Name: Formation circadienne de Drosophila Melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Apprenez à synchroniser Drosophila melanogaster pour étudier les rythmes circadiens et la chronobiologie. Cette méthode utilise l'immunoblotting et l'immunofluorescence pour valider l'entraînement et explorer les effets de l'horloge biologique sur la santé.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Un grand merci à l’Université du Missouri-Kansas City et au laboratoire Jeffrey L. Price.

1. Production alimentaire à la mouche
<ol><li>Par 1 L d’eau, préparer des aliments à la mouche composé de 4,69 g de mélasse séchée, 19,70 g de levure active sèche, 87,22 g de farine de maïs et 7,83 g d’agar.</li>
	<li>Mélanger le contenu indiqué ci-dessus dans une marmite et tourner la chaleur à 250 °F. Bien mélanger et ajouter les ingrédients.</li>
	<li>Gardez le couvercle sur la marmite pendant que la nourriture à mouche chauffe tout en mélangeant le contenu toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’il atteigne une ébullition de roulement. Laisser l’ébullition de roulement se poursuivre pendant 20 min avant d’éteindre le feu.</li>
	<li>Ajouter 83,60 mL d’eau et garder le couvercle de la marmite au loin pendant que les aliments refroidissent.</li>
	<li>Mélanger et enregistrer la température des aliments toutes les 10 minutes à l’aide d’un thermomètre en verre. Évitez de laisser une couche de film s’installer sur la nourriture.</li>
	<li>Une fois que les aliments ont refroidi à 60 °C, ajouter 10,44 mL de Tegosept et 5,51 mL d’acide propionique par litre d’eau ajoutée (voir étape 1.1).</li>
	<li>Bien mélanger et faire chauffer jusqu’à 60 °C pour éviter que les aliments ne deviennent trop frais.</li>
	<li>Pomper la nourriture mouche au besoin à l’aide de la Droso-remplissage.</li>
	<li>Pour les flacons étroits, pompez 10 ml et pour 6 oz bouteilles de fond carré pompe 60 ml.</li>
</ol>2. Collecte des mouches d’âge défini
<ol><li>Surveiller les bouteilles de mouches de type sauvage stockées à 25 °C pendant 5-7 jours jusqu’à ce que de grandes quantités de pupe (environ 200 pupes) soient fixées sur le côté de la bouteille. Les bouteilles utilisées sont 6 oz bouteilles de stock Drosophila avec des fonds carrés.</li>
	<li>Dégagez les adultes existants de la bouteille. Soit faire basculer les adultes dans une nouvelle bouteille ou les placer dans 70% d’éthanol. Utilisez l’extrémité terne d’un pinceau #0 pour pousser les adultes restants dans la nourriture à la mouche. Assurez-vous d’essuyer le pinceau avec 70% d’éthanol avant et après les utilisations.</li>
	<li>Laisser les bouteilles déblayées s’asseoir pendant 3 jours dans un incubateur de 25 °C pour permettre à la prochaine génération d’effacer. Ces mouches auront entre 0 et 3 jours.</li>
</ol>3. Séparation des mouches
<ol><li>Après 3 jours, séparer les mâles des femelles et recueillir le nombre souhaité pour chaque sexe pour chacun des quatre points de temps. Les mouches peuvent être différenciées par le sexe en examinant les organes génitaux; les mâles ont des organes génitaux arrondis foncés tandis que les femelles ont des organes génitaux plus légers et plus pointus. Les femelles sont également beaucoup plus grandes que les mouches mâles.<ol>
<li>Utilisez un tampon d’anesthésie CO2 pour séparer efficacement les mouches et différencier entre les sexes. Déplacez les mouches avec des pinceaux pour éviter de les tuer.</li>
		<li>Recueillir 100 mâles et 100 femelles pour chaque point de temps, avec 50 mâles par flacon et 100 femelles par flacon. Les hommes ont tendance à être plus agressifs et leurs interactions sociales entraînent beaucoup de décès lorsqu’il y a 100 personnes dans une fiole. Les femelles - jusqu’à 100 individus - ne sont pas affectées lorsqu’elles sont contenues dans la fiole.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer les collections aux points d’heure suivants : ZT1, ZT7, ZT13 et ZT19 (Tableau 1). Notez que les collections réalisées dans l’obscurité (ZT12-ZT24) sont sensibles à la lumière tandis que les collections ZT0-ZT11 sont effectuées pendant les heures d’éclairage et les lumières de la pièce peuvent être allumées. Veuillez noter que deux incubateurs distincts sont utilisés avec des motifs de lumière inverses de 12 heures pour permettre à toutes les collections de se produire pendant la journée et non pendant la nuit.</li>
