Name: Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez comment étudier l'effet de l'extrait de fumée de cigarette sur la colonisation bactérienne par Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Cette méthode reproductible permet d'évaluer la charge bactérienne post-exposition.

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Ce travail a été soutenu en partie par un National Institutes of Health R01 subventions HL125435 et HL142997 (à CZ).

1. Préparation du CST à 100 %
<ol><li>Dessiner 10 mL de milieux de culture cellulaire sans sérum (DMEM/F12 pour les cellules BEAS-2B; milieu basal épithélial des voies respiratoires pour les cellules HSAEC) dans une seringue de 60 mL.</li>
	<li>Attachez à l’envers une pointe de pipette de 1 mL bien garnie à la buse de la seringue comme adaptateur pour tenir la cigarette (3R4F).</li>
	<li>Retirer le filtre de la cigarette. Attachez une cigarette à l’adaptateur de pointe et allumez la cigarette.</li>
	<li>Dessinez 40 mL d’air contenant de la fumée dans 10 mL de milieu sans sérum. Mélanger la fumée avec le milieu en secouant vigoureusement (30 s par tirage).</li>
	<li>Répétez l’étape 1.4 environ 11x en ~7 min jusqu’à ce que la cigarette soit complètement brûlée.</li>
	<li>Filtrer les 10 mL de milieux fumés à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour exclure les micro-organismes et les particules insolubles. Transférer dans un tube stérile fermé. Préparez le CST à 100 % pas plus de 30 min avant l’essai subséquent.</li>
</ol>2. Pseudomonas culture
<ol><li>Inoculer le P. aeruginosa congelé (souche PAO1) ou P. fluorescens Migula (souche PAO143) dans une plaque d’agar tryptique de soja (TSB) pour la culture du jour au lendemain à 37 °C. REMARQUE : Pour obtenir suffisamment de bactéries pour la culture, répandez autant de bactéries que possible sur la plaque d’agar du BST.</li>
	<li>Recueillir un frottis bactérien et incuber dans 20 mL du BST avec 5% de glycérol comme source de carbone.</li>
	<li>Agiter la suspension bactérienne dans un incubateur de 37 °C à 200 tr/min pendant 1 h jusqu’à la valeur OD600 = 0,6. ATTENTION : Ne laissez pas la vitesse de secousse dépasser 200 tr/min. Des vitesses de secousse plus élevées peuvent endommager la morphologie de la flagelle bactérienne et avoir un impact sur l’invasion bactérienne dans l’épithélie pulmonaire. De même, limiter le temps de secousse à 1 h pour obtenir des bactéries très invasives. Mesurer la valeur od600 pour estimer le nombre de bactéries. Une OD600 = 1 correspond à ~109 unités de formation de colonies (CFU)/mL.</li>
</ol>3. Culture épithéliale pulmonaire humaine et traitement du CST
<ol><li>Culture cellules humaines BEAS-2B dans le milieu HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg d’insuline, 2,5 mg de transférrine, 2,5 mg de sélénite de sodium, 2,5 mg de transferrine, 10 μM d’hydrocortisone, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES et 2 mM L-glutamine) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) tel que décrit précédemment24.</li>
	<li>Culture humaine de petites cellules épithéliales des voies respiratoires (HSAEC) dans le milieu de culture épithéliale des voies respiratoires (500 mL de milieu basal à cellules des voies respiratoires, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM d’acide linoléique, 0,6 μg/mL de lécithine, 6 mM L-glutamine, 0,4% d’extrait P, 1,0 μM d’épinéphrine, 5 μg/mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL hydrocortisone, rh EGF 5 ng/mL, et 5 μg/mL insuline rh). Incuber les cellules à 37 °C en CO2 à5 %.</li>
	<li>Dissocier les cellules avec 1 mL de trypsin de 0,25% pendant 5 min jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement du bas de la plaque.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de support HITES complet pour neutraliser la trypsine et recueillir les cellules dans un tube de 15 mL. Centrifugeuse à 4 °C à 300 x g pendant 5 min. ATTENTION : Surveillez attentivement l’heure de la digestion de la trypsine par microscopie, car la surdiggestion peut causer la mort cellulaire.</li>
	<li>Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 2 mL de hites moyen avec 10% FBS.</li>
	<li>Pipette 10 μL de la suspension cellulaire ci-dessus sur la plaque et l’insérer dans un compteur cellulaire automatisé pour obtenir la concentration dans les cellules/mL.</li>
	<li>Plaquez les cellules BEAS-2B à une concentration de 3 × 105 cellules/mL en 6 plaques de puits dans un volume total de 2 mL dans le milieu HITES complété par 10% de FBS pour la culture du jour au lendemain.</li>
	<li>Traiter les cellules à environ 80% de confluence, ou 5 x 105 cellules/mL, avec 4% de CST pendant 3 h. Avant le traitement du CSE, modifiez le milieu avec le milieu HITES avec 1 % de FBS.</li>
