Name: Préparation d’extraits cellulaires par cryogrinding dans un moulin à congélateur automatisé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Apprenez la cryobroyage automatisé pour préparer des extraits cellulaires de levure à ultra-basse température. Cette méthode préserve l'intégrité des protéines et améliore le rendement des macromolécules fonctionnelles.

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La recherche dans le laboratoire Gunjan est soutenue par le financement des National Institutes of Health, de la National Science Foundation et du Florida Department of Health. Nous remercions John Parker, étudiant de premier cycle, pour son assistance technique.

1. Préparation de maïs soufflé à levures
<ol><li>Cultiver des cellules de levure dans 0,5 L de médias YPD à une densité de 1 x 107 cellules /mL. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur Coulter ou de tout autre moyen.</li>
	<li>Cellules centrifugeuses pendant 10 min à 2 400 g et 4 °C.</li>
	<li>Lavez chaque échantillon une fois avec 500 mL d’eau glacée déionisée de 18 méga Ohm Milli-Q.</li>
	<li>Resuspendez les granulés dans 15 mL de tampon de lyse glacée [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glycérol, avec agent réducteur fraîchement ajouté 10 mM β-mercaptoethanol, cocktail inhibiteur de la protéase, inhibiteur du protéasome 10 μM MG-132, inhibiteur de la deacetylase de 1 mM inhibiteur du butyrate de sodium et inhibiteurs du phosphatase (vanadate de sodium de 1 mM, fluorure de sodium de 50 mM, β-glycérophosphate de sodium)]. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails. Gardez les cellules résuspendées sur la glace jusqu’à ce que les échantillons soient prêts pour la prochaine étape. REMARQUE : Une grande variété de tampons de lyse contenant un certain nombre de détergents non ioniques peuvent être utilisés avec les échantillons et les inhibiteurs spécifiques qui y sont inclus en fonction de l’application en aval. L’inclusion de protéase et d’inhibiteurs protéasomal est cruciale pour prévenir la dégradation des protéines, en particulier une fois que les extraits sont décongelés.</li>
	<li>Faire snap pop-corn de levure congelée en ajoutant lentement la suspension cellulaire une goutte à la fois à l’aide d’une pipette sérologique pré-réfrigérée dans un ou plusieurs tubes centrifugeuses de 50 mL conservés sur la glace sèche et remplis de LN2 jusqu’à ce que juste en dessous de la jante. Rechargez fréquemment l’azote liquide dans le tube pour compenser sa perte due à une évaporation rapide. Travaillez dans une zone bien ventilée pour éviter les dangers associés à l’asphyxie de l’azote.<ol>
<li>Au lieu d’un tube de 50 mL, utilisez plusieurs tubes de 50 mL attachés entre eux (ou tout récipient avec une grande bouche, comme une grande bouteille de centrifugeuse en plastique qui peut tolérer des températures cryogéniques) pour la préparation du maïs soufflé (figure 1A). Plus le récipient est grand et son ouverture, plus la préparation du maïs soufflé est facile, car cela empêche l’agglutination du maïs soufflé de former de gros agrégats. Une plage de taille de 0,3 à 0,5 cm pour le maïs soufflé est idéale pour obtenir un broyage/pulvérisation approprié à l’aide du moulin à congélateur (figure 1B).</li>
		<li>Assurez-vous que le LN2 s’est complètement évaporé des tubes contenant le maïs soufflé avant de les stocker à -80 °C. Il est possible de s’arrêter après la préparation du maïs soufflé levure car ils sont stables pendant plusieurs années lorsqu’ils sont maintenus à -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> Figure 1 :Préparation de maïs soufflé à levures. (A) Levure « pop-corn » est faite par la congélation dropwise de la suspension cellulaire dans LN2. Nous utilisons un à trois tubes de 50 mL maintenus ensemble avec un élastique et placés dans un seau à glace rempli de glace sèche. Les tubes sont remplis de LN2 jusqu’à ce que juste en dessous de leurs jantes et sont complétés avec de l’azote liquide fréquemment pour les garder presque plein jusqu’à ce que toute la suspension cellulaire avait été faite en maïs soufflé (B) La taille du maïs soufflé est un déterminant important de l’efficacité optimale de broyage. La portée du maïs soufflé doit être comprise entre 0,3 et 0,5 cm de diamètre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
2. Cryogrinding
<ol><li>Pour commencer, assurez-vous qu’il y a suffisamment de LN2 disponible pour refroidir l’usine de congélation, broyer les flacons, les fournitures et faire fonctionner la machine pour tous les échantillons. Pour moins de cinq échantillons, 30-35 L de LN2 devraient suffire. Remplissez la chambre de l’usine de congélation de LN2 jusqu’à la ligne de remplissage. AVERTISSEMENT: Toutes les étapes impliquant le LN2 doivent être effectuées dans une zone bien ventilée et l’usine de congélation elle-même doit être située dans une telle zone afin d’éviter tout risque d’asphyxie. Portez de l’équipement de protection individuelle, y compris des chaussures appropriées, un manteau de laboratoire, des lunettes de sécurité, une couche de base de gants de nitrile, puis des gants thermiques, suivis d’une autre paire de gants de nitrile. Faire preuve d’une extrême prudence lors de la manipulation de LN2.</li>
