Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

L’isolement rapide des tissus du SNC, y compris les méninges, permet une analyse complète du phénotype, de la fonction et de la localisation des cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques et pathogènes. Les deux méthodes démontrées permettent l’extraction rapide des tissus du SNC avec les méninges, ce qui est idéal pour l’analyse en aval à l’aide de techniques unicellulaires et de méthodes histologiques. Bien que les résultats représentatifs se concentrent sur l’analyse des cellules immunitaires, ces deux méthodes peuvent être utilisées pour analyser les cellules résidentes du SNC, y compris les microglies, les astrocytes, les péricytes, les cellules endothéliales, les cellules stromales et les neurones.

Commencez par isoler des échantillons de cerveau et de moelle épinière de souris euthanasiées. Après avoir retiré la tête, faites une incision médiane dans la peau et retournez-la sur les yeux pour libérer le crâne. Coupez l’os du nez pour libérer la mandibule du crâne.

Retirez ensuite la mandibule, la langue et les yeux. Coupez le long des côtés du crâne pour libérer le tissu le long du méat auditif externe et coupez-le. Pour prélever l’échantillon de moelle épinière, séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale avec des ciseaux tranchants.

Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale, puis coupez et retirez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres. Lors de la décalcification, vérifiez quotidiennement l’os pour déterminer s’il est mou et souple. Retirez le tissu de la solution EDTA à l’aide d’une pince, placez-le sur une boîte de Pétri et testez doucement la mollesse de l’os avec une aiguille de calibre 25.

Si l’aiguille pénètre facilement dans l’os, le processus de décalcification est terminé. Pour extraire la calotte crânienne dans le cerveau, faites une incision médiane dans la peau et retournez la peau sur les yeux. Placez les ciseaux à l’intérieur du foramen magna et commencez à couper le crâne latéralement le long des cortex vers le bulbe olfactif, en gardant les incisions au-dessus du méat auditif externe et de la mandibule.

Effectuez les mêmes coupes du côté opposé avec les coupes se rejoignant au bulbe olfactif pour libérer la calotte crânienne du cerveau. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne et placez-la dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu RPMI froid complété par 25 millimolaires HEPES. Placez des pinces incurvées sous la base du cerveau et soulevez-les pour libérer le cerveau de la calotte crânienne.

Extrayez la colonne vertébrale et le tissu de la moelle épinière en coupant parallèlement à la colonne vertébrale pour séparer la cage thoracique de la colonne vertébrale. Faites ensuite une petite incision au niveau de la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale. Coupez et retirez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres.

Ensuite, placez les ciseaux chirurgicaux extra fins dans la colonne vertébrale et coupez le long du bord latéral de la colonne. Coupez complètement le bord latéral opposé pour diviser la colonne vertébrale en une partie antérieure et une partie postérieure. À l’aide d’une pince, retirez lentement et soigneusement la moelle épinière de la colonne vertébrale et placez-la dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres d’IPRP froid avec 25 millimolaires d’HEPES.

Transférez ensuite les parties antérieure et postérieure de la colonne vertébrale dans un autre tube. Pour retirer les méninges de la calotte crânienne, retirez la calotte crânienne du support RPMI et utilisez une pince tranchante pour entailler le bord extérieur. Retirez les méninges du bord de la calotte crânienne, en grattant pour enlever les méninges durales et arachnoïdiennes et placez les méninges sur une boîte de Pétri.

Pour retirer les méninges de la colonne vertébrale, retirez la colonne du support et entaillez les bords de la colonne vertébrale avec une pince tranchante pour libérer les méninges. À l’aide d’une pince incurvée, décollez les méninges du bord des vertèbres et placez les méninges sur une boîte de Pétri. Placez une passoire en maille de nylon dans un tube conique de 50 millilitres.

Pour créer une suspension cellulaire, déplacez les méninges dans une passoire et ajoutez trois millilitres de RPMI supplémenté en HEPES, puis utilisez un piston d’une seringue de cinq millilitres pour broyer le tissu et le média à travers la passoire. Versez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le support dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et utilisez une pince pour déplacer le tissu vers le bas. Hachez le tissu cérébral avec une lame de rasoir stérile et rassemblez le tissu au bas de l’assiette.