</ol>4. Infection bactérienne
<ol><li>Ajouter P. aeruginosa ou P. fluorescens Migula (~1 × 107 CFU/mL) à chaque puits des cellules traitées au CSE et incuber pendant 1 h à 37 °C dans 5 % de CO2.</li>
	<li>Remplacer les supernatants et remplacer par 2 mL de touches fraîches à traiter par 4% de CSE et 100 μg/mL de gentamicine. REMARQUE : La gentamicine est utilisée parce qu’elle est incapable de pénétrer les membranes cellulaires épithéliales du poumon humain. Ainsi, il peut tuer toutes les bactéries dans le milieu, mais pas ceux qui ont envahi les cellules épithéliales pulmonaires.</li>
	<li>Après 1 h de traitement CSE/gentamicine à 37 °C dans 5% CO2, remplacer les supernatants et laver les cellules 3x avec PBS pour la détermination ultérieure de la concentration bactérienne. REMARQUE : Pour confirmer les bactéries intériorisées, des cellules infectées par P. fluorescens Migula, étiquetée GFP, ont été observées sous microscopie fluorescente.</li>
</ol>5. Détermination de la concentration bactérienne à l’aide de la méthode de la plaque de dépôt
<ol><li>Pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules infectées avec la méthode de la plaque de chute, laver les cellules traitées à la gentamycine 2x avec 2 mL de PBS froid.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lyse cellulaire (0,5% triton X-100 dans PBS) à chaque puits.</li>
	<li>Diluer les lysates cellulaires contenant les bactéries intériorisées dans un gradient (1:10, 1:100, 1:1,000 et 1:10,000) pour l’inoculation suivante à la plaque d’agar du BST.</li>
	<li>Après 16 h d’incubation, obtenez les résultats de cfu en comptant les colonies bactériennes.</li>
</ol>6. Détection RT-qPCR de l’ARN 16S bactérien
<ol><li>Traiter les cellules épithéliales pulmonaires infectées par Pseudomonas(~1 x 106 cellules/mL) avec la gentamycine comme décrit ci-dessus. Apirate le milieu et laver les cellules 2x avec 2 mL de PBS froid.</li>
	<li>Ajouter 0,35 mL du tampon de lyse de thiocyanate de guanidium par puits d’une plaque de 6 puits. Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire. Pipette le lysate dans un tube de microcentrifuge et mélanger doucement avec la pipette.</li>
	<li>Ajouter le même volume (0,35 mL) d’éthanol fraîchement préparé à 70 % dans le lysate et bien mélanger. Transférer tous les échantillons dans une colonne de rotation placée dans un tube de collecte de 2 mL. Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s à 20–25 °C. Ensuite, jetez la mémoire tampon dans le tube de collecte.</li>
	<li>Laver la colonne avec 0,7 mL de tampon de lavage 1. Centrifuge la colonne à 10 000 x g pour 30 s. Lavez la colonne 2x avec 0,5 mL de tampon pour laver l’ARN lié à la membrane. Répéter la centrifuge à 10 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Placez la colonne dans un nouveau tube de collection de 1,5 mL. Ajouter de 30 à 50 μL d’eau sans RNase. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min. Recueillir le débit et mesurer la concentration de l’ARN.</li>
	<li>Effectuer une réaction de transcription inversée selon le protocole du fabricant. Mélanger 1 μg d’ARN total avec 10 mL de tampon de réaction, 1 μL de transcriptase inverse et de l’eau sans RNase pour une réaction de 20 μL. Effectuer la réaction de transcription inverse à 37 °C pendant 1 h, puis 95 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Mélanger les modèles d’ADN (1 μL de chaque réaction de transcription inverse ci-dessus), 5 μL du Mélange principal contenant du colorant SYBR, 1 μL de chaque amorce spécifique de 200 nM et de l’eau dans un mélange de 20 μL pour l’analyse PCR suivante, selon les recommandations du fabricant. NOTE: Les amorces suivantes sont les amorces ciblant l’ARN 16S de P. aeruginosa: avant 5′-CAAAACTGAGCTAGAGTAGCG-3′; inverse 5′-TAAGATCTCCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH a été utilisé comme un contrôle de chargement avec les amorces suivantes: avant: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; inverse: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.</li>
	<li>Utilisez la méthode CT comparative pour déterminer l’expression.</li>
</ol>7. Détection de Pseudomonas fluorescents avec cytométrie de flux
<ol><li>Traitez les cellules épithéliales pulmonaires fluorescentes de Pseudomonasci-dessus (~1 x 106 cellules/mL) avec la gentamycine comme décrit précédemment. Apirate le milieu et laver les cellules 2x avec 2 mL de PBS froid.</li>
	<li>Analyser les échantillons à l’aide d’un cytomètre de débit à une longueur d’onde de 509 nm pour la détection de GFP. Terminez chaque lecture à 100 000 chefs d’accusation. Analyser les données acquises avec un logiciel connexe.</li>
</ol>

