Name: Modélisation des maladies neurodégénératives associées à l’âge à Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez des méthodologies pour étudier les maladies neurodégénératives liées à l'âge chez Caenorhabditis elegans. Ces techniques permettent d'analyser la nécrose induite par hyperactivation des canaux ioniques et la neurotoxicité par agrégats protéiques.

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Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.

1. Mort de cellules nécrotiques induites par des canaux ions hyperactifs
NOTE : Les mutations de gain-de-fonction dans la famille de gènes des degenerines, y compris le mec-4 et le dég-3 entre autres, ont comme résultats dans la génération de canaux ioniques hyperactifs déclenchant la mort des cellules nécrotiques de six neurones récepteurs tactiles requis pour la mécanosensation chez les vers3. La nécrose induite par la stimulation aberrante des dégénérines présente plusieurs similitudes mécanistes et morphologiques à l’excitotoxicité chez les mammifères. Le maintien du métabolisme énergétique et de l’homéostasie du calcium a un rôle crucial sur la survie neuronale pendant la nécrose11. Les souches suivantes peuvent être utilisées pour surveiller la mort des cellules nécrotiques déclenchées par des canaux ioniques hyperactifs, mec-4(u231)X et deg-3(u662)V.
<ol><li>Entretien, synchronisation et préparation des vers mutants pour l’examen de la mort des cellules nécrotiques<ol>
<li>Jour 1 : Choisissez des larves L4 de mec-4(u231) ou deg-3(u662) de nématodes mutants sur les médias de croissance de Nématode (NGM; Tableau 1) plaques ensemencées avec Escherichia coli (OP50) à l’aide d’un stéréomicroscope disséquant.</li>
		<li>Placer 10 nématodes L4 par plaque NGM ensemencée et les cultiver à la température standard de 20 °C.</li>
		<li>Jour 5 : Laver les plaques avec 1 ml de tampon M9 (tableau 1) et recueillir les animaux dans un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s et retirer le supernatant.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de solution de blanchiment (7 mL de H2O, 1 mL de 5 N NaOH et 2 mL d’eau de Javel). REMARQUE : La solution de blanchiment perd peu à peu son efficacité; par conséquent, il doit être préparé tous les jours.</li>
		<li>Vortex et surveiller périodiquement jusqu’à ce que les vers se soient dissous. REMARQUE : Évitez le blanchiment pendant des périodes de plus de 5 min parce que la viabilité des embryons sera affectée.</li>
		<li>Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s et retirer le supernatant.</li>
		<li>Laver deux fois le granulé (oeufs) avec 1 mL de tampon M9.</li>
		<li>Après le lavage, resuspendez les œufs dans 200 μL de tampon M9 et incuber pendant 25 min à 34 °C dans un bain d’eau.</li>
		<li>Maintenir un groupe distinct d’échantillons témoins (oeufs) à 20 °C.</li>
		<li>Pipette 100 μL d’œufs témoins ou traités par choc thermique et placez-les sur des plaques NGM non ensemencées. Chaque assiette contient au moins 100-200 œufs.</li>
		<li>Incubé les œufs à 20 °C jusqu’à l’éclosion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le montage des larves de L1 pour examen à l’aide d’un contraste différentiel d’interférence (DIC; Nomarsky) microscopie<ol>
<li>Préparer 2% de coussinets agarose.</li>
		<li>Utilisez 1 mL de tampon M9 pour laver les plaques et recueillir les nématodes des larves de L1 dans des tubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s.</li>
		<li>Retirer le supernatant et conserver le granulé (nématodes).</li>
		<li>Ajouter 100 μL de tampon M9/levamisole de 20 mM pour anesthésier les nématodes. REMARQUE : Évitez l’azide de sodium comme anesthésique. L’azide de sodium déclenche des dommages mitochondriaux et un stress oxydatif conduisant éventuellement à l’induction de la mort cellulaire</li>
		<li>Pipette 10 μL de tampon M9/levamisole contenant des vers L1 et les monter sur des coussinets d’agarose à 2 % (tableau 1).</li>
		<li>Placez délicatement un couvercle sur le dessus de l’échantillon. REMARQUE : Sceller le couvercle avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie.</li>
		<li>Observer les vers à l’aide d’un contraste d’interférence différentielle (DIC; Nomarsky) microscopie.</li>
		<li>Score neurodégénérescence des six neurones récepteurs tactiles en comptant les cellules avec l’apparence vacuolated caractéristique par nématode.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Neurodégénérescence induite par l’agrégat protéique
REMARQUE : Les souches suivantes peuvent être utilisées pour étudier la neurotoxicité induite par les agrégats protéiques : (A) surexpression de l’α-synucléine humaine dans les neurones dopaminergiques, UA44: Est[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] et (B) surexpression de la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) pan-neuronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
<ol><li>Entretien, synchronisation et préparation de nématodes transgéniques pour l’essai de neurodégénérescence<ol>