	<li>Utilisez des mouches excédentaires pour créer de nouvelles bouteilles de mouches pour l’entraînement futur. Placer 25 femelles avec 5 à 7 mâles dans chaque nouvelle bouteille et placer dans l’incubateur à 25 °C.</li>
</ol>4. Incubation de mouches
<ol><li>Laissez les mouches rester dans des incubateurs réglementés par la lumière pendant 3-5 jours pour permettre à l’entraînement circadienne de se produire. Assurez-vous que les incubateurs sont étanches à la lumière, car même de petites quantités de pollution lumineuse perturberont l’entraînement.</li>
</ol>5. Fixation de l’immunofluorescence
<ol><li>Après l’entraînement, préparez de nouveaux flacons de solution de fixation pour les échantillons qui seront utilisés pour l’immunofluorescence. Avant d’enlever les mouches de l’incubateur, ajouter 4,8 mL de 4% de formaldéhyde dilué en 1x PBS + 0,1% Tween-20 à chaque nouveau flacon étroit pour chaque 100 mouches qui doivent être fixés. Chaque flacon abritera 100 mâles ou 100 mouches circadiennes femelles. Placez les flacons étroits dans la glace.</li>
</ol>6. Collecte d’immunofluorescence
<ol><li>Lors de la collecte des mouches de l’incubateur pour l’immunofluorescence, retirer le bouchon de la bouteille et inverser rapidement la bouteille dans l’entonnoir. Appuyez doucement sur les mouches dans la solution par l’intermédiaire de l’entonnoir pour aider à guider les mouches dans le flacon; combiner deux tubes des 50 mâles pour un total de 100 mâles dans un flacon et utiliser un seul tube de 100 femelles pour l’autre flacon.</li>
	<li>Exécutez les collections ZT13 et ZT19 dans l’obscurité; utiliser une lumière rouge afin de voir que la drosophila sont beaucoup moins sensibles à ces longueurs d’onde lumineuses et sont donc moins sujettes à la pollution lumineuse13. La protéine cryptochrome, en particulier, est particulièrement sensible à la lumière bleue, qui doit être évitée14.<ol>
<li>Pour réduire l’exposition à la lumière, assurez-vous que la pièce de collecte est étanche à la lumière, toutes les sources de lumière étant bloquées ou couvertes. Enveloppez ces flacons dans du papier d’aluminium de sorte que les mouches ZT13 et ZT19 ne soient pas exposées à la lumière lorsqu’elles sont placées sur le mélangeur à noix à l’étape suivante. Les mouches ZT1 et ZT7 ne sont pas sensibles à la lumière et peuvent être placées sur le mélangeur sans revêtement de papier d’aluminium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Mélangeur et rangement à la noix
<ol><li>Une fois les mouches recueillies, collez le dessus des flacons contenant des produits fixatifs pour éviter les déversements et placez-les sur le mélangeur à 165 tr/min à 4 °C pendant 4 h. Les mouches ne sont plus sensibles à la lumière après cette étape de fixation, de sorte que le papier d’aluminium peut être enlevé pour vérifier que la solution se déplace et les mouches sont submergées dans le fixatif.</li>
	<li>Après avoir enlevé la mouche contenant des flacons du mélangeur à noix retirer le formaldéhyde et laver trois fois avec 3.000 μL de 1x PBS, inverser le flacon à chaque lavage.</li>
	<li>Stockez les flacons portant des échantillons d’immunofluorescence à 4 °C en attendant l’immunofluorescencefuture 15.</li>
</ol>8. Collecte pour l’extraction de protéines
<ol><li>Préparer quatre tubes de 50 mL et un Dewar contenant de l’azote liquide pour la conservation d’échantillons destinés à l’extraction de protéines</li>
	<li>Pour la collecte des mouches pour l’extraction de protéines ou d’acide nucléique, transférer les mouches des bouteilles vers le tube de la même manière qu’à l’étape 6.1 et rapidement plafonner le tube pour empêcher la libération des mouches et placer le tube dans l’azote liquide pour casser le gel.</li>
</ol>9. Stockage pour l’extraction de protéines
<ol><li>Conserver les échantillons congelés pour l’extraction de protéines à -80 °C. Ceux-ci peuvent être traités selon le protocole d’extraction de protéines approprié pour l’analyse en aval, y compris l’immunoblotting16.</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