	<li>Fermez lentement le couvercle du moulin à congélateur, en évitant l’éclaboussure de LN2 et laissez quelques minutes pour que la machine refroidisse. Il peut être nécessaire de remplir la chambre de LN2 pour compenser la perte due à l’évaporation avant de passer à l’étape suivante. REMARQUE : Remplissez LN2 au besoin uniquement jusqu’à la ligne de remplissage. Ne remplissez pas trop la chambre car cela peut être à la fois dangereux et préjudiciable à la machine. Des systèmes de recharge automatisés sont disponibles pour l’usine de congélation qui peut reconstituer le LN2 évaporant au besoin directement à partir d’un réservoir de stockage relié à l’usine de congélation.</li>
	<li>Pré-refroidir les grandes fioles de broyage et la barre d’impacteur magnétique en les dunking dans LN2 conservés dans une petite dewar séparée. Décanter toute la LN2 lorsque le LN2 cesse de bouillonner. Ajouter ensuite le maïs soufflé échantillon/levure au flacon de broyage et sceller hermétiquement avec les deux bouchons d’extrémité en acier inoxydable.<ol>
<li>Ne remplissez pas plus d’un tiers du flacon de broyage avec l’échantillon, car cela peut réduire l’efficacité du broyage. Au lieu de cela, de plus gros échantillons peuvent être traités en les divisant en deux flacons ou plus et en les broyant séquentiellement. De plus petits flacons de broyage peuvent être utilisés pour des échantillons plus petits (jusqu’à 3 mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Placez le flacon de broyage dans la chambre de l’usine de congélation et verrouillez-le en place. Fermez le couvercle.</li>
	<li>Pour la levure en herbe, moudre les échantillons pendant un total de trois cycles pendant 2 min/cycle (avec 2 minutes de pause pour le refroidissement entre les cycles) à un taux de concassage de 14. Lorsque la machine s’arrête après avoir terminé les cycles, ouvrez lentement et soigneusement le couvercle du moulin à congélateur avec le flacon avec le lysate de cellules congelées en poudre et retirez-le du moulin à congélateur. Si plusieurs petits flacons sont utilisés, travaillez rapidement pour enlever un flacon à la fois et les placer dans de la glace sèche. REMARQUE : Il n’est généralement pas nécessaire d’ajuster les paramètres de broyage lors de l’utilisation de flacons de différentes tailles avec le même type d’échantillon. Toutefois, les paramètres de broyage tels que le nombre de cycles et le taux de broyage doivent être déterminés empiriquement pour différents types d’échantillons, selon la facilité avec laquelle ils lyse. La plupart des cellules mammifères et des tissus mous se lysent en 1-2 cycles à un taux écrasant de 10. Les échantillons plus difficiles à lyser comme les bactéries, les levures, les larves de mouches et les mouches des fruits adultes nécessitent de 3 à 6 cycles au rythme maximal, tandis que les tissus durs comme les os, les dents, etc. peuvent nécessiter jusqu’à 10 cycles. Un petit aliquot de l’échantillon décongelé peut être vu sous le microscope avant et après le broyage pour compter le nombre de cellules intactes et nonlysées pour déterminer l’efficacité de la lyse. Une excellente analyse de l’impact des paramètres cryogrinding sur la libération des protéines et de l’ADN de la levure naissante a été publiée précédemment15.</li>
	<li>En travaillant rapidement afin de ne pas permettre à l’échantillon de décongeler, dévissez soigneusement l’une des pièces d’extrémité (choisissez celle qui semble être devenue un peu lâche pendant le broyage) à l’aide de l’outil d’ouverture. Ensuite, utilisez une paire de forceps longs (qui sont pré-refroidis dans un seau avec de la glace sèche) pour enlever la barre d’impacteur. Recueillir l’échantillon pulvérisé en inversant et en tapant le flacon de broyage sur un plat de pesage en polystyrène pré-réfrigéré avec du LN2 et conservé sur de la glace sèche.</li>
	<li>Une fois que tout le lysate de cellules congelées en poudre a été récupéré du flacon de broyage, versez le lysate en poudre du plat de pesage dans le tube de 50 mL et passez immédiatement à l’étape de décongélation lente décrite ensuite pour obtenir de meilleurs résultats. Sinon, conservez le lysate congelé en poudre toute la nuit à -80 °C, bien que cela puisse entraîner une certaine dégradation.</li>
	<li>Préparez un seau à glace avec une boue de glace et d’eau à 50 % et placez-le sur une plaque de remue-glace à l’aide d’un agitateur magnétique. Submergez une grille ou une autre grille appropriée dans le lisier de glace pour retenir les échantillons.<ol>
<li>Puis, décongelez lentement les échantillons sur un bain de boue de glace avec agitation constante du lisier à l’aide d’un agitateur magnétique. Ajouter plus de glace pour remplacer la fonte des glaces (il se peut qu’il soit nécessaire de jeter de l’eau pour empêcher le seau à glace de déborder). Étant donné que plusieurs inhibiteurs ont une courte demi-vie dans des tampons aqueux, ajouter un cocktail inhibiteur supplémentaire de la protéase (voir tableau des matériaux)et un inhibiteur du protéasome MG-132 de 10 μM au lysate une fois que les échantillons commencent à décongeler (après environ 30 min).</li>