<li>Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour surveiller le développement et la croissance de C. elegans.</li>
		<li>Jour 1 : Synchronisez la population de nématodes transgéniques en cueillant et en transférant 15 à 20 larves de L4 de chaque souche sur des plaques de NGM fraîchement ensemencées op50. REMARQUE : Utilisez au moins trois plaques de chaque souche par condition.</li>
		<li>Incuber et laisser pousser les nématodes à la température standard de 20 °C.</li>
		<li>Jour 2 : Effectuer des conditions préalables quotidiennes pendant 30 minutes en transférant les plaques dans un incubateur réglé à 34 °C. Ensuite, renvoyez les nématodes préconditionnés à la température standard de 20 °C. REMARQUE : Différents milieux génétiques peuvent être sensibles à la température élevée pendant de longues périodes d’exposition.</li>
		<li>(A) Si l’étude de la surexpression de l’homme α-synucléine dans les neurones dopaminergiques, UA44: Est[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: le jour 9, surveiller 7 jours-vieux nématodes transgéniques pour la mort des cellules neuronales dopaminergiques.</li>
		<li>(B) Si l’étude de la surexpression de la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) pan-neuronalally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: le jour 5, mesurer les agrégats neuronaux PolyQ dans la région de la tête des animaux transgéniques 4 jours exprimant Q40::YFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montage des échantillons pour examen microscopique<ol>
<li>Préparer 2% de coussinets agarose (Tableau 1).</li>
		<li>Ajouter 10 μL de 20 mM M9/levamisole goutte tampon au centre de la garniture agarose.</li>
		<li>Choisissez les nématodes transgéniques respectifs et transférez-les dans une goutte de M9/levamisole. REMARQUE : Placez 20 à 30 nématodes par goutte.</li>
		<li>Placez délicatement un couvercle sur le dessus de l’échantillon. REMARQUE : Sceller le couvercle avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie.</li>
		<li>Procéder à l’examen microscopique des échantillons respectifs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processus d’acquisition et analyse de données des nématodes transgéniques co-exprimant la GFP α-synucléine et cytosolique dans les neurones dopaminergiques<ol>
<li>Utilisez un microscope à épifluorescence combiné à une caméra (p. ex., EVOS FL Auto 2).</li>
		<li>Détecter et capturer des images z-stack de la région de la tête à grossissement 20x.</li>
		<li>Enregistrez et collectez les images de projection d’intensité maximale.</li>
		<li>Procédez à l’analyse des images acquises.</li>
		<li>Examiner les vers transgéniques pour la neurodégénérescence en marquant les caractéristiques cellulaires suivantes, (i) la perte de fluorescence des neurones exprimant GFP sous le promoteur de dat-1, (ii) neurones montrant le bêlement soma et/ou axonal, les excroissances ou la perte dendritique.</li>
		<li>Importer et analyser les données à l’aide d’un logiciel (p. ex., Excel).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Processus d’acquisition et analyse de données des nématodes transgéniques exprimant le PolyQ40 pan-neuronal fusionné avec YFP
<ol><li>Utilisez un microscope à épifluorescence combiné à une caméra (p. ex., EVOS FL Auto 2).</li>
	<li>Détecter et capturer des images z-stack de la région de la tête à grossissement 20x.</li>
	<li>Enregistrez et collectez les images de projection d’intensité maximale.</li>
	<li>Procéder à l’analyse des images acquises à l’aide du logiciel Fidji.</li>
	<li>Images ouvertes avec fidji programme14.</li>
	<li>Sélectionnez Commande Split Channels via le menu déroulant Image et Couleur. REMARQUE : Conservez l’image du canal vert.</li>
	<li>Utilisez l’outil de sélection à main levée pour définir manuellement la région fluorescente d’intérêt (ROI, p. ex., tête).</li>
	<li>Ajoutez le roi respectif dans le gestionnaire de retour sur investissement via le menu déroulant Analyser et outils.</li>
	<li>Soustrayez l’arrière-plan à 50 % en sélectionnant Processus et Soustraire l’arrière-plan.</li>
	<li>Configurer et appliquer des valeurs de seuil via la commande de menu Image | Ajuster | Seuil. Conservez et définissez les mêmes valeurs de seuil tout au long de l’analyse d’image de l’ensemble de l’expérience.</li>
	<li>Sélectionnez le ROI respectif dans le Gestionnaire de retour sur investissement.</li>
	<li>Analyser le nombre d’agrégats de protéines à l’aide de la commande de menu Analyser et analyser les particules.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.5-3.12 pour chaque image acquise.</li>
	<li>Copiez les valeurs d’affichage de la fenêtre Résultats séparé.</li>
	<li>Collez/importez et analysez les résultats à l’aide d’un package logiciel.</li>
</ol>4. Analyse statistique du rapport
<ol><li>Utilisez au moins 30 nématodes pour chaque condition expérimentale. Effectuer trois répliques biologiques.</li>
	<li>Utiliser un logiciel d’analyse statistique pour effectuer le test t-étudiant(comparaison entre deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique avec p < 0,05 comme significatif.</li>
</ol>