Les chercheurs utilisent ce protocole d’entraînement avec succès et cohérence. Cette procédure permet la fixation d’une grande réserve d’échantillonnage qui peut être stockée pour une analyse future. En outre, cette stratégie préserve les modèles neurologiques induits par l’entraînement pour l’examen futur.
Fixation pour le stockage est un élément majeur du processus d’entraînement car il aide à stabiliser les tissus cérébraux et il permet plus de temps pour analyser chaque cerveau à partir de la piscine de données réduisant ainsi les déchets des cerveaux qui perdent la viabilité en raison de l’âgede 21. L’objectif principal est d’entraîner le plus grand nombre possible de mouches circadiennes afin qu’il y ait un inventaire continu disponible pour les dissections de la tête et, en fin de compte, l’immunofluorescence ou l’extraction de protéines afin d’observer les résultats et de déterminer si les résultats sont de grande confiance. Pour s’assurer que l’entraînement circadien est préservé par fixation, il est essentiel que toute source de pollution lumineuse soit éliminée. Le processus de fixation permet de stocker Drosophila tout en maintenant son « horodatage » neurologique afin qu’ils puissent être disséqués plus tard et analysés sans différences notables pour les mouches qui sont disséquées et ont subi l’immunofluorescence immédiatement après l’entraînement. Aux fins de la fixation avant l’immunofluorescence, le laboratoire a déterminé avec une consistance que les mouches sont viables au moins jusqu’à 1 mois. Les fixations pour l’extraction de protéines de tache occidentale rendent le cerveau viable indéfiniment lorsqu’ils sont stockés à -80 °C.
Une autre étape critique du protocole est le sexing des mouches. Il est important que cette étape soit faite avec précision car avoir les deux sexes dans le même flacon avant la fixation peut conduire à l’accouplement, ce qui donnera de nouvelles mouches qui sont de plus jeune âge et l’analyse des protéines corrompues si les mâles sont accidentellement examinés au lieu de femelles ou vice versa. En outre, lors du sexing, il est important d’enlever les spécimens de larves qui sont parfois attachés aux femelles. Cela empêche le développement de nouvelles descendants à l’intérieur du flacon féminin qui pourrait potentiellement corrompre les résultats.
La prochaine étape pour le protocole d’entraînement peut être avec les éléments liés à l’analyse des données. L’objectif du protocole est la localisation des protéines, mais s’il y a d’autres variables qui sont touchées par l’entraînement circadien, elles doivent être explorées par de nouvelles avenues, nécessitant souvent l’extraction de protéines ou d’acide nucléique. En outre, il existe d’autres protéines du cerveau qui peuvent encore être analysées via ce protocole. Les expériences associées au protocole ont analysé certaines protéines, mais la liste des gènes et des protéines qui jouent un rôle dans la biologie circadienne n’a pas été épuisée. Le protocole est efficace pour atteindre l’objectif d’établir un rythme circadien, cependant, les applications sont de grande envergure.