		<li>Retirer la glace formée à l’extérieur des tubes toutes les 5 minutes pour accélérer le processus de décongélation. Notez que le dégel rapide des échantillons à température ambiante ou plus élevée peut entraîner une dégradation significative.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois que les échantillons ont complètement décongelé (cela peut prendre plus d’une heure selon la quantité d’échantillon), centrifugeuse du lysate à ~3 220 g pendant 20 min dans une centrifugeuse réfrigérée à table à 4 °C pour enlever la majeure partie des débris cellulaires du lysate.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans des tubes de centrifugeuse en polycarbonate de 50 mL qui ont été pré-refroidis sur la glace et centrifuger les échantillons à 16 000 g pendant 20 min à 4 °C (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Transférez seulement le supernatant clair composé de l’extrait entier clarifié de cellules du centre de la colonne liquide dans le tube très lentement et soigneusement, sans déranger la couche nuageuse de lipide (figure 2), dans un tube refroidi de 15 mL utilisant des pipettes sérologiques pré-refroidies. Évitez d’enlever tout le lysate dans le tube de centrifugeuse pour empêcher le report des lipides et des débris. Les restes de lysate dans le tube de centrifugeuse peuvent être centrifugés plusieurs fois pour récupérer de petites quantités d’extrait après chaque tour. REMARQUE : Les lipides ainsi que toutes les protéines dénaturées semblent nuageux/laitux et sont situés au sommet de l’interface liquide/air, et parfois au-dessus de la pastille elle-même qui se compose de débris cellulaires insolubles (figure 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> Figure 2 :Extraire les couches dans un tube de centrifugeuse. Les principales caractéristiques visibles de l’extrait cellulaire entier dans un tube après centrifugation à 16.000 g pendant 20 min sont indiquées. L’abondance relative de chaque entité dépend du type d’échantillon, de la phase de croissance des cellules (exponentielle par rapport stationnaire), de la quantité de tampon de lyse utilisée pour résuspendre les cellules et de l’efficacité de la lyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<ol start="12"><li>Centrifugeuse tout lysate restant pendant 5 min pour récupérer plus de l’extrait. Répétez cette centrifugation de 5 min plusieurs fois si nécessaire pour récupérer autant d’extrait clair que possible. Jetez le lysate nuageux contenant des lipides près du fond du tube près de la pastille.</li>
	<li>Utilisez ces extraits pour des applications en aval telles que la purification complexe protéique, l’immunoprécipitation et l’analyse protéomique.</li>
</ol>

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<li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sr-87%2FSr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley%3A+Implications+for+early+hominid+habitat+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+Et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li>
<li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka%5BTitle%5D)+AND+%22Geology%22%5BJournal%5D)">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une limitation de l’étude des protéines indigènes de la levure est la lyse inefficace des cellules de levure en raison de leur paroi cellulaire dure. Bien que plusieurs méthodes aient été développées, la méthode la plus cohérente et efficace dans nos mains est le cryogrinding des cellules de levure flash congelés comme pop-corn. Cette méthode permet la préparation fiable d’extraits de cellules entières de haute qualité de levure en herbe par rapport à d’autres méthodes de lyse. Les résultats représentatifs ont démontré q...

La levure est un organisme modèle populaire pour les études protéiques, car il s’agit d’un organisme eucaryotique simple avec une abondance d’outils génétiques et biochimiques disponibles pour leschercheurs 1. En raison de leur paroi cellulaire robuste, un défi auquel les chercheurs sont confrontés est de lyser efficacement les cellules sans endommager le contenu cellulaire. Différentes méthodes sont disponibles pour obtenir des extraits de protéines par la perturbation des cellules de levure qui comprennent la lyse enzymatique (zymolyase)2,3, lysechimique 4, lyse physique par gel-dégel5, à base de pression (Français presse)6,7, mécanique (perles de verre, moulin à café)8,9, sonication à base de10 et cryogénique2,11. L’efficacité de la lyse cellulaire et le rendement protéique peuvent varier considérablement selon la technique employée, affectant ainsi le résultat final ou l’adéquation pour l’application en aval désirée pour le lysate. Lorsque vous étudiez des protéines instables, qui ont des modifications posttranslationnelles fugaces ou qui sont sensibles à la température, il est particulièrement important d’utiliser une méthode qui minimisera la perte ou la dégradation de l’échantillon pendant la préparation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Technique de préparation d’extrait</td>
			<td>Détails</td>
			<td>Avantages</td>
			<td>Inconvénients</td>
			<td>Analyse en aval</td>
			<td>Référence</td>
		</tr><tr><td>Français presse: Homogénéiseur haute pression (aka Microfluidizer) avec prétraitement enzymatique à l’aide de Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, homogénéiseur haute pression Microfluidizer. Le perturbateur se compose d’une pompe à haute pression à conduite d’air (rapport 1:250; pression d’air requise de 0,6 l MPa) et d’une chambre de perturbation spéciale avec une unité de pression arrière supplémentaire. Une taille minimale d’échantillon de 20 mL est requise pour le traitement.</td>
			<td>La perturbation totale finale obtenue à l’aide du protocole combiné a approché 100 % avec 4 passes à une pression de 95 MPa, contre seulement 32 % de perturbations avec 4 passes à 95 MPa utilisant uniquement l’homogénéisation sans la Zymolyase.</td>
			<td>Pas approprié pour les applications à petite échelle. Les enzymes peuvent devenir coûteuses pour les préparations à grande échelle.</td>
			<td>Purification des protéines</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Batteur de perles: Zymolyase cellules traitées lysed avec des perles de verre dans un instrument fastprep</td>