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<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

L’invasion bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires est une étape cruciale dans la pathogénie des infections bactériennes. Le processus d’invasion bactérienne dans les cellules peut être divisé en trois étapes suivantes: Premièrement, les bactéries entrent en contact et adhèrent à la surface de la cellule épithéliale à l’aide de leur flagelle. Deuxièmement, les bactéries subissent une internalisation ou pénètrent dans la membrane cellulaire. Enfin, les bactéries reproduisent et colonisent les cellules si el...

Le tabagisme affecte la santé publique de millions de personnes dans le monde. De nombreuses maladies nocives, y compris le cancer du poumon et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), seraient liées au tabagisme1,2. Le tabagisme augmente la susceptibilité aux infections microbiennes aiguës dans le système respiratoire3,4,5. En outre, les preuves de montage prouvent que le tabagisme améliore la pathogénie de nombreux troubles chroniques6,7,8. Par exemple, le tabagisme peut augmenter les infections virales ou bactériennes qui causent l’exacerbation de la MPOC9. Parmi les pathogènes bactériens qui contribuent étiologiquement à l’exacerbation aiguë de la MPOC, un pathogène gramme-négatif opportuniste bacillus, Pseudomonas aeruginosa, provoque des infections qui se corrélent avec de faibles pronostics et des mortalités plus élevées10,11. L’exacerbation de la MPOC aggrave la maladie en accélérant la progression pathologique. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre l’exacerbation de la MPOC, à l’exception de la prise en charge antisymptomatique12. L’exacerbation de la MPOC favorise la mortalité des patients, diminue la qualité de vie et augmente le fardeau économique pour la société13.
Les voies respiratoires sont un système ouvert, continuellement soumis à divers agents pathogènes microbiens présents à l’extérieur. Des agents pathogènes bactériens opportunistes sont habituellement détectés dans les voies respiratoires supérieures, mais sont parfois observés dans les voies respiratoires inférieures14,15. Dans les modèles animaux P. aeruginosa peut être détecté dans les sacs alvéolaires dès 1 h après l’infection16. En tant que mécanisme de défense majeur, les cellules immunitaires telles que les macrophages ou les neutrophiles éliminent les bactéries dans les voies respiratoires. Les cellules épithéliales pulmonaires, en tant que première barrière physiologique, jouent un rôle unique dans la défense de l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules épithéliales pulmonaires peuvent réguler l’invasion microbienne, la colonisation ou la réplication indépendamment des cellules immunitaires17. Certaines molécules présentes dans les cellules épithéliales, y compris PPARg, exercent des fonctions antibactériennes, régulant ainsi la colonisation bactérienne et la réplication dans les cellules épithéliales pulmonaires18. Le tabagisme peut altérer les molécules et altérer la fonction de défense normale dans les cellules épithéliales pulmonaires19,20. Des études récentes ont rapporté l’exposition directe de la fumée de cigarette aux cellules épithéliales de poumon utilisant l’appareil de tabagisme de robot21,22. Toutefois, l’exposition à la fumée peut être effectuée d’autres façons, y compris l’application du CST. La préparation du CST est une approche reproductible avec des applications potentielles dans d’autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales vasculaires qui sont indirectement exposées à la fumée de cigarette.