Presque tous les organismes sur Terre, du plus grand à unicellulaire, ont une horloge biologique interne avec un cycle d’environ un jour. C’est ce qu’on appelle le rythme circadien (inventé en 1953 par Franz Halberg à partir des termes latins circa = environ / approximativement et « i » = jour)1. Bien que les composants de l’horloge centrale soient connus et que leurs mécanismes rudimentaires de fonction soient conceptualisés, il y a encore beaucoup à comprendre sur la façon dont les rythmes biologiques sont maintenus dans tout le corps. Fait important, la mauvaise régulation des rythmes biologiques est associée à de mauvais résultats pour la santé, y compris une mauvaise formation de la mémoire, troubles du sommeil, trouble affectif saisonnier, dépression, trouble bipolaire, diabète, obésité, neurodégénérescence, et le cancer2,3,4,5.
Drosophila est un modèle bien établi pour l’étude de la biologie circadienne. Génétiquement et biochimiquement maniable, un grand nombre sont facilement entraînés (comme on le verra). En fait, les sept publications citées comme des publications clés de soutien dans l’attribution du prix Nobel pour la découverte de rythmes circadiens ont tiré parti de ces forces du modèle Drosophila6,7,8,9,10,11,12.
En outre, nous montrons des stratégies efficaces pour la collecte des mouches entraînées aux fins de l’immunofluorescence, de l’acide nucléique ou de l’analyse basée sur l’extraction de protéines. À l’aide de ces stratégies, on peut traiter et stocker de plus grandes quantités d’échantillons pour analyse à l’avenir. Ces méthodes sont très avantageuses en ce qu’elles sont reproductibles et peuvent produire des centaines de mouches entraînées qui peuvent faire partie d’un grand pool de données.

<table><tbody><tr><td>Pipette 100-1000uL</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10-100uL</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde Solution</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de connexion de filtre d’anesthésie</td><td>Monde Precision Instruments</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>Semoule de maïs</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>Mélasse séchée</td><td>Food Service Direct</td><td>OT280504</td><td></td></tr><tr><td>Droso-filler Food Pump</td><td>geneseesci.com</td><td>59-169</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Bouteilles de bouillon, fond carré de 6 oz avec Flugs</td><td>geneseesci.com</td><td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de drosophile, K-Resin étroite super bulk</td><td>geneseesci.com</td><td>32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>Levure sèche active</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ Basic Anesthesia System</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes à centrifuger</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes à fond rond</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352057</tr><tr><td>Marqueur Sharpie à pointe fine</td><td>Sharpie</td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mélangeur à dnutation</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>Flugs-Narrow Flacons en plastique</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre en verre</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-08008-12</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau d’azote liquide</td><td>Thermo Scientific</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir d’azote liquide-Dewar</td><td>Cooper Surgical Inc</td><td>900109-1</td><td></td></tr><tr><td>Récipient de transfert d’azote liquide</td><td>Electron Mircoscopy Sciences</td><td>61891-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinceaux (Red Sable) Taille #0</td><td>Electro Microscopy Sciences</td><td>66100-00</td><td>Ceci est utilisé pour séparer les mouches par sexe sans causer de blessures.</td></tr><tr><td>Entonnoir en plastique</td><td>Plews et Edelmann</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lumière polarisante</td><td>Microscope Central</td><td>1100100402241</td><td>Utilisé pour voir plus clairement la drosophile pendant le sexage</td></tr><tr><td>Pointes de pipette ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette ProPette</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>Acide propionique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>Boules de rayonne</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds wrap papier d’aluminium standard</td><td>Agrafes</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>Rôtissoire (mijoteuse)</td><td>Hamilton Beach</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 810 Magic Tape</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>77300</td><td></td></tr><tr><td>Flacon pulvérisateur avec gâchette</td><td>US Plastic</td><td>66446</td><td>Utilisé pour pulvériser de l’éthanol pour nettoyer les zones de travail</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Incubateur de drosophile</td><td>Thermo Scientific</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco Réfrigérateur de laboratoire à 4 degrés</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco Congélateur de laboratoire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504A</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

formation circadienne de drosophila melanogaster

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Presque universels parmi les organismes, les rythmes circadiens coordonnent l’activité biologique à l’orbite terrestre autour du soleil. Pour identifier les facteurs qui créent ce rythme et pour comprendre les extrants qui en résultent, il faut entraîner des organismes modèles vers des délais circadiens définis. Ici, nous détaillons une procédure pour entraîner de nombreux Drosophila à un rythme circadien défini. En outre, nous détaillons les étapes post-entraînement pour préparer des échantillons pour l’immunofluorescence, l’acide nucléique, ou l’analyse basée sur l’extraction de protéines.