			<td>Un volume à peu près égal de perles de verre froides, sèches et lavées à l’acide de 0,5 mm est ajouté à un volume donné de granulés cellulaires dans le tampon de lyse et les cellules sont perturbées par une agitation manuelle vigoureuse.</td>
			<td>Il est particulièrement utile lors de la fabrication d’extraits de nombreuses petites cultures de levure différentes à des fins d’analyse plutôt que pour la purification des protéines.</td>
			<td>Pendant la procédure de perle de verre, les protéines sont traitées sévèrement causant la mousse étendue menant à la dénaturation de protéine. La quantité de rupture cellulaire varie, tandis que la protéolyse ainsi que la modification des protéines peuvent résulter du chauffage de l’extrait au-dessus de 4 °C pendant la rupture mécanique.</td>
			<td>Principalement des analyses d’ADN et d’ARN, mais aussi l’analyse des protéines par électrophéorèse de gel dénaturant, avec ou sans ballonnement occidental.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Traitement de zymolyase suivi d’une lyse utilisant une combinaison de choc osmotique et d’homogénéisation de Dounce</td>
			<td>Après digestion enzymatique des parois cellulaires, les sphéoplastes sont lysés avec 15 à 20 coups d’un pilon moulant (dégagement de 1 à 3 μm) dans un homogénéisateur Dounce.</td>
			<td>Avantageux d’utiliser des souches déficientes en protéase telles que BJ926 ou EJ101. C’est la façon la plus douce de briser les cellules de levure et, par conséquent, il est le plus approprié pour la préparation d’extraits qui peuvent effectuer des fonctions enzymatiques complexes (par exemple, traduction, transcription, réplication de l’ADN) et dans lequel l’intégrité des structures macromoléculaires (par exemple, ribosomes, épissures) doit être maintenue. Il est également utile pour isoler les noyaux intacts qui peuvent être utilisés pour des études de chromatine (Bloom et Carbon, 1982) ou pour des extraits de protéines nucléaires (Lue et Kornberg, 1987).</td>
			<td>Les principaux inconvénients de la procédure de lyse sphéroplaste sont qu’il est relativement fastidieux et coûteux, en particulier pour les préparations à grande échelle (>10 litres), et les longues périodes d’incubation peuvent conduire à la protéolyse ou la modification des protéines.  Pour les préparations de chromatine, elles semblent être de qualité variable ou inférieure à celles produites par la centrifugation différentielle (basée sur l’intégrité de l’échelle nucléosome).</td>
			<td>Isoler les noyaux intacts pour les études de chromatine, extraits qui peuvent effectuer des fonctions enzymatiques complexes, extraits nécessitant l’intégrité de structures macromoléculaires, extraits de protéines nucléaires.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Perturbation cellulaire des cellules congelées flash en broyant de l’azote liquide à l’aide d’un mortier ou d’un pilon ou d’un mélangeur</td>
			<td>Les cellules sont congelées immédiatement dans de l’azote liquide, puis lysées en broyant manuellement dans un mortier à l’aide d’un pilon, ou à l’aide d’un mélangeur Waring en présence d’azote liquide.</td>
			<td>Le protocole est rapide et facile. Il peut accueillir différentes quantités de cellules de levure, y compris de très grandes cultures. Son principal avantage est que les cellules sont prélevées immédiatement de l’état de croissance active dans l’azote liquide (−196 °C), diminuant les activités enzymatiques dégradantes telles que les protéases et les nucléases ainsi que les activités qui modifient les protéines (p. ex., phosphatases et kinases). Il est particulièrement adapté pour la fabrication d’extraits de cellules entières à partir d’une seule culture de levure pour la purification des protéines à grande échelle.</td>
			<td>Un peu désordonné et potentiellement dangereux pour l’enquêteur négligent. Les petits échantillons (c.-à-d. les cultures de levure de 10 à 100 ml) ne sont pas faciles à traiter parce qu’il n’y a pas assez de masse de touffes de cellules congelées pour se fracturer efficacement dans le mélangeur. Il est long de traiter des échantillons individuels et de nettoyer l’équipement entre les utilisations.</td>
			<td>Extraits de cellules entières d’une seule culture de levure pour la purification des protéines à grande échelle.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolyse, moulin à perles</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Lyse rapide et efficace, en particulier pour la préparation d’extraits à petite échelle</td>
			<td>La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. Équipement de battement de perle requis.</td>
			<td>Analyses à petite échelle.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolyse, Sonication</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, puissance 80%</td>
			<td>L’équipement de sonication est habituellement disponible dans la plupart des institutions.</td>
			<td>La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. Équipement de sonication requis. La lente lyse peut prendre plus de 24 heures.</td>
			<td>Préparations de la paroi cellulaire de levure.</td>
		</tr><tr><td>Processus d’ébullition et de gel-dégel</td>
			<td>Aucun équipement spécialisé n’était nécessaire autre qu’un congélateur standard et un bloc chauffant ou un bain d’eau chaude.</td>
			<td>Efficace, reproductible, simple et peu coûteux.</td>
			<td>La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules.</td>
			<td>Analyses ADN par PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Comparaison des méthodes disponibles pour la préparation des extraits de levure.