Ce rapport décrit un protocole pour générer l’extrait de fumée de cigarette pour modifier la charge bactérienne dans les cellules épithéliales de poumon. CST augmente la charge bactérienne de P. aeruginosa, et il peut contribuer à la récurrence des infections bactériennes habituellement observées dans l’exacerbation de la MPOC. Une méthode conventionnelle est utilisée pour la préparation du CST. Les cellules épithéliales pulmonaires, à leur stade de croissance exponentielle, sont traitées avec 4% de CST pendant 3 h. Alternativement, les cellules épithéliales pulmonaires de culture monocouche peuvent être directement exposées à la fumée de cigarette dans une interface air-liquide. Les cellules traitées au CSE sont ensuite défiées avec pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les bactéries sont propagées à une vitesse de secousse particulière pour s’assurer que la morphologie de leur flagelle reste intacte pour conserver leur pleine capacité invasive. La gentamycine est utilisée pour tuer les bactéries laissées dans le milieu de culture, réduisant ainsi la contamination potentielle pendant la détermination ultérieure de la charge bactérienne. Le protocole utilise également pseudomonasétiqueté GFP , qui a été utilisé comme un outil puissant dans l’étude de l’infection Pseudomonas dans différents modèles. Une souche représentative est P. fluorescens Migula23. Le degré d’infection ou de charge bactérienne après le traitement du CST est déterminé de trois façons : la méthode de la plaque de chute avec le comptage des colonies, le PCR quantitatif à l’aide d’amorces spécifiques à pseudomonas 16S, ou la cytométrie de flux dans les cellules infectées par des pseudomonas fluorescents. Ce protocole est une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 50mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellule épithéliale des voies respiratoires milieu basal</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de bactéries</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kit de croissance des cellules épithéliales bronchiques</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Système</td> <td>de PCR en temps réelBio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIT ARN-ADN haute capacité</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES</td><td>moyenne ATCC ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>cellules humaines BEAS-2B ATCC</td><td></td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>cellules épithéliales primaires humaines des petites voies respiratoires</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>LSRII cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Nikkon</td> Lecteur <td>Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OD</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorces PCR</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC ATCC</td><td>47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>Cigarettes de qualité recherche (3R4F)</td><td>Université du Kentucky</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell Insert</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Bouillon de soja</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Le tabagisme est la principale cause étiologique de l’emphysème pulmonaire et de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Le tabagisme favorise également la susceptibilité aux infections bactériennes dans le système respiratoire. Cependant, les effets du tabagisme sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines n’ont pas encore été étudiés en profondeur. Décrit ici est un protocole détaillé pour la préparation des extraits de tabagisme (CSE), le traitement des cellules épithéliales pulmonaires humaines avec CSE, et l’infection bactérienne et la détermination de l’infection. Le CST a été préparé selon une méthode conventionnelle. Les cellules épithéliales pulmonaires ont été traitées avec 4% de CSE pour 3 h. Les cellules traitées au CSE ont alors été infectées par Pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les charges bactériennes des cellules ont été déterminées par trois méthodes différentes. Les résultats ont montré que le CSE a augmenté la charge de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Ce protocole fournit donc une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.