Ajoutez trois millilitres de RPMI complété par 10 % de FCS dans la boîte de Pétri, puis utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour remettre le tissu en suspension dans le milieu et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez la collagénase de type 1 et la DNase 1 au tissu et incubez les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Retournez les tubes toutes les 15 minutes pour bien mélanger le tissu avec les enzymes.

Après l’incubation, ajoutez de l’EDTA dans chaque tube pour une concentration finale de 0,01 molaire et incubez les tubes pendant cinq minutes supplémentaires pour inactiver la collagénase. Ajoutez neuf millilitres de RPMI complété par 10 % de FCS dans chaque tube, puis centrifugez les tubes à 450 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille cellulaire.

Ajoutez trois millilitres de solution de gradient de densité isotonique à 100 % dans la pastille de cellule, puis ajoutez un média RPMI 10 % FCS supplémentaire pour porter le volume final à 10 millilitres et remettez la pastille en suspension. Retournez et mélangez bien le tube, puis insérez une pipette sérologique avec un millilitre de solution à gradient de densité isotonique à 70 % dans le fond du tube. Sous-couche lentement la solution, en faisant attention de ne pas faire de bulles.

Retirez la pipette sérologique du tube en veillant à ne pas perturber le gradient. Centrifugez le tube à 800 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirez le surnageant, y compris la couche de débris de myéline, jusqu’à ce qu’il reste deux à trois millilitres dans le tube. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, prélevez la couche cellulaire entre le gradient de densité de 30 % et de 70 %, puis transférez-la dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Ajoutez un média RPMI 10 % FCS pour porter le volume final à 15 millilitres, puis centrifugez les cellules à 450 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ce protocole a été utilisé pour évaluer les lymphocytes B et T dans les méninges, le cerveau et la moelle épinière au cours de la sclérose en plaques progressive. Le gate a été effectué pour distinguer les cellules immunitaires infiltrantes dérivées périphériques CD45 élevées des neurones, astrocytes et oligodendrocytes CD45 faiblement microgliaux et CD45 négatifs.

Peu de cellules CD45 élevées étaient présentes dans la moelle épinière et le tissu cérébral des souris traitées de manière simulée. Le même seuil de déclenchement pour l’expression élevée de CD45 a été utilisé dans les méninges pour identifier les cellules immunitaires élevées en CD45 et exclure les cellules non immunes. Dans tous les tissus du SNC TMEV-IDD, des pourcentages accrus de cellules immunitaires élevées en CD45 ont été observés par rapport aux souris placebo.

Au cours d’une MID-TMEV chronique, le pourcentage de lymphocytes B parmi les cellules immunitaires supérieures CD45 dans le cerveau et la moelle épinière était plus élevé que dans le compartiment méningé. Des cerveaux et des moelles épinières décalcifiés ont été imagés pour identifier la localisation des lymphocytes B et T dans le compartiment du SNC. L’extraction conventionnelle du cerveau de la calotte crânienne a permis d’obtenir une couche pia intacte, mais les couches méningées restantes ont été exclues.

Dans les cerveaux et les moelles épinières décalcifiés, toutes les couches méningées étaient intactes. Les lymphocytes B et les lymphocytes T ont été localisés avec l’expression d’IgG et de CD3, respectivement. La cocoloration des IgG avec ER-TR7 a révélé que les lymphocytes B étaient présents dans le parenchyme du SNC et les méninges, tandis que les agrégats cellulaires dans les méninges ER-TR7 positifs contenaient plusieurs lymphocytes B IgG positifs et lymphocytes T CD3 positifs.

Une étape critique de ces protocoles est l’extraction soigneuse des tissus du SNC, essentielle pour améliorer la pureté des suspensions unicellulaires et pour obtenir des tissus histologiques avec une morphologie de haute qualité. Les techniques décrites permettent une analyse complète des cellules occupant le compartiment du SNC, ce qui est idéal pour examiner le phénotype, la fonction et la localisation des cellules dans le cadre de l’homéostasie et pendant la pathogenèse de la maladie.