<ol><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+neuronal+necrosis%3A+rogue+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+mechanotransduction%3A+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li>
<li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson%27s+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li>
<li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li>
<li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22BioMolecular+Concepts%22%5BJournal%5D)">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles pour la croissance, la synchronisation et l’examen microscopique de certains modèles polyvalents de C. elegans étudiant la neurodégénérescence âge-dépendante. En particulier, nous évaluons et disséquons les fondements cellulaires et moléculaires de la dégradation neuronale liée à l’âge en utilisant la nécrose induite par le canal d’ions hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines1,</sup...

Au cours des deux dernières décennies, C. elegans a été largement utilisé comme un organisme modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la mort des cellules nécrotiques. C. elegans offre un système nerveux exceptionnellement bien caractérisé et cartographié, une structure corporelle transparente et un répertoire diversifié de méthodes génétiques et d’imagerie pour surveiller la fonction cellulaire in vivo et la survie tout au long du vieillissement. Ainsi, plusieurs modèles génétiques de neurodégénérescence de C. elegans ont déjà été développés pour évaluer la viabilité neuronale. En particulier, les modèles de nématodes bien décrits et utilisés comprennent la nécrose induite par le canal d’ions hyperactif1,2,3 et la mort cellulaire déclenchée par l’agrégation accrue deprotéines 4,5,6,7,8,9,10 et coup de chaleur11,12, entre autres.
L’exposition à court terme aux températures sub létales a conféré une résistance contre la mort des cellules nécrotiques, déclenchée par un stress thermique subséquent à la fois dans les nématodes et les neurones mammifères11. Fait intéressant, le préconditionnement quotidien des nématodes à une température élevée douce protège contre la neurodégénérescence, qui est infligée par divers stimuli, tels que le déséquilibre ionique (p. ex., mec-4(u231) et/ou deg-3(u662)) et l’agrégation de protéines (p. ex., α-synucléine et polyQ40)11,13.
Ici, nous décrivons des méthodologies polyvalentes utilisant C. elegans pour surveiller et évaluer la neurodégénérescence dépendante de l’âge dans des modèles bien établis de maladies humaines, telles que la mort cellulaire déclenchée par l’excitotoxicité, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. En outre, nous soulignons le rôle neuroprotecteur de la condition préalable à la chaleur dans plusieurs modèles de neurodégénérescence. Une combinaison de ces techniques ainsi que des écrans génétiques et/ou pharmacologiques se traduira par l’identification et la caractérisation de nouveaux modulateurs de la mort cellulaire, avec un intérêt thérapeutique potentiel.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>AM101 : rmsIs110[prgef-1Q40 ::YFP]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium déshydraté (CaCl2 ?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>SERVA Électrophorèse</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>deg-3(u662)V ou deg-3(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Maintenir les animaux à 20 &deg ; Microscope C</td></tr><tr><td>DIC (Nomarsky)</td><td>Stéréomicroscope de dissection Zeiss</td><td></td><td>Axio Vert A1</td></tr><tr><td></td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>EVOS Cell Imaging Systems</td></tr><tr><td>em/em<> OP50 souche</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Petri paraboles (60 mm x 15 mm)</td><td>Logiciel d’analyse d’images Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fidji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>mec-4(u231)X ou mec-4(d)Centre</td> <td>de Génétique Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td>Maintenir les animaux à 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Lames de microscope (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope (18 mm x 18 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>01 010 30</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Progiciel Excel</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,586</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des nématodes (NGM) plaques</td><td></td><td></td><td></td>gélosées</tr><tr><td>Solution mère de nystatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td><td></td>phosphate</tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>Équipement standard pour la préparation des plaques de gélose ( autoclave, boîtes de Pétri, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement standard pour l’entretien des vers (pic à fil de platine, incubateurs, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>logiciel d’analyse statistique</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, États-Unis</td><td></td><td>Progiciel GraphPad Prism</td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UA44 : Is[baIn1 ; pdat-1&alpha ;-syn, pdat-1GFP]</td><td></td><td></td><td>Sur demande : G. Caldwell (Université de l’Alabama, Tuscaloosa, Alabama)</td></tr></tbody></table>