Un diagramme est utilisé pour illustrer le protocole de la figure 1. Les cellules épithéliales du poumon BEAS-2B ont été traitées avec le CST et défiées par Pseudomonas. Pseudomonas dans le milieu de culture ont été tués par la gentamycine ajoutée et les cellules ont été soumises à l’essai de plaque de chute, la détection de RT-qPCR de Pseudomonas ribosome 16S ARN, et la cytométrie de flux. Par rapport au contrôle, le traitement du CST a considérablement augmenté l...

Décrit ici est un protocole pour étudier comment l’extrait de fumée de cigarette affecte la colonisation bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires.

Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Ce protocole utilise trois approches pour déterminer si la fumée de cigarette affecte la charge bactérienne pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Cette méthode peut être étendue aux cellules endothéliales ou à d’autres robinets cellulaires. La préparation de l’extraction de la fumée de cigarette, l’infection bactérienne et la détermination avec une charge bactérienne sont bien décrites en détail dans cette vidéo.Cette procédure est très facile à suivre pour les nouveaux utilisateurs. Dessinez 10 millilitres de milieu de culture cellulaire sans sérum dans une seringue de 60 millilitres. Fixez l’extrémité étroite d’une garniture à une pointe de pipette millilitre à la buse de la seringue, comme adaptateur pour tenir la cigarette.Retirez le filtre de la cigarette et attachez la cigarette à l’adaptateur. Pas plus de 30 minutes avant d’effectuer l’analyse de combust la cigarette et dessiner 40 millilitres de fumée contenant de l’air dans la seringue. Mélanger la fumée avec le milieu en secouant vigoureusement la seringue.Répétez le processus de dessin jusqu’à ce que la cigarette soit complètement brûlée, ce qui nécessitera environ 11 tirages en environ sept minutes. Pour éliminer les micro-organismes et les particules insolubles du milieu, filtrez-les à travers un filtre de 0,22 micron. Ensuite, transférer le milieu dans un tube stérile fermé.Inoculer un bouillon de syxtique tryptique ou une plaque d’auger TSB avec une souche de pseudomonas sélectionnée. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Préparez un tube contenant 20 millilitres de BST avec 5 % de glycérol comme source de carbone.Recueillir un frottis dans la plaque de la tarière et inoculer le BST. Incuber la suspension des pseudomonas dans un shaker de 37 degrés Celsius à 200 RPM, pendant environ une heure, jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres soit de 0,6. Après la culture des cellules épithéliales pulmonaires telles que décrites dans le manuscrit, ajouter un millilitre de trypsine de 0,25% aux cellules.Après environ cinq minutes, lorsque les cellules se sont complètement détachées du fond de la plaque, ajouter 10 millilitres de hauteurs complètes moyennes pour neutraliser la trypsine. Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 300 fois G.Retirez et jetez le supernatant.Ensuite, re-suspendre les cellules en millilitres de hauteurs moyennes avec 10%FBS. Pipette 10 microlitres de la suspension épithéliale de cellules sur une nouvelle plaque. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour obtenir la concentration cellulaire.Plaquez les cellules épithéliales pulmonaires à une concentration de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, dans un volume total de deux millilitres de milieu par puits. Incuber les assiettes toute la nuit. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, remplacez le milieu par des hauteurs moyennes, plus 1%FBS.Ensuite, ajoutez 4% de CSE aux puits et incubez les plaques pendant trois heures. Ajouter un pseudomonas à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires traitées par le CST. Ensuite, incuber les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Ensuite, remplacez le milieu dans les six plaques de puits par deux millilitres de hauteurs fraîches moyennes, contenant 4% de CSE et 100 microgrammes par millilitre de gentamycine. Après avoir couver les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, aspirer le milieu des puits. Lavez les cellules traitées à la gentamycine, deux fois, avec deux millilitres de PBS froid.La charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires peut alors être détectée par la méthode de la plaque de chute, qRT-PCR, ou cytométrie d’écoulement. Ajouter un millilitre de tampon de lyse cellulaire à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires. Réparer les dilutions en série du lysate cellulaire, allant de 1 à 10 à 10 000.Puis inoculer la plaque d’auger du BST. Après 16 heures d’incubation, déterminer combien d’unités de formation de colonies étaient présentes dans les cellules épithéliales pulmonaires, en comptant le nombre de colonies bactériennes. Ajouter 0,35 millilitres du tampon de lyse de thiocyanate de guanidinium à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires.Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire. Pipette le lysate dans un tube de micro-centrifugeuse et mélanger doucement avec la pipette. Ajouter 0,35 millilitres de fraîchement préparé à 70% d’éthanol au lysate et bien mélanger.Transférer tous les échantillons dans une colonne de spin placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifugeuse le tube de collecte pendant 30 secondes à 10 000 fois G et 20 à 25 degrés Celsius. Jetez le tampon dans le tube de collecte et lavez la colonne avec 0,7 millilitres de tampon de lavage.Centrifuger la colonne à 10 000 fois G pendant 30 secondes. Lavez la colonne deux fois avec 0,5 millilitres de tampon. Répétez la centrifugation à 10 000 fois G pendant deux minutes.Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajoutez de 30 à 50 microlitres d’eau sans RNase. Après avoir centrifugé le tube à 10 000 fois G pendant une minute, recueillir le flux à travers et mesurer la concentration d’ARN. Pour se préparer à une réaction de transcription inverse de 20 microlitres fait un microgramme d’ARN total avec 10 microlitres de tampon de réaction, un microlitre de transcriptase inverse et de l’eau sans RNase.Effectuer la réaction de transcription inverse à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, selon le protocole du fabricant. Mélangez ensuite un microlitre de chaque échantillon d’ADNC avec cinq microlitres du mélange principal contenant du colorant cyber et un microlitre de chaque amorce spécifique de 200 nanomolaires. Ajouter de l’eau pour un volume total de 20 microlitres.Effectuer l’analyse PCR, selon les recommandations du fabricant. Ensuite, utilisez la méthode comparative CT pour déterminer l’expression. Dans les cellules BEAS-2B, la viabilité n’a pas changé considérablement quand les cellules ont été traitées avec 4%CSE pendant trois heures.Une heure comme infection de pseudomonas n’a pas non plus sensiblement affecté la viabilité. Enfin, ils utilisent de la gentamycine pour tuer les pseudomonas dans le milieu de la culture n’a pas eu un effet statistiquement significatif sur la viabilité cellulaire. Comme mesuré par la méthode de plaque de chute, l’infection bactérienne dans les cellules de BEAS-2B a été sensiblement augmentée par le traitement avec le CST.Il en va de même pour le traitement par le CSE du HSAEC. L’infection bactérienne des cellules BEAS-2B traitées par le CST a également été évaluée en utilisant rt-PCR pour quantifier la quantité de 16S rRNA présent, qui a indiqué une augmentation de Pseudomonas aeruginosa. Les cellules BEAS-2B traitées avec le CST et infectées par pseudomonas fluorescens Migula ont été analysées par cytométrie d’écoulement à 509 nanomètres.Le résultat a également indiqué que le traitement de CSE augmente l’infection bactérienne. Les résultats de la microscopie fluorescente ont montré que les bactéries étiquetées GFP co-localisées avec les cellules BEAS-2B dans une expérience pseudomonas fluorescens Migula infection. Les cellules pourraient être exposées à la fumée de cigarette avec des robots fumant, ce qui peut imiter le comportement humain et rendre possible d’étudier directement les effets de la fumée de cigarette sur les cellules épithéliales pulmonaires.Cette technique pourrait être utilisée pour explorer une fumée de cigarette sur d’autres robinets cellulaires dans le contexte d’une infection pulmonaire. L’approche décrite pour être à la base du développement de thérapies efficaces contre une lésion pulmonaire dorsale de tabagisme et C0PD supplémentaire

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide comme un modèle de l'épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour l'isolement, la culture et d'exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante, afin d'étudier les réponses moléculaires à cette toxine de l'environnement.