Le cryogrinding (aka cryogrinding(broyage cryogénique/fraisage cryogénique) est couramment utilisé pour récupérer les acides nucléiques, les protéines ou les produits chimiques à partir d’échantillons sensibles à la température d’une manière fiable pour des analyses quantitatives ou qualitatives. Il a été utilisé avec succès pour de multiples applications dans divers domaines, y compris la biotechnologie, la toxicologie, la médecinelégale 12,13, les sciences de l’environnement, la biologie végétale14 et les sciences alimentaires. L’isolement des macromolécules biologiques intactes dépend généralement de façon critique de la température. Des températures extrêmement basses garantissent que les protéases et les nucléases restent inactives, ce qui entraîne un isolement fiable des protéines intactes, des acides nucléiques et d’autres macromolécules pour des analyses ultérieures. En effet, un moulin à congélateur maintient généralement une température d’échantillon de -196 °C (le point d’ébullition du LN2),minimisant ainsi la dénaturation et la dégradation de l’ADN/ARN ou des protéines.
L’usine de congélation utilise une chambre de broyage électromagnétique qui déplace rapidement une barre métallique solide ou un cylindre dans un flacon contenant l’échantillon à pulvériser entre les bouchons d’extrémité en acier inoxydable. L’instrument crée et inverse rapidement un champ magnétique dans la chambre de broyage. Au fur et à mesure que le champ magnétique se déplace d’avant en arrière, l’aimant écrase l’échantillon contre les bouchons, réalisant ainsi la « cryogrinding » et la pulvérisation du maïs soufflé. L’usine de congélation remplace le mortier et le pilon et permet le traitement séquentiel de plusieurs échantillons (ou jusqu’à 4 échantillons plus petits simultanément) par une reproduction élevée et évite la variabilité utilisateur-utilisateur associée au broyage manuel. Une fois les échantillons traités, les extraits cellulaires peuvent être utilisés pour une variété d’applications en aval.

<table><tbody><tr><td>Tubes en polycarbonate de 50 mL avec bouchons à vis</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Tubes à centrifuger</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD Biosiences</td><td>211677</td><td>Levure YPD Composant de milieu</td></tr><tr><td>BD Extrait de levure Bacto</td><td>BD Biosiences</td><td>212750</td><td>Levure YPD Composant de média</td></tr><tr><td>Beckman Avanti centrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-Dextrose Anhydre</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td>Levure Composant de milieu YPD</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Rotor à godets oscillants</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée Eppendorf 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Centrifugeuse réfrigérée</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Excluseur de volume et cryoprotecteur</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>HIS6 Anticorps</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>Anticorps pour HIS</td></tr><tr><td>tag KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>Sel pour le maintien de la force ionique</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Inhibiteur de protéasome</td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de la phosphatase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td>Cocktail d’inhibiteurs</td>de</tr><tr><td>protéase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Butyrate de sodium</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Inhibiteur de l’histone désacétylase</td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Inhibiteur de phosphatase</td></tr><tr><td>Vanadate de sodium</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Inhibiteur de la phosphatase</td></tr><tr><td>Sodium &beta ;-glycérophosphate</td><td>Alfa Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Inhibiteur de phosphatase</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 Congélateur</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>6850</td><td>Congélateur</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Résine</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>Pour abattre HIS Protéines étiquetées</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Détergent non ionique</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>Agent réducteur</td></tr></tbody></table>

préparation d’extraits cellulaires par cryogrinding dans un moulin à congélateur automatisé

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

La facilité de la manipulation génétique et la forte conservation évolutive des machines cellulaires eucaryotes dans la levure naissante Saccharomyces cerevisiae en ont fait un organisme modèle génétique prééminent. Toutefois, comme l’isolement efficace des protéines dépend d’une perturbation optimale des cellules, l’utilisation de levure pour l’analyse biochimique des protéines cellulaires est entravée par sa paroi cellulaire qui est coûteuse à digérer enzymatiquement (à l’aide de lyticase ou de zymolyase), et difficile à perturber mécaniquement (à l’aide d’un batteur à perles traditionnel, d’une presse Français ou d’un moulin à café) sans provoquer de chauffage des échantillons, ce qui provoque à son tour la dénaturation et la dégradation des protéines. Bien que le broyage manuel des cellules de levure sous azote liquide (LN2)à l’aide d’un mortier et d’un pilon évite la surchauffe des échantillons, il est à forte intensité de main-d’œuvre et sujet à la variabilité de la lyse cellulaire entre les opérateurs. Pendant de nombreuses années, nous avons été avec succès la préparation d’extraits de levure de haute qualité en utilisant cryogrinding des cellules dans un moulin à congélateur automatisé. La température de -196 °C atteinte avec l’utilisation de LN2 protège le matériel biologique contre la dégradation par les protéases et les nucléases, permettant la récupération de protéines intactes, d’acides nucléiques et d’autres macromolécules. Ici, nous décrivons cette technique en détail pour les cellules de levure en herbe qui consiste d’abord à congeler une suspension des cellules dans un tampon de lyse par son ajout dropwise dans LN2 pour générer des gouttelettes congelées de cellules connues sous le nom de « pop-corn ». Ce maïs soufflé est ensuite pulvérisé sous LN2 dans un moulin à congélateur pour produire un extrait congelé « en poudre » qui est décongelé lentement et clarifié par centrifugation pour enlever les débris insolubles. Les extraits qui en résultent sont prêts pour des applications en aval, telles que la purification des protéines ou des acides nucléiques, les analyses protéomiques ou les études de co-immunoprécipitation. Cette technique est largement applicable pour la préparation de l’extrait cellulaire à partir d’une variété de micro-organismes, tissus végétaux et animaux, spécimens marins, y compris les coraux, ainsi que l’isolement de l’ADN / ARN à partir de spécimens fossiles médico-légaux et pergélisol.

