouvrez doucement la calvaria avec le lambeau cutané pour vous assurer que le tissu ne se déshydrate pas pendant le traitement de chimiokine d’une heure.

Pour l’imagerie intravitale de la migration des cellules souches périostées en temps réel, avant de déplacer la souris vers le microscope, appliquez une légère pression à l’arrière de la tête de la souris pour vérifier le plan visuel de la calvaria. Si le plan n’est pas de niveau, tournez doucement le dispositif de retenue de la souris vers la gauche ou la droite pour ajuster la position. Ensuite, couvrez l’ensemble de la calvaria dans un lambeau de peau avec de la méthylcellulose stérile à 2 % dans de l’eau et placez la souris sur la platine du microscope motorisé de l’axe XYZ.

À l’aide de la lumière épifluorescente, alignez la souris de manière à ce qu’elle soit face au microscope et que l’intersection des sutures coronale et sagittale soit le point de référence centré de la scène. Placez ensuite un couvercle en verre sur la zone d’imagerie et vérifiez l’alignement. Pour l’imagerie en accéléré de la migration dans et hors de la suture, sélectionnez une lentille d’immersion dans l’eau à faible grossissement pour scanner la calvaire.

Acquérir une image de référence de l’intersection des sutures sagittales et coronales et, à l’aide du SHG et des signaux fluorescents des cellules, localiser chaque site de blessure et enregistrer les coordonnées XYZ ainsi que les distances des sutures sagittales et coronales. Sélectionnez un emplacement sur les sutures coronales ou sagittales pour l’imagerie à long terme et obtenez une image ZStack détaillée de cette zone à partir d’une référence lors de l’imagerie. Utilisez les paramètres du logiciel time-lapse pour enregistrer une image toutes les minutes pendant au moins une heure, en comparant le champ de vision actuel avec le champ de vision initial entre les instantanés.

Si les champs de vision sont différents, utilisez l’image ZStack pour déterminer dans quelle direction le champ de vision doit être ajusté. Récemment, des souris rapporteures GFP alpha-SMA de tomate Mx1 ont été générées chez lesquelles les cellules souches squelettiques périostées sont marquées par un double marquage alpha-SMA positif à Mx1. Peu ou pas de migration des cellules souches squelettiques périostées positives à l’alpha-SMA Mx1 positif est observée sur une période d’imagerie d’une heure, 24 heures après la pose de la suture.

Le traitement par chimiokine CCL5 d’un défaut calvarial 24 heures après la blessure induit une migration directionnellement distincte loin de la suture coronale et vers le site de la blessure. Dans cette analyse représentative, dans l’heure qui a suivi l’imagerie, l’une des cellules souches squelettiques périostées alpha-SMA positives Mx1 positive a migré d’environ 50 micromètres vers la blessure. L’aspect le plus important de ce protocole à retenir est de limiter le traitement par CCL5 au site de la lésion afin de stimuler la migration spécifique des cellules.

Une fois cette procédure terminée, le traitement localisé peut être poursuivi pendant une semaine. Un micro-scanner peut être utilisé pour évaluer la cicatrisation des lésions calvariales et le dépôt de minéraux.