L&#39;isolement de la souris les cellules épithéliales respiratoires et l&#39;exposition à la fumée de cigarette expérimentale chez Air interface liquide

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

L’objectif de ce protocole est de fournir des méthodes automatisées pour quantifier les pathologies pulmonaires chroniques dans un modèle murin de BPCO. Le protocole comprend l’exposition de souris à la fumée de cigarette (CS), la mesure de la fonction pulmonaire, le gonflement des poumons et l’utilisation de méthodes de morphométrie pour mesurer l’emphysème et le remodelage des petites voies respiratoires chez la souris.

Mesure automatisée de l&#39;emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées

L’objectif de ce protocole est d’exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques humains en 3D à la fumée de cigarette principale (CS) à l’interface air-liquide. L’impact de la CS sur les tissus est ensuite étudié à l’aide d’un test d’activité du cytochrome P450, d’une mesure du battement des cils et d’une approche de biologie des systèmes.

Évaluation de l&#39;impact de l&#39;exposition répétée de organotypiques 3D bronchiques et nasales Tissue Culture modèles Whole fumée de cigarette

À l’aide d’essais ex vivo optimisés sur cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC), nous avons montré qu’une préparation de produit du tabac combustible supprime de manière marquée les cytokines sécrétées par voie intracellulaire médiées par les récepteurs et la capacité cytolytique des PBMC effecteurs. Ces tests rapides peuvent être utiles pour évaluer les produits et comprendre les effets potentiels à long terme de l’exposition au tabac.

Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l&#39;immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

Alors que l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène permet de caractériser des réponses immunitaires spécifiques, des modèles in vivo sont nécessaires pour observer les effets de réponses complexes. En utilisant l’exposition à Candida albicans suivie d’une infection pulmonaire médiée par Pseudomonas aeruginosa, nous avons établi un modèle murin des interactions microbiennes impliquées dans la pathogénicité de la pneumonie associée à la ventilation assistée.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Présenté ici est un protocole utile pour la fixation pulmonaire qui crée une condition stable pour l'évaluation histologique des spécimens de poumon à partir d'un modèle de souris de l'emphysème. Le principal avantage de ce modèle est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation.

Fixation pulmonaire sous pression constante pour l'évaluation de l'emphysème chez les souris

Ce protocole démontre l’étude des effets pathophysiologiques de la fumée de cigarette (CS) avec un système d’exposition de l’inhalation du corps entier (WBI) (WBIS) construit en interne. Ce système peut exposer les animaux au CS dans des conditions reproductibles contrôlées pour la recherche des effets médiés par le CS sur l’emphysème pulmonaire et l’hématopoïèse.

Exposition à la fumée de cigarette chez les souris utilisant un système d’inhalation du corps entier

Présenté ici est une méthode reproductible, abordable et robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules épithéliales bronchiques primaires pour la biobanque à long terme et la génération de cellules épithéliales différenciées par culture à l’interface air-liquide.

Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées

Ici, nous décrivons un modèle in vitro pour isoler et différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires murines, en nous concentrant sur leur acclimatation à l’extrait chronique de fumée de cigarette (ECS). Le modèle pourrait être utilisé pour caractériser de manière exhaustive l’impact multi-omique de l’ECS, ce qui pourrait donner un aperçu des réponses cellulaires en cas d’exposition chronique à la fumée.

Modèle in vitro pour l’étude de la différenciation et des modifications de la multi-omique sur des cellules épithéliales des voies respiratoires murines stimulées par un extrait de fumée de cigarette

Découvrez comment étudier l'effet de l'extrait de fumée de cigarette sur la colonisation bactérienne par Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Cette méthode reproductible permet d'évaluer la charge bactérienne post-exposition.

Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires

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