Nous avons comparé deux méthodes différentes pour la lyse cellulaire de levure, à savoir le mouture de perle de verre à 4 °C et une méthode automatisée de cryogrinding à -196 °C, pour évaluer les protéines relatives de récupération dans les extraits cellulaires préparés avec les deux méthodes. Pour cette étude, nous avons choisi d’utiliser une souche de levure en herbe YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi 3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [...

Nous décrivons une méthode fiable pour la préparation d’extraits de cellules entières de levure ou d’autres cellules à l’aide d’un moulin cryogénique qui minimise la dégradation et la dénaturation des protéines. Les extraits cellulaires conviennent à la purification des complexes protéiques fonctionnels, aux analyses protéomiques, aux études de co-immunoprécipitation et à la détection des modifications des protéines labiles.

Préparation d’extraits cellulaires par cryogrinding dans un moulin à congélateur automatisé

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

La levure est l’organisme modèle populaire, non seulement pour les études génétiques, mais aussi pour les études biochimiques des protéines et autres macromolécules extraites de types sauvages et de souches de levure mutante. Cependant, en raison de leurs parois cellulaires dures, un défi majeur auquel les chercheurs sont confrontés est cette lyse efficace des cellules de levure sans endommager la teneur cellulaire. L’isolement des macromolécules biologiques intactes est généralement critique, dépendant de la température.La préparation des extraits à basse température permet de s’assurer que les protéases et nucléases intracellulaires restent inactives, ce qui entraîne un isolement fiable des protéines intactes, des acides nucléiques et d’autres macromolécules pour une lyse suffisante. Diverses méthodes sont disponibles pour obtenir des extraits de levure par la lyse enzymatique, chimique et physique. Cependant la lyse enzymatique est chère en raison de l’exigence des enzymes purifiées pour digérer la paroi cellulaire, limitant ainsi l’utilisation d’un plus petit nombre de cellules.En outre, les réactions enzymatiques doivent être surveillées de près pour empêcher la digestion et la lyse prématurée des cellules. Les méthodes chimiques utilisant de forts agents dénaturants, bien qu’efficaces, entraînent la dénaturation des protéines et, en tant que telles, ne conviennent pas à l’isolement des complexes protéiques ou des enzymes fonctionnelles. Les méthodes physiques, telles que la lyse sous haute pression dans une presse Français peuvent être effectuées dans le froid à quatre Degrés Celsius, mais ce n’est pas assez froid pour prévenir la dégradation et la dénaturation de toutes les protéines indigènes.D’autres méthodes physiques populaires sont l’utilisation d’un mortier et d’un pilon, d’un mélangeur ou d’un moulin à café pour moudre les cellules de levure réutilisées dans un tampon de lyse et congelées sous forme de gouttelettes ou de broyage et de mélange de perles de verre et de levure dans un moulin à batteur de perles de préparation rapide ou une lyse par sonication. Cependant, le broyage manuel est laborieux et le rendement protéique qui en résulte peut varier considérablement selon les techniques employées tandis que la lyse par sonication ou broyage dans un mélangeur, un moulin à café ou un moulin à batteur de perles génère une quantité substantielle de chaleur, ce qui entraîne une dénaturation et une dégradation des protéines. Par conséquent, pour obtenir une lyse cellulaire de levure avec des protéines dans leur état natal avec une dénaturation et une dégradation minimales pour des applications telles que la purification de complexes protéiques fonctionnels, des analyses biochimiques ou la détection de modifications post-translationnelles fugaces, il est essentiel d’utiliser une méthode de lyse facilement évolutive qui minimisera la production de chaleur tout en permettant une lyse efficace quelle que soit la quantité de cellules.Ici, nous décrivons une méthode qui implique l’utilisation d’un moulin cryo congélateur pour la lyse des cellules dans l’azote liquide à moins 196 Celsius pour générer des extraits de cellules congelées permettant ainsi la récupération de macromolécules fonctionnelles intactes, telles que les protéines ou l’ADN et l’ARN, à des températures très basses qui minimise la dénaturation et la dégradation. Cette méthode peut être facilement adaptée pour une utilisation avec n’importe quel type d’échantillon de cellules ou de tissus de n’importe quelle espèce, y compris des échantillons médico-légaux et même anciens récupérés dans des sites archéologiques ou trouvés congelés dans le pergélisol. L’usine de congélation utilise une chambre de broyage électromagnétique supraconductrice qui déplace rapidement une barre métallique