L’entraînement circadien contrôlé permet aux chercheurs d’examiner la biologie à des moments précis tout au long de la journée circadienne en utilisant les calendriers ZT1-ZT19 ou d’ajouter des délais au besoin. Ici, nous utilisons la lumière et l’obscurité pour entraîner les mouches aux cycles circadiens et vérifier l’entraînement par immunoblotting et l’analyse de l’immunofluorescence de la protéine d’époque, un marqueur pour l’entraînement circadienne (Figure 1). Dès l’entraînement correct, les protéines de période doivent avoir une intensité caractéristique et un modèle de mobilité (figure 1A)et doivent être visibles à des endroits spécifiques dans le cerveau ZT1 (Figure 1B). Bien que d’autres variables, y compris la nourriture et la température, peuvent influencer l’entraînement circadien, la lumière est la plus simple et fiable pour contrôler17. Aux fins de ces méthodes, les températures de l’incubateur sont maintenues constantes, en s’appuyant sur les neurones de l’horloge cérébrale qui sont influencés par la lumière pour l’entraînement18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg"> Figure 1 : Vérification de l’entraînement. (A) Immunoblotting des extraits de cellules entières préparés à partir de têtes de mouches entraînées montre des modèles canoniques de mobilité protéique d’époque et d’intensité19. 1.4 les têtes femelles de chacun des temps indiqués de Zeitgeber (ZT) ont été analysées utilisant un anticorps anti-Per. (B) Immunofluorescence des cerveaux entraînés recueillis au ZT, où la protéine de période se trouve dans un modèle caractéristique (panneaux inférieurs, recréés à partir de Helfrich-Forster20). Sont montrés des images prises à partir de différentes sections du cerveau, capturant tous les neurones censés contenir des protéines de période à ZT1. La barre d’échelle est de 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ZT1</td>
			<td>ZT7</td>
			<td>ZT13</td>
			<td>ZT19</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lumière entre 10 h et 22 h</td>
			<td>Lumière entre 10 h et 22 h</td>
			<td>Sombre entre 9 h et 21 h</td>
			<td>Sombre entre 9 h et 21 h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recueilli à 11 h après 1 heure en lumière</td>
			<td>Recueilli à 17 h après 7 heures en lumière</td>
			<td>Recueilli à 10 h après 1 heure dans l’obscurité</td>
			<td>Recueilli à 16 heures après 7 heures dans l’obscurité</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : ZT1-ZT19 Calendriers de synchronisation du rythme circadien.

Ici, nous détaillons comment synchroniser Drosophila à un jour circadien. Il s’agit de la première étape, et la plus importante nécessaire pour étudier les rythmes biologiques et la chronobiologie.