modélisation des maladies neurodégénératives associées à l’âge à caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Lutter contre les pathologies neurodégénératives humaines et gérer leur impact socio-économique omniprésent devient une priorité mondiale. Malgré leurs effets néfastes sur la qualité de la vie humaine et le système de santé, la majorité des troubles neurodégénératifs humains restent incurables et non évitables. Par conséquent, le développement de nouvelles interventions thérapeutiques contre de telles maladies devient une urgence urgente. La détérioration des circuits et de la fonction neuronales associé à l’âge est conservée évolutionnellement dans des organismes aussi divers que le ver faible Caenorhabditis elegans et les humains, ce qui signifie des similitudes dans les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. C. elegans est un modèle génétique hautement malléable, qui offre un système nerveux bien caractérisé, la transparence du corps et un répertoire diversifié de techniques génétiques et d’imagerie pour évaluer l’activité neuronale et le contrôle de la qualité pendant le vieillissement. Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal d’ion hyperactivé (p. ex., deg-3(d) et le mec-4(d)) et l’agrégat protéique (p. ex., la nécrose induite par la α-syuncleine et le poly-glutamate) pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de la rupture neuronale liée à l’âge. Une combinaison de ces modèles de neurodégénérescence animale, ainsi que des écrans génétiques et pharmacologiques pour les modulateurs de la mort cellulaire, permettra de comprendre sans précédent la dégradation de la fonction neuronale liée à l’âge et fournira des informations critiques ayant une grande pertinence pour la santé humaine et la qualité de vie.

Mort cellulaire nécrotique induite par des canaux ions hyperactifs À l’aide des procédures présentées ici, les embryons mutants mec-4(u231) et deg-3u662) ont été incubés pendant 25 min à 34 °C ou conservés à la température normale de 20 °C. Lors de l’éclosion, le nombre de cadavres de cellules neuronales a été déterminé au stade larvaire L1 des deux groupes. La mort des cellules nécrotiques est diminuée chez les nématodes qui ont éclos à partir d’œufs sous-titrés par choc thermique (...

Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal ione hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines, pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires des maladies neurodégénératives associées à l’âge.