solide d’avant en arrière dans un fichier en polycarbonate contenant l’échantillon à pulvériser entre les bouchons d’extrémité en acier inoxydable.Cette méthode de lyse cellulaire physique permet une lyse plus efficace et se traduit reproductiblement par un extrait de meilleure qualité. Les cellules de levure ont été cultivées à une concentration de 10 millions de cellules par mil. Ces cellules de levure ont été placées avant la bouteille réfrigérée de centrifugeuse et ont été filées pendant 10 minutes à 2,400 G.Une fois la rotation est complète, décantant le supernatant sans déranger les cellules granulées.Cette pastille a été résuspendée dans une petite quantité d’eau glacée froide, soit environ la moitié du volume initial de la culture pour laver les cellules. Les cellules résuspendées ont de nouveau été filées pendant encore 10 minutes à 2400 G.Une fois le tour suivant terminé, nous, encore une fois, décantons tout le supernatant sans déranger la pastille. Cette pastille sera ensuite réutilisée et 15 ML de tampon de lyse glacée.Assurez-vous que la pastille est complètement résuspendée. Les cellules résuspendées doivent rester sur la glace dans un tube prédémenté jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’étape suivante. Portez toujours de l’équipement de protection individuelle lorsque vous manipulez de l’azote liquide, comme des lunettes de sécurité, une protection des mains et des manteaux de laboratoire.Pour maximiser notre dextérité, nous portons souvent une paire de gants thermiques blancs pris en sandwich entre deux paires de gants de nitrile. Changez fréquemment les gants extérieurs et nitrile, car ils se déchirent facilement après avoir été exposés à de l’azote liquide. Dans notre laboratoire, nous transférons un aliquot d’azote liquide dans un petit récipient d’azote liquide de cinq litres.L’azote liquide est ensuite versé dans un tube de 50 ML qui a été pré-refroidi sur de la glace sèche. Une fois que le tube de 50 ML est plein d’azote liquide, nous ajoutons l’extrait de levure lentement, d’une manière goutte sage au tube par incréments de 1,5 millilitre. Pour minimiser la formation de grosses pastilles de maïs soufflé, la suspension de levure est ajoutée dans un mouvement circulaire.Pour empêcher davantage la formation de grosses pastilles de maïs soufflé, nous utilisons de gros forceps pour nous assurer que toutes les granulés ont entre 0,3 et 0,5 centimètre de diamètre. Puisque l’azote liquide s’évapore toujours, assurez-vous de remplir le tube avec de l’azote liquide avant d’ajouter chaque aliquot de 1,5 mil de suspension de levure. Une fois que toute la suspension de levure a été transformée en maïs soufflé permettre au tube avec du maïs soufflé de s’asseoir sans couvercle pendant deux à trois minutes pour laisser tout l’azote liquide résiduel s’évaporer.Pour être sûr que tout l’azote liquide s’est évaporé, fermez le couvercle presque complètement et secouez doucement. S’il y a un bruit de sing, il indique que l’azote liquide ne s’est pas encore complètement évaporé. Ouvrez le couvercle pendant une minute environ pour permettre au reste de l’azote liquide de s’évaporer avant de fermer le couvercle hermétiquement.Le liquide résiduel dans le tube peut provoquer une explosion si le couvercle est fermé prématurément. Ce maïs soufflé levure peut être stocké presque indéfiniment en moins 80 degrés C.Pour au moins cinq échantillons, assurez-vous que vous avez 30 à 35 litres d’azote liquide disponibles. Remplissez l’usine de congélation jusqu’à la pleine ligne et fermez le couvercle pour permettre au moulin à congélateur de se refroidir pendant quelques minutes.Encore une fois, n’oubliez pas de porter de l’équipement de protection individuelle lorsqu’il s’agit d’azote liquide. Les flacons de broyage en polycarbonate, les bouchons d’extrémité en acier inoxydable et la barre d’impacteur doivent être pré-réfrigérés avec de l’azote liquide. Gardez ces composants immergés jusqu’à ce que l’azote liquide cesse de bouillonner.N’oubliez pas de conserver tous les échantillons de maïs soufflé sur la glace sèche jusqu’à ce que tout le processus de broyage soit terminé. Retirez tout l’azote liquide des flacons de broyage et transférez votre maïs soufflé dans le flacon. N’oubliez pas de placer une barre d’impacteur magnétique dans le flacon de broyage ainsi.Sceller le flacon de broyage en plaçant soigneusement le bouchon en acier inoxydable uniformément à l’extrémité du flacon de broyage. Nous frappons chaque extrémité du flacon de broyage sur un panneau de pain en bois avec une vibration absorbant le support en caoutchouc pour s’assurer que les bouchons d’extrémité sont placés correctement et scellent les flacons de broyage étroitement. Il est important de fixer les bouchons d’extrémité pour s’assurer qu’ils ne se détachent pas et permettent aux échantillons de se déverser dans