Formation circadienne de Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Synchroniser la drosophile pour définir les temps circadiens est la première étape dans l’étude des événements qui contrôlent ou répondent à l’horloge biologique. La synchronisation de tous les modèles suivra la même approche de base. Il y a beaucoup d’étapes pour ce faire pratique et il peut sembler accablant de les mettre tous ensemble.Attendez-vous à essayer quelques fois avant qu’il ne se sente naturel. Gardez les températures stables et je veux que la lumière soit allumée pendant les trois minutes. Préparer les aliments à la mouche dans une crock-pot à 121 degrés Celsius, en mélangeant comme ingrédients sont ajoutés.Couvrir le Crock-Pot et porter le contenu à ébullition, en mélangeant le contenu toutes les 10 minutes. Après 20 minutes à ébullition, éteindre le feu et ajouter 83,6 millilitres d’eau au Crock-Pot. Laissez le couvercle éteint au fur et à mesure que les aliments refroidissent.Pendant que les aliments refroidissent, remuer toutes les 10 minutes pour éviter qu’un film ne se forme sur le dessus. Mesurez également la température toutes les 10 minutes avec un thermomètre en verre. Une fois que la nourriture a refroidi à moins de 60 degrés Celsius, ajouter le Tegosept et l’acide propionique, tel que décrit dans le manuscrit.Bien mélanger et ajuster le Crock-Pot pour maintenir une température, à seulement quelques degrés moins de 60 degrés Celsius. Utilisez une pompe périssaltique pour distribuer la nourriture à la mouche. Pour les flacons étroits, pompez 10 millilitres, et pour six bouteilles carrées de fond d’once, pompez 60 millilitres.Entreposer les mouches sauvages à 25 degrés Celsius pendant 10 à 12 jours, jusqu’à ce qu’environ 200 pupes soient fixées à l’intérieur de la bouteille. Pour retirer les adultes de la bouteille, inclinez-les dans une nouvelle bouteille et utilisez l’extrémité terne d’un pinceau numéro zéro pour pousser les adultes restants. Essuyer le pinceau avec 70 % d’éthanol avant et après l’utilisation.Incuber les nymphes à 25 degrés Celsius pour permettre à la prochaine génération d’émerger. Après trois jours, les mouches auront de zéro à trois jours. N’oubliez pas que la température, la lumière et même votre choix d’aliments influenceront l’entraînement.Assurez-vous de les garder, chaque contrôle au cours de votre expérience. Aux points de collecte désignés, utilisez un tampon d’anesthésie au dioxyde de carbone pour immobiliser les mouches et recueillir 100 mâles et 100 femelles. Les mouches femelles sont beaucoup plus grosses que les mâles.Les mouches peuvent également être différenciées en examinant les organes génitaux. Les mâles ont des organes génitaux arrondis foncés, tandis que les femelles ont des organes génitaux plus légers et plus pointus. Placer les mâles et les femelles dans des flacons séparés avec 100 femelles par flacon et 50 mâles par flacon.Les interactions sociales masculines entraînent de nombreux décès lorsqu’il y a 100 personnes dans un flacon. Pour permettre l’entraînement circadien, placez les flacons dans des incubateurs réglementés par la lumière pendant trois à cinq jours. Pour produire des mouches pour l’entraînement futur, placez 25 des femelles restantes, et cinq à sept des mâles restants dans une nouvelle bouteille.Incuber la bouteille à 25 degrés Celsius. Pour chaque 100 mouches qui seront collectées. Préparer un flacon étroit en ajoutant 4,8 millilitres de fixatif.Placez les flacons étroits dans un seau de glace et emmenez le seau, les serviettes en papier, le papier d’aluminium et le ruban adhésif à l’incubateur. Pour recueillir les mouches, placez un entonnoir dans le flacon étroit, puis retirez le bouchon du flacon de mouches et inversez-le rapidement dans l’entonnoir. Appuyez doucement pour aider à guider les mouches dans le flacon de fixatif.Lors de la collecte des mâles, mélanger deux flacons de 50 mouches dans un flacon étroit. Envelopper les flacons pour ZT13 et ZT19 dans du papier d’aluminium. Après le transfert des mouches, collez les bouchons en place pour éviter les déversements.Placez les flacons sur le mélangeur à noix à 165 rpm, et quatre degrés Celsius, pendant quatre heures. Les mouches ne sont plus sensibles à la lumière, de sorte que le papier d’aluminium peut être enlevé pour vérifier que les mouches sont submergées dans le fixatif. Après avoir retiré les flacons du mélangeur à noix, retirer le formaldéhyde, puis laver les mouches trois fois avec 3000 microlitres de 1X PBS, en inversant le flacon pendant chaque lavage.Conservez les flacons à quatre degrés Celsius, en attendant l’immunofluorescence future. La lumière et l’obscurité ont été utilisées pour entrainer les mouches aux cycles circadiens. L’entrainement a été vérifié par immunoblotting, et l’analyse d’immunofluorescence de la protéine de période, un marqueur pour l’entraînement circadien.L’immunoblotting des extraits entiers de cellules, préparé à partir des têtes des mouches entraînées montre un modèle canonique de mobilité et d’intensité de protéine d’époque. L’immunofluorescence des cerveaux entraînés, recueillie à ZT1, montre des protéines d’époque dans le modèle caractéristique. Cette méthode est un point de départ pour l’immunofluorescence, l’immunoplotting, l’immunoprécipitation, l’analyse comportementale, et toute autre technique que vous pouvez vouloir utiliser pour comparer comment la voie change pendant que l’horloge biologique tourne.Avec la possibilité d’entrainer votre organisme modèle, vous pouvez demander si votre voie préférée change au fil du temps, et si les effets dans votre voie préférée peut conduire à la perturbation de la biologique. Un certain nombre de maladies s’aggravent lorsque l’horloge biologique est perturbée. L’identification des mécanismes sous-jacents nous aidera à créer des médicaments plus efficaces pour les personnes souffrant de maladies, comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.