Modélisation des maladies neurodégénératives associées à l’âge à Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Au cours des dernières décennies, la durée de vie humaine est prolongée, en raison de l’amélioration du niveau de vie et des progrès de la science médicale. L’âge est le plus grand facteur de risque pour de nombreuses maladies potentiellement mortelles, y compris les troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Ici, nous démontrons des méthodologies utilisant quelques nouveaux modèles polyvalents de méthode, y compris la nécrose induite par le canal ionique hyper-actif et les agrégats de protéine induit la neurotoxicité, pour surveiller et disséquer le mécanisme moléculaire cellulaire de la dégénérescence neurale.Pic larves en bonne santé de faire quatre et faire trois nématodes Newton sur la plaque de croissance des nématodes des médias, tamisage avec E.Coli à l’aide de disséquer microscope stéréo. Placez dix et quatre nématodes, plaque d’enzymes parasites et cultivez-les à la température standard, de 20 degrés Celsius. Cinq jours plus tard, laver la plaque avec 1 mL et 9 tampon et recueillir les animaux dans un tube de 1,5 mL.Centrifugeuse à 30 000 g pendant 30 secondes et enlever le supernatant. Ajouter 0,5 mL de solution de placage. La solution de placage est stockée à température ambiante.Vortex et surveiller périodiquement jusqu’à ce qu’ils aient tous dissous. Évitez le placage pendant des périodes de plus de cinq minutes. Centrifugeuse à 10 000 g pendant 30 secondes et enlever le supernatant.Laver deux fois la palette avec 1 mL et neuf tampons. Centrifugeuse à 10000 g pendant 30 secondes et enlever le supernatant. Après le lavage, resuspendre les œufs dans 200 microlitres M9 tampon et les incuber pendant 25 minutes, à 34 degrés Celsius dans un bain d’eau.Maintenir un groupe distinct d’œufs à 20 degrés Celsius. Pipette 100 microlitres contenant des œufs traités au contrôle ou au choc thermique et les placer sur une plaque 10 GN non enseillée. Chaque assiette contient au moins 100 à 200 œufs.Incuber les œufs à 20 degrés Celsius jusqu’à l’éclosion. Utiliser et tampon M9 pour laver les plaques et recueillir la vie L1 et les nématodes dans un tube de 1,5 ml. Centrifugeuse à 10 000 g pendant 30 secondes.Retirer le surnatant et garder la palette. Ajouter 100 microlitres de tampon levangial M9 de 20 millimillons pour anesthésier les nématodes. Pipette 10 microlitres de tampon levangial M9, contenant la montre L1 et les monter dans 2%agar-ls spot placer doucement un coverslip sur le dessus de l’échantillon.Observez la montre à l’aide de la microscopie DIC. Dégénérescence de balayage des 630 neurones récepteurs en comptant des cellules avec une apparence assistée virtuelle caractéristique de ce nématode. Synchroniser les nématodes en sélectionnant et en transférant 15 à 20 larves de L4 de chacune sous pression sur d’abord les plaques C puis GM.Incuber et laisser les nématodes se développer à la température standard de 20 degrés Celsius. Effectuez le préconditionnement quotidien pendant 30 minutes en transférant les plaques dans un incubateur fixé à 34 degrés Celsius. Retournez ensuite les nématodes conditionnés à la température standard de 20 degrés Celsius.Ajouter 10 microlitres de 20 millimaux M9 goutte tampon levangial au centre de l’agar-ls spot. Choisissez les nématodes transgéniques respectifs et transférez-les dans la goutte levangiale M9. Placer 20 à 30 nématodes par goutte.Déposer délicatement le slip sur le dessus de l’échantillon. Sceller le bordereau de couverture avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie. À l’aide d’un microscope à fluorescence combiné à une caméra, détectez et capturez vos images d’étude de la région de la tête à 20 x grossissement.Surveillez sept jours de nématodes transgéniques pour la mort des cellules neuronales dopaminergiques. Mesurer les agrégats neuronaux policul dans la région de la tête des animaux transgéniques de quatre jours exprimant 240 fusion avec des personnes vivantes. La mort des cellules nécrotiques induite par un canal iion hyperactif est le plus important dans les nématodes qui a d’anciens oeufs de précondition de choc thermique.Préconditionnement de choc thermique, favorisant une prévision contre la mort cellulaire induite par l’alpha-synucléine dans l’hermaphrodite adulte de sept jours et diminue les agrégats de protéine de Q40 dans la région de tête des adultes âgés de quatre jours. Le vieillissement est une conséquence des dommages causés par la dégénérescence progressive de l’homéostasie cellulaire et tissulaire. Ainsi, la compréhension de la manipulation de la rupture neuronale liée à l’âge sont les priorités des premières places.Les techniques présentées combinées avec la génétique et les écrans pharmacologiques pourraient mener à une notification des modulateurs normaux de mort cellulaire avec l’intérêt thérapeutique potentiel.

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Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

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Interview: repliement des protéines et des études de maladies neurodégénératives

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

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