l’usine de congélation pendant le processus de broyage.Placer un flacon de broyage dans la chambre de broyage du moulin à congélateur et verrouiller en place. Fermer le couvercle du congélateur et moudre l’échantillon pendant trois cycles à deux minutes par cycle, à un taux de concassage de 14. Une fois les cycles de broyage terminés, déverrouillez le flacon avec le lysate de la cellule de poudre congelée.Pour éviter que le lysate ne dégele, travaillez rapidement et soigneusement pour dévissez l’une des prises d’extrémité à l’aide de l’outil d’ouverture. Une fois le flacon ouvert, retirer la barre d’impacteur et transférer rapidement l’extrait de poudre congelé sur un plat de pesage en plastique pré-réfrigéré. Récupérer autant d’extrait congelé que possible en tapant le flacon sur la planche à pain en bois.Une fois que toute la poudre est retirée du flacon, transférez rapidement tous les extraits de poudre dans un tube pré-étiqueté de 15 mil maintenu sur de la glace sèche. Bien qu’il soit préférable de procéder à la décongélation et à l’utilisation des extraits immédiatement pour minimiser la dégradation des protéines, le lysate de poudre congelé peut être stocké pendant la nuit à moins 80, si nécessaire. Décongeler lentement la poudre dans une boue de glace qui circule en continu à l’aide d’une barre magnétique dans un seau à glace.Pour faciliter même le dégel, enlever la glace qui se développe fréquemment à l’extérieur des tubes, environ toutes les cinq minutes environ. Une fois que les extraits commencent à décongeler au cocktail inhibiteur de la protéase 1X et 10 inhibiteurs protéasome micromolaire MG132 pour prévenir la dégradation des protéines. Une fois que les échantillons sont complètement décongelés, ce qui peut prendre plus d’une heure, faites tourner les échantillons à 3 220 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Cette vrille enlèvera la plupart des débris cellulaires du lysate. Lorsque la vrille est terminée, transférer le supernatant dans des bouteilles en polycarbonate qui ont été préalablement refroidies sur la glace et jeter la pastille. Centrifugeuse le supernate et les échantillons à 16 000 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour clarifier l’extrait.Une fois la rotation terminée, récupérez seulement le supernatant clair soigneusement à partir du milieu de la colonne liquide sans perturber la couche nuageuse contenant la pièce sur le dessus ou les débris granulés au fond du tube de centrifugeuse. Transférer le lysate clair dans un tube frais pré-refroidi de 15 Mil. Le liquide nuageux restant peut être recentrifugé pendant cinq minutes à la même vitesse pour permettre la récupération d’un peu plus de lysate de gros.Les extraits sont maintenant prêts à être utilisés dans des expériences, telles que la purification des complexes protéiques et l’immunoprécipitation. Nous avons comparé deux méthodes différentes de lyse cellulaire de levure, à savoir le broyage de perles de verre à quatre Degrés Celsius et une méthode automatisée de broyage cryo à moins 196 Degrés Celsius pour évaluer les protéines et extraits de cellules relativement récupérés préparés avec les deux méthodes. De cette étude, nous avons choisi d’utiliser une souche de levure en herbe portant un plasmide haute copie exprimant un tandem HIS-MYC marqué ubiquitine.Ainsi nous pouvons évaluer l’affinité de la récupération des protéines polyubiquitinées étiquetées des extraits en gros, suivant la purification d’affinité utilisant talon cobalt SES perles d’affinité d’étiquette suivies du ballonnement occidental avec un anticorps mononnal d’étiquette de HIS. Les protéines polyubiquitines qui sont normalement de très courte durée en raison de leur dégradation rapide par les machines protéasome ubiquitine et offrent ainsi un très bon moyen de comparer la qualité des extraits de gros préparés par différentes méthodes. Comme nous le voyons par la moitié droite de la membrane tachée ponceau, nous avons récupéré un rendement total plus élevé en protéines dans les extraits de gros préparés par le protocole de l’usine de congélation cryo tel que jugé par la coloration ponceau plus intensive dans toute la voie d’extraction de gros.Ceci est particulièrement clair dans les parties inférieures et supérieures de l’usine de congélation extraits entiers voies. En outre, comme le montre la moitié droite de la tache occidentale his tag, nous avons observé une meilleure récupération de la protéine ubiquitinated tag HIS-MYC suivie d’un retrait à l’aide de perles Talon à partir des extraits de gros préparés par broyage cryogénique. Nous concluons que le moulin cryogénique de congélateur est supérieur à d’autres méthodes pour la préparation des extraits de cellules, particulièrement quand les macromolécules fonctionnelles sont exigées pour l’application en aval.

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