circadian-entrainment-of-drosophila-melanogaster

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons les procédures d'enregistrement quotidien des rythmes d'activité locomotrice...

Dosage activité locomotrice d&#39;étudier les rythmes circadiens et le sommeil dans les paramètres Drosophile</em

Cette vidéo décrit le système de surveillance de l’activité de la drosophile (DAM) utilisé pour suivre l’activité locomotrice. Les chercheurs utilisent les données d’activité recueillies à partir du DAM pour étudier les rythmes circadiens chez les mouches des fruits. Le clip de protocole présenté montre comment charger des mouches dans l’appareil et enregistrer des données d’activité pour des expériences circadiennes.

drosophile Activity Monitor (DAM) : une méthode pour mesurer l’activité locomotrice chez les mouches

Nous décrivons ici un test de préférence de lumière-obscurité pour Drosophila larve. Ce test fournit des informations sur la réglementation innée et circadien de photobehavior détection et le traitement de la lumière.

Essai de préférence la lumière pour étudier innée et circadien Photobehavior Réglementé<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l'alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l'alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d'autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.

La barre stabilisatrice: Administration de l&#39;alcool à mouches

Nous avons récemment identifié une nouvelle drosophile circadienne, le rythme de préférence de température (TPR), dans lequel la température préférée chez les mouches augmente pendant la journée et tombe pendant la nuit. TPR est régulé indépendamment d’une autre sortie circadienne, l’activité locomoteur. Nous décrivons ici la conception et l’analyse de TPR chez la drosophile.

Conception et analyse du comportement de préférence de température et de son rythme circadien chez la drosophile

Ce rapport décrit une méthode de mesure de l’activité larvaire de la drosophile à l’aide du moniteur d’activité de la drosophile TriKinetics. L’appareil utilise des faisceaux infrarouges pour détecter les mouvements d’un maximum de 16 animaux individuels. Les données peuvent être analysées pour représenter les paramètres de mouvement, y compris les vitesses et les positions des animaux dans les chambres d’essai.

Mesure de larves activité dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Moniteur d&#39;activité

L’effet des gènes et de l’environnement sur l’espace social de Drosophila melanogaster peut être quantifié à l’aide d’un paradigme analytique puissant mais simple. Nous montrons ici différents facteurs qui peuvent affecter cet espace social, et qui doivent donc être pris en considération lors de la conception d’expériences dans ce paradigme.

Conditions affectant espace social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

On présente une méthode pour quantifier les principales caractéristiques temporelles vus voler rythmes locomotrice circadienne. La quantification est réalisée par montage mouche activité avec une forme d’onde modèle multi paramétrique. Les paramètres du modèle décrivent la forme et la taille du matin et les sommets de la soirée de l’activité quotidienne.

Une méthode de calcul pour quantifier l’activité circadienne mouche

Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.

Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Dans cet article, nous démontrons comment disséquer le système nerveux central du troisième stade drosophile larves.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

Apprenez à synchroniser Drosophila melanogaster pour étudier les rythmes circadiens et la chronobiologie. Cette méthode utilise l'immunoblotting et l'immunofluorescence pour valider l'entraînement et explorer les effets de l'horloge biologique sur la santé.

Formation circadienne de Drosophila Melanogaster

Explorer